PLoS ONE: mir-29a slopina ląstelių proliferaciją ir indukuoja ląstelės ciklo arešto per p42.3 downregulation į žmogaus Skrandžio Cancer

Anotacija

Kaip naujai nustatytas ir apibūdintas geno, p42.3 yra susijęs su ląstelių neplatinimo ir tumorogeniškumo. Iš p42.3 išraiška yra aktyvinama žmogaus skrandžio vėžiu (GC), tačiau jos pagrindinis veikimo mechanizmai nėra gerai suprantama. Mikro RNR (miRNAs) yra žinomas žaisti gyvybiškai reguliavimo vaidmenis daugelyje korinio procesus. Čia mes naudojamas bioinformatikos ir eksperimentinius metodus ištirti reguliavimo santykį miRNAs ir p42.3 geno. Mes parodėme, kad Pasaulis-29a gali slopinti p42.3 išraiška tiek mRNR ir baltymų lygiais tiesiogiai jungiasi prie jo 3'UTR srities. Be to, atvirkštinis ryšys buvo pastebėtas tarp miR-29a ir p42.3 raiškos skrandžio vėžio ląstelių linijų ir GC audinių pavyzdžių, ypač tais atvejais, kai p42.3 buvo downregulated. Kartu paėmus, mes išaiškintas anksčiau nepripažintą vaidmenį PPN-29a ir nurodė, kad Pasaulis-29a gali veikti, bent jau iš dalies, nukreipiant p42.3 geną į žmogiškąjį GC

nurodomoji dalis:. Cui Y S WY , Xing J Wang YC Wang P Chen XY, et al., (2011) MIR-29a slopina ląstelių proliferaciją ir indukuoja ląstelės ciklo arešto per p42.3 downregulation į žmogaus skrandžio vėžio. PLoS ONE 6 (10): e25872. Doi: 10,1371 /journal.pone.0025872

redaktorius: Alfons Navarro Barselonos universitetas, Ispanija

Įstojo: Vasario 28, 2011 m Priimta rugsėjo 13, 2011 m Paskelbta: Balandis 5, 2011

Visos teisės saugomos: © 2011 Cui et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė dotacijas iš Nacionalinės pagrindinių mokslinių tyrimų programą Kinijos 973 programą (2010CB5293, Nacionalinė Aukštųjų technologijų tyrimų ir technologinės plėtros programoje Kinijos (863 programa) (2006AA02A402, Nacionalinis gamtos mokslų fondas Key programa (Nr 30.830.055) ir ministerija . visuomenės sveikatos, Kinija (Nr 200.802.094) iki FJY Fundatoriai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų. autoriai pareiškė kad nėra jokių konkuruojančių interesų.

Įvadas

p42.3 yra naujas genas, kuris neseniai buvo išskirtas ir nustatytas pagal iRNR diferencinę ekrane (mRNADD) technika. pilnametražis kDNR iš P42 0,3, yra maždaug 4,0 kb, ir genas koduoja 389 amino rūgštis (aA) baltymą, kuris yra apskaičiuota, kad kurio molekulinė masė yra 42,3 kDa. Tolesni tyrimai parodė, kad jo išraiška yra ląstelės ciklo priklauso nuo skrandžio vėžys (GC) ląstelių linijas. Jos baltymo ekspresija viršūnės M fazėje ląstelės cikle, prieš palaipsniui mažėja po ląstelių dalijimosi metu; tai rodo, kad p42.3 gali būti įtraukti į ląstelės ciklo reguliavimu. Be to, triukšmo slopinimo iš p42.3 pagal sirnr (siRNR), susidaro CHK2 ląstelę ir ciklino B1 downregulation, kurie yra du pagrindiniai baltymai, dalyvaujančių ląstelių ciklo reguliavimo [1], [2]. Nors AT-PGR ir imunohistocheminius analizė parodė, kad p42.3 yra aktyvinama GC palyginti su normaliomis audinių pavyzdžių, funkcionalus tyrimai parodė, kad p42.3 išeikvojimas gali ne tik sukelti GC ląstelių proliferaciją ir "Colony formavimosi slopinimu in vitro
, bet taip pat gali gerokai sumažinti tumorogeniš- nuogas pelių [3]. Nors ankstesni tyrimai kritinį vaidmenį p42.3 geno GC patologijos, konkretūs pagrindinės mechanizmai savo veiksmų dar reikia patikslinti.

mikro RNR (miRNAs) susideda iš mažų klasės (~ 22 nukleotidų), endogeninių, ne kodavimo RNR, kurie yra žinomi vaidina svarbų reguliavimo vaidmenis genų ekspresiją [4]. Pagrindinis mirna stenograma yra vadinamas pri-mirna [5], kuris yra transkribuoja RNR polimerazės II arba III [6], [7]. Pri-Mirna tada skaldyti į Drosha-DGCR8 mikroprocesoriaus komplekso gaminti pirmtakas segtukas molekulę (iš anksto Mirna), kuris po to eksportuojami iš branduolio į citoplazmą pagal exportin-5 /Ran-GTP. Su kompleksas, kuriame yra RNaze Kauliukų žaidimai ir dvigubos RNR sujungiančio baltymo, TRBP pagalbą, ~70-nukleotidų anksto Mirna perdirbamas į brandaus Mirna [8]. Funkcinė kryptis brandus Mirna yra pakrauta į RNR sukeltas slopinimo kompleksas (RISC), kuriame yra baltymų, argonaute (prieš) ir Tnrc6, o kita kryptis yra paprastai nevisavertis [9]. Brandus Mirna vadovus RISC į netobulų papildomų sekų tikslinių mRNR į slopinant giminingą iRNR vertimą, skatinti stenogramą ėduonis arba abu [10]. Manoma, kad dauguma kodavimo genai tikriausiai reguliuoja miRNAs ir kartu būtų Mirna gali reguliuoti daugiau kaip vienas tikslas genus, tam tikri genai gali būti reguliuojamas keliais miRNAs [11].

Augantis duomenys rodo, kad miRNAs dalyvauja platų fiziologinių ir patologinių procesų, įskaitant plėtros, diferenciacijos, platinimo ir apoptozės [12.13,14,15]. Nors anomalijas Mirna išraiška buvo nustatytas daugelyje žmogaus navikų, įskaitant gaubtinės ir tiesiosios žarnos, skrandžio ir krūties vėžio [16], [17], tokių navikų skaičius vis dar plečiasi. Tačiau išsamios funkcijos Mirna navikuose dar reikia išsiaiškinti.

Neseniai atlikti tyrimai parodė, kad Pasaulis-29 yra sudėtingas funkcijas įvairių ligų. MIR-29a gali elgtis kaip naviko slopintuvas abiejose plaučių ir kasos vėžio ląstelių linijų, ir todėl egzogeninė raiškos miR-29a rezultatų žymiai sumažinti invazinių potencialą ir platinimu šių ląstelių linijų [18]. Navikas slopintuvas vaidmuo miR-29a taip pat remia savo stebimas downregulation į plataus spektro solidinių navikų, įskaitant neuroblastoma, sarkomą ir smegenų auglių [19]. Priešingai, PPN-29a yra aktyvinama per tingios žmogaus lėtinė limfoleukemija (B-LLL) [20] ir ūminės mieloleukemijos (ŪML) [21], o tai rodo galimą naviko promotoriaus vaidmenį. Be to, nukrypęs nuo normos, išraiška miR-29a galima rasti daugelyje nepiktybinių ligų, įskaitant kepenų fibrozės [22], diabeto [23] ir Alzheimerio ligos [24]. Nors daugelis genų jau patvirtino, kad tiesioginiai tikslai PPN-29a, pavyzdžiui, PPM1D [25], PI3K [26] ir neuronų navigator 3 [24], jie sudaro labai mažą dalį visų genų, kurie Pasaulis-29a tikslai.

šioje ataskaitoje, mes įrodyti, kad p42.3 išraiška buvo kontroliuojama ne tiek mRNR ir baltymų kiekių, kuriuos miR-29a tiesioginio tikslingesnio iš p42.3 3'UTR srities. MiR-29a galėtų slopinti ląstelių proliferaciją ir sukelti ląstelės ciklo suimti, bent jau iš dalies, per iš p42.3 išraiškos downregulation. Be to, mes nustatėme, kad p42.3 baltymo ekspresija buvo atvirkščiai koreliuoja su Pasaulis-29a išraiška žmogaus GC audiniuose.

Rezultatai

p42.3-3'UTR yra putatively taikiniu miR išanalizuoti -29a

spėjamas miRNAs kad buvo prognozuojama nukreipti p42.3 geną daugiau nei vienoje duomenų bazėje. Du geriausi miRNAs kurios buvo prognozuojama tris kartus buvo atrinkti tolesniam patvirtinimo ir kitų trijų miRNAs, įskaitant miR-29a, kurio spėjamas jungimosi vietų buvo panašūs į viršų du taip pat buvo atrinkti kandidatais įteisinimui. MIR-29a buvo prognozuojama pagal TargetScan ir miRGEN duomenų bazių, o tai reiškia, kad jos spėjamas privalomas svetainė buvo 213-219 iš p42.3-3'UTR (1a paveikslas) pozicijas. Kitų kandidatų nėra išvardyti čia.

Tiesiogiai orientacija p42.3-3'UTR iki Pasaulis-29a

reporteris genų tyrimas dirbo patvirtinti ar p42.3 buvo tiesioginė tikslinė miR-29a. Laukinio tipo ir mutantas p42.3-3'UTR, kurio sudėtyje yra tariamų prijungimo vietą miR-29a buvo klonuotas į atskirus plazmidžių ir kondensuotas su reporterio geno. Fluorescencinės intensyvumas reporterio geno buvo gerokai sumažėjo grupėje, kuri buvo bendrai transfekuota WTpcDNA3 /EGFP /p42.3 ir pcDNA3.1 /Pri-miR-29a, palyginti su kontrole. Be to, nebuvo reikšmingas mažėjimas fluorescencinio intensyvumo grupėje, kuri buvo bendrai perkeltų su MUTpcDNA3 /EGFP /p42.3 (1B pav), toliau, patvirtinantis, kad Pasaulis-29a sukeltas į p42.3 genų ekspresijos downregulation Via specifiškai jungiasi spėjamą svetainėje p42.3-3'UTR.

išraiška miR-29a ir p42.3 yra atvirkščiai susijęs GC ląstelių linijų

Jei išsiaiškinti ryšį tarp P42 nuorodą 0,3 ir Pasaulis-29a, mes studijavo endogeninio išraišką PPN-29a ir p42.3 šešiose žmogaus GC ląstelių linijas (SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MSV-803, SNU-1 ir AGS) ir vienas normalus skrandžio epitelio ląstelių linija (GES-1; pav 2A-C). Mes nustatėme, kad p42.3 mRNR lygis buvo gerokai didesnis nei įprasta kontrolės visose GC ląstelių linijų su SGC-7901, išskyrus, kai skirtumas nebuvo statistiškai reikšmingas. Sąvoka lygis p42.3 buvo kintamasis tuo baltymų lygį, tačiau buvo gerokai didesnis visus GC ląstelių linijų, palyginti su GES-1.We taip pat parodė, kad Pasaulis-29a išraiška buvo maža keturių GC ląstelių linijas ( SGC-7901, MKN-45, MSV-803 ir MAA), kuris atskleidė, atvirkštinis ryšys su p42.3 išraiška. Nors miR-29a išraiška buvo didelis SNU-1, tai nebuvo statistiškai reikšmingas. Verta paminėti, kad aukštos raiškos miR-29a į MKN-28 buvo išimtis.

MIR-29a reguliuoja p42.3 išraišką

Jei įvertinti, ar p42.3 buvo represuoti iki miR -29a, mes apdorojimo MKN-45 ląstelių su imituoja bei inhibitorių miR-29a 48 h, siekiant išoriškai perduodami ir downregulate miR-29a konkrečiai išraiška; Po to buvo nustatytas iš p42.3 išraiška. Po to, kai MKN-45 ląstelių su imituoja transfekciją, Mir-29a išraiška padidėjo maždaug 10 kartų, o gydymas su inhibitoriai ir miR-29A lygį sumažėjo daugiau nei 50% (pav 3A-B). Tai rodo, kad abu imituoja ir inhibitoriai PPN-29a dirbo efektyviai mūsų eksperimentams. Padidėjusi miR-29a galėtų gerokai slopinant p42.3 išraišką tiek mRNR ir baltymų lygį, kuris buvo panašus efektas į p42.3 nuslopinami pagal p42.3 siRNA (SI-p42.3). Mes taip pat nustatėme, kad CHK2 buvo aktyvinama ir cyclinB1 buvo downregulated po p42.3 nuslopinami pagal p42.3 siRNA. Įdomu tai, kad panašūs reiškiniai buvo daromas ant CHK2 ir cyclinB1 pagal PPN-29a raiškos į MKN-45 ląstelių (pav 3C-D). Be to, transfekcija miR-29a inhibitorių dramatiškai sumažėjo CHK2 išraišką ir padidėjo p42.3 ir cyclinB1 išraišką (pav 3E-F). Tai rodo, kad Mir-29a galėtų reguliuoti p42.3 geno raišką MKN-45 ląstelių.

MIR-29a slopina ląstelių proliferaciją in vitro

Pasak ląstelių proliferacijos duomenų tyrimas, mes atkreipė dengimas kreives ties 450 nm bangos ilgiui, kai transfekciją skirtingų trukmė. Mes nustatėme, kad ląstelių proliferacija buvo žymiai slopinamas po to, kai MKN-45 ląstelių transfekciją su p42.3 siRNA 48 h ir 72 h, ir panašus modelis buvo pastebėtas po ląstelės buvo transfekuota su imituoja miR-29a. Tačiau represijos pasiektą miR-29a imituoja laipsnis buvo didesnis nei p42.3 siRNA sukeltas downregulation (4a paveikslas). Priešingai, ląstelių augimas buvo skatinamas maždaug 10%, lyginant su neigiamu kontroliniu mėginiu, kai transfekuota su inhibitoriais, miR-29a 48 h, bet ten buvo po 72 h (4b pav) mažėjimas. Tai rodo, kad Pasaulis-29a gali slopinti ląstelių proliferaciją per represuoti į p42.3 išraiška.

MIR-29a blokai ląstelės ciklo progresavimo

Triukšmo slopinimo ir p42.3 iki p42.3 siRNA gali sukelti ląstelių ciklo arešto; Todėl, mes ištirti, ar Pasaulis-29a galėtų paveikti ląstelinį ciklą per orientacija p42.3 geną. Po MKN-45 ląstelių buvo pernešta su p42.3 siRNA 48 h, mes nustatėme, kad ląstelės ciklo buvo blokuota G1 fazės (75.93% P
< 0,05), lyginant su neigiamos kontrolės ( 66.18%). Mes nustatėme, kad imituoja PPN-29a taip pat gali sukelti G1 fazės arešto MKN-45 ląstelių, gydomi 48 h (75.56% P
< 0,05; 5 pav).

Expression miR-29a ir p42.3 baltymų GC ir jų koreliacija su klinikos charakteristikos

Naudojant kiekybinę realaus laiko PGR metodu, PPN-29a buvo aptikta 60 porų GC audinių ir jų atitiko ne vėžys greta audiniai, o p42.3 baltymų lygis taip pat buvo įvertintas šių audinių imunoblotingo metodu. Iš 60 GC audinių pavyzdžių, p42.3 išraiška buvo didelis 35 atvejais (35/60, 58,33%), palyginti su jų suderintų ne vėžio gretimuose audiniuose. Per 25 atvejus, kai buvo downregulated p42.3 išraiška, PPN-29a išraiška buvo didelis 21 atvejais. MIR-29a išraiška buvo mažas 27 atvejais (27/60, 45%). Aukščiau duomenys rodo, atvirkštinis ryšys tarp miR-29a ir p42.3 baltymų ekspresija audinių mėginių ( P
= 0,000, 1 lentelė ir 6 pav), tačiau koreliacijos koeficientas nėra gera (r = -0.316 ).

Be to, PPN-29a ir p42.3 baltymo ekspresija buvo įvertintas atsižvelgiant į klinikos ypatybių 60 pacientų, iš kurių buvo paimti audinio mėginiai. Mūsų išvados rodo, kad nebuvo jokių akivaizdžių sąsajų tarp p42.3 baltymų ir Pasaulis-29a išraiškos, atitinkamai klinikos ypatybių (2 lentelė).

Diskusijos

p42.3 genas yra labai išsaugota ir žinduolių, kaip onkogeno, ji gali atlikti svarbų vaidmenį laipsniško transformacijos įprastomis skrandžio epitelio ląstelių į vėžio ląsteles. Jo skirtumas išraiška per ląstelės ciklo etapus paaiškėja, kad p42.3 gali būti įtraukti į ląstelės ciklo reguliavimu. Tai dar kartą patvirtino mūsų rezultatus, kurie parodė, kad p42.3 triukšmo slopinimo gali pakeisti dviejų pagrindinių baltymų, CHK2 ir ciklino B1, kurie yra susiję su ląstelių ciklo reguliavimo išraiška. Naudojant netekus funkcijos eksperimentus, mes parodė, kad p42.3 gali skatinti ląstelių proliferaciją ir kaip pranešta, mūsų rezultatai parodė, kad p42.3 buvo ekspresija GC audinių, palyginti su gretimų ne vėžio gleivinės [3]. Tačiau molekulinius mechanizmus, atsiradę šiame nukrypusiu nuo normos išraiškos p42.3 geno GC menkai supranta, kaip akivaizdu iš turimos literatūros trūkumo. MiRNAs gali reguliuoti genų ekspresiją nukreipiant privalomų svetainių tikslinėms mRNR [27], ir žmogaus vėžio, daugelis miRNAs jau buvo susijęs. Tačiau tik nedaugelis funkcija buvo suprantama iki šiol, ypač GC [28].

Šios ataskaitos, mes išrinkome MIR-29a tolesniam tyrimui pagal reporteris genų sistemą ir galiausiai nustatė, kad P42. 3 buvo tiesioginis tikslinio geno miR-29a. Mūsų duomenys rodo, kad keturios duomenų bazės (TargetScan, microRNA.org, mikrovisata tikslai 5 versija ir miRGen) naudojamas buvo efektyvus, bet nėra tobula, įrankiai už Mirna tikslus prognozavimas ir jei eksperimentinę įrodymų patobulinimų pagrindinės algoritmas.

parodė, kad p42.3 išraiška buvo atvirkščiai susijęs su Pasaulis-29a išraiškos keturių GC ląstelių linijų. Trijose iš jų MKN-45, MSV-803 ir AGS, tai buvo akivaizdu tiek mRNR ir baltymų lygį, tačiau tai buvo ne į SGC-7901 ląstelių linijos atveju. Be to, PPN-29a išraiška nebuvo žemas MKN-28 ir SNU-1 ląstelių linijų. Kartu šie stebėjimai leido mums iškėlė hipotezę, kad reguliavimo vaidmuo miR-29a yra sudėtingas GC ląstelių linijų ir kad miR-29a gali vaidinti skirtingus vaidmenis skirtingose ​​korinio fonas. Tačiau išsamios mechanizmai PPN-29a funkcijų GC ląstelių linijų reikalauja tolesnio tyrimo.

Mūsų tyrimo, PPN-29a raiška gali sukelti panašų poveikį tiems pasiektas p42.3 nuslopinami pagal p42.3 siRNR. Abu p42.3 mRNR ir baltymų buvo downregulated po ląstelės buvo pernešta su p42.3 siRNA arba Pasaulis-29a imituoja ir ląstelių proliferaciją ir ląstelės ciklo buvo slopinamas, kai ląstelės buvo atlikta tą pačią trukdžių. Jis pasiūlė, kad Pasaulis-29a, gali būti įtraukti į GC patogenezės per iš p42.3 genų ekspresijos represijų. Tačiau, mes nustatėme, iš augimo kreivių, kad represijų laipsnis iki Pasaulis-29a imituoja buvo didesnis nei p42.3 siRNA. Mūsų nuomone, pagrindinė priežastis, už tai gali būti, kad tam tikri miRNAs gali reguliuoti šimtus genų kontroliuoti ląstelių funkciją. Šiame tyrime, miR-29a gali slopinti ląstelių proliferaciją, bent jau iš dalies, nukreipiant p42.3.

Mūsų duomenys rodo, kad nors aukštos raiškos miR-29a norma buvo 55% (33 /60) GC, p42.3 išraiška buvo maža 21 iš šių atvejų. Tai rodo, kad Pasaulis-29a gali turėti svarbų vaidmenį GC audinių su ekspresija maža lygių p42.3.

Šiame tyrime mes patvirtinti, kad p42.3 yra tiesioginis taikinys miR-29a. Mes taip pat parodė, kad miR-29a gali slopinti ląstelių proliferaciją ir blokuoti ląstelės ciklą, bent jau iš dalies, per iš p42.3 išraiškos represijos GC. Galime daryti išvadą, kad Pasaulis-29a gali vaidinti svarbų vaidmenį reguliuojant p42.3 išraišką GC. Įdomu mes nustatėme, kad p42.3 genas taip pat gali reguliuoti PPN-29a išraišką (duomenys nėra rodomi čia), tačiau pagrindinis reguliavimo mechanizmas bus ištirta ateityje.

Medžiagos ir metodai

Bioinformatikos

Keturi Efektyviausi skaičiavimo metodai, kurie naudoja skirtingas įvertinant sistemas [29] - [32] buvo naudojami reguliavimo miRNAs kad nukreiptos p42.3 geną, įskaitant TargetScan (http prognozavimas: //www.targetscan.org/), microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do/), mikrovisata tikslai 5 versija (http://www.ebi.ac.uk/enright-srv~~HEAD=dobj /mikrovisata /htdocs /tikslai /v5 /) ir miRGen (http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Targets.cgi#Results). Tikslai buvo atrinkti papildomai patvirtinti nuo miRNAs, kad buvo bendra su rezultatais iš daugiau nei vieną paieškos grupę.

Audinių mėginiai

Šešiasdešimt poros histopathologically patvirtino GC ir gretimos ne vėžio audinio mėginiai buvo paimti iš pacientų, kuriems buvo atlikta chirurginė rezekcija tuo Renji ligoninės filialu Šanchajaus Jiaotong universiteto medicinos mokyklos, Kinija nuo 2007 liepos iki 2009 metų sausio suderintos ne vėžio gretimų audinių buvo gauti bent 5 cm nuo naviko svetainėje. Tyrimas buvo patvirtinta mokslinių tyrimų etikos komiteto Šanchajaus Jiaotong universiteto sutikimas buvo gautas iš visų pacientų, o rašytinis sutikimas buvo gautas iš kiekvieno paciento.

Mobilaus ryšio linijų ir auginimo sąlygos

Žmogaus GC Mobilaus ryšio linijos, SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MSV-803, SNU-1 ir "AGS, ir GES-1 įprastas skrandžio epitelio ląstelių linija, kuri buvo nupirkta iš ATCC (JAV), buvo prižiūrimi RPMI 1640 terpė (Gibco, Gaithersburg, MD, JAV), papildytoje su 10% vaisiaus galvijų serumo (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Ląstelės buvo auginamos 37 ° C temperatūroje, 5% CO _{2 inkubatorių. Iš tripsino (0,25%) tirpalas buvo naudojamas atskirti ląsteles nuo kultūros kolbą.}

Vektorius statybos

Jei statyti ekspresijos vektorius pri-Pasaulis-29a pirmą kartą buvo papildyta su gruntais, kurie pagal gruntas "Premier 5,0 programinė įranga (3 lentelė), o tada klonuoti į pcDNA3.1 (Invitrogen). Gaminti plazmidžių, kad įrašytų į spėjamą prijungimo vietą PPN-29a, tiek laukinio tipo ir mutantas sekos iš 111 pozicijos iki 380 iš p42.3-3'UTR buvo chemiškai susintetinti (1A pav), o tada buvo klonuotas į pasroviui iš EGFP geno adresu Bam
HI ir Eko
RI svetainių pcDNA3 /EGFP vektoriaus (Saierbio, Tianjin, Kinija).

Žurnalistė genų tyrimas

MKN-45 ląstelių buvo pasėjamos trimis egzemplioriais duobutes 24 šulinėlių plokštelės dieną prieš transfekciją. PcDNA3.1 (+) /pirminės Pasaulis-29a buvo bendrai perkeltų su laukinio tipo ir Mut-pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR atitinkamai. Tada 0,5 mikrogramų pcDNA3.1 (+) /pirminės miR-29a ir 0,5 mikrogramų pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR buvo pridėta į kiekvieną iš šulinių, o 0,1 mkg vektoriumi pDsRed-C1 (Klontex ), kuriame išreikšta RFP, buvo įtraukta į kiekvieną šulinėlį kaip endogeninio nuoroda. Ląstelės, kurios buvo Transfekuoti tik pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR arba pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR + pcDNA3.1 (+), buvo naudojami kaip kontrolės. Ląstelės buvo surinkta 48 h po transfekciją ir analizuojami remiantis EGFP ir RFP fluorescencijos intensyvumo aptikta naudojant fluorescencijos spektrometras, F-4500 ( "Hitachi", Japonija).

Mobilusis transfekcija

transfekciją MKN-45 ląstelės buvo atlikta naudojant Lipofectamine 2000 reagento (Invitrogen) po gamintojo protokolu. MKN-45 ląstelės buvo pasėjamos į 6-duobučių lėkštelėse arba 96-duobučių lėkštelėse, esant 30% santakoje dieną prieš transfekciją. Imituoja (100 cm, GenePharma) ir inhibitoriai (200 cm, RIBOBIO) miR-29a buvo naudojamas išoriškai aukštyn ir downregulate į PPN-29a išraiška. Norėdami nutildyti p42.3 genų ekspresiją, kad MKN-45 ląstelių buvo pernešta su siRNA prieš p42.3 (SI-p42.3, 100 Nm, GenePharma). Valdymo RNR (pavadintas kaip NC) buvo ne-homologinis bet žmogaus genomo seka. Iš oligo nukleotidų sekos yra parodyta 4 lentelėje

Realaus laiko PGR

Viso RNR buvo išskirta naudojant Trizol reagento (Invitrogen), o vėliau buvo gydomi RNazės-nemokamai DNaze aš ( "Fermentas", San Diegas, CA, JAV). Iš viso RNR (500 ng) buvo atvirkštinis transkripcija naudojant PrimeScript RT reagento komplektas (TAKARA, Dalian, Japonija). Grunto sekas, siekiant papildyti p42.3 ir GAPDH yra parodyta 3 lentelėje Išanalizuoti brandus miR-29a išraišką, 2 mikrogramų visos RNR buvo atliktas atvirkštinę transkripciją naudojant All-in-One Mirna Q-PGR aptikimo komplektas (GeneCopoeia, Guangdžou, Kinija). Kiekybinis realaus laiko PGR brandžiai miR-29a ir U6 buvo atliekamas pagal gamintojo nurodymus naudojant ABI 7300 realiojo laiko PGR sistema ir konkrečių gruntams, kurie pagal GeneCopoeia, Kinija. Santykinis išraiška p42.3 ir miR-29a buvo standartizuoti endogeninio nuoroda (GAPDH ir U6 mažas branduolinis RNR atitinkamai) ir, palyginti su kontrole. Rezultatai buvo pateikti kaip kartų kaita, apskaičiuotas naudojant 2 (-ΔΔCT) metodą [33]; santykinis išraiška santykis < 1,0 buvo laikomas žemu, o iš >santykis; 1,0 buvo laikomas aukštos išraiška [14]

imunoblotingu

Viso baltymų išaugintų ląstelių ir audinių. buvo išgauti Ripa lizės buferiniame tirpale, kuriame yra PMSF, pagal gamintojo nurodymus (Beyotime, Šanchajus, Kinija). Baltymų koncentracija buvo matuojama naudojant Bradfordo metodas [34]. Apskritai, 40 mikrogramų baltymo buvo atliekama elektroforezė per 10% SDS poliakrilamido gelyje ir tada buvo perkeltas į PVDF membrana (Millipore). Membrana buvo inkubuojami su p42.3 antikūnas (1:500, Abmart, Kinija), CHK2 antikūnų (1:1,000 CST), cyclinB1 antikūnas (1:1,000, CST) arba GAPDH (1:5,000, Kanas Chen, Kinija) esant 4 ° C temperatūroje per naktį. Antriniai antikūnai buvo paženklinti HRP (Kang Chen, Kinija) ir signalai buvo aptikti naudojant ECL rinkinį (Pierce Biotech "., Rockford, IL, JAV). Vėliau nuotraukos buvo analizuojami ImageJ 1,43 programinės įrangos. Baltymų išraiška buvo normalizuojamas endogeninio nuoroda (GAPDH) ir, lyginant su kontroliniu. Santykinis išraiška santykis < 1,0 buvo laikomas mažos raiškos, o iš >santykis; 1,0 buvo laikomas aukštos išraiška [14]

ląstelių proliferacija tyrimas

nuimtų MKN-45 ląstelių. (maždaug 5 x 10 ^{4 ląstelės), buvo pasėjamos į 96 duobučių kultūros plokščių. Ląstelių proliferacija buvo matuojamas po 24 h, 48 h ir 72 h po transfekciją, atitinkamai, naudojant Mobilusis Skaičiavimo KIT-8 (DOJINDO, Japonija) pagal gamintojo protokolą. Absorbcija esant 450 nm bangos ilgio, kuris rodo teigiamą ryšį su ląstelių proliferacija pajėgumas buvo nustatytas spektrofotometru (E-LIZA MAT-3000).}

Mobilusis ciklas tyrimas

keturiasdešimt -eight valandos po to, kai transfekciją, ląstelės buvo pakeltas naudojant 0,25% tripsino ir išplautos DPBS (Gibco); tada tai buvo nurodyta 70% etanolio -20 ° C temperatūroje 24 val. Vandens srauto citometrijos analize (epics XL "Beckman Coulter), ląstelės buvo inkubuojami RNaze (Fermentas), esant 37 ° C temperatūroje 30 min, gydomi PI (Sigma) ir suspenduotos 300 pL DPBS.

statistinę analizę

"duomenys rodomi kaip vidurkis ± SD bent iš trijų atskirų eksperimentų. Reikšmė buvo analizuojami su Stjudento t-testą ir ne parametrinių testai (Mann-Whitney U testas ir Kruskal-Wallis H testas). Statistinis reikšmingumas koreliacija tarp PPN-29a ir p42.3 baltymo ekspresija buvo skaičiuojamas pagal chi-square testą ir Spearman koreliacijos rangas. Statistinė analizė atlikta naudojant SPSS 13.0 programinę įrangą (IBM, JAV) ir buvo laikomi statistiškai reikšmingas P pervežimas <skirtumus; 0,05.

• PLoS ONE: praradimas promielocitine leukoze Baltymai skrandžio vėžiu: Pasekmės IP 10 išraiška ir naviko infiltruojanti limfocitų
• PLoS ONE: prognostinis reikšmė miR-181b ir miR-21 skrandžio vėžiu sergantiems pacientams, gydomiems S-1 /oksaliplatina arba oksaliplatinos Doxifluridine /