PLoS ONE: Affinity subrendimas monokloninis antikūnas 1E11 tikslinėmis tikimybių į CDR3 Regionų Optimizuoja Terapinis antikūnas Taikymo HER2 teigiamas skrandžio vėžio

Anotacija

anti-HER2 pelės monokloniniai antikūnai, 1E11 turi stiprią ir sinergetinį Priešnavikinio veiklą HER2 ekspresija skrandžio vėžio ląsteles, kai vartojamas kartu su trastuzumabu. Mes dabar optimizuotas šį antikūnų žmogaus terapijos. Pirma, komplementarumą sąlygojančias sritis (CDRs) pelių antikūno buvo įskiepyta ant žmogaus gonocitų linijos imunoglobulino kintamos srities genq. Nr giminystės ir biologinio aktyvumo skirtumas buvo pastebėtas tarp chimeriniam 1E11 (ch1E11) ir žmogiškas 1E11 (hz1E11). Kitą, giminingumas brandinimas hz1E11 buvo atlikta iki CDR-L3 ir H3 likučių, po to griežtai biopanning atrankos Randomizacijos. Švelnesnis pasirinkimas slėgio palankumo įvairesnių klonų atranką, o didesnis pasirinkimas griežtumas lėmė iš panning išėjimo į mažesnio skaičiaus klonų su patobulinta giminystės konvergencijos. Klonas 1A12 turėjo keturis aminorūgščių CDR-L3, ir parodė 10 kartų padidinti giminystės, palyginti su tėvų klonas ir padidėjo potenciją nurodytame in vitro
antiproliferacinis aktyvumo tyrimas su HER2 overepxressing skrandžio vėžio ląstelės. Klonas 1A12 slopina naviko augimą NVI-N87 ksenografiniuose modelį su panašios veiksmingumo su vien trastuzumabu ir kombinuoto gydymo 1A12 ir trastuzumabu visiškai pašalintas nustatytų auglių. Šie rezultatai rodo, kad žmogiškas ir giminystės subrendo monokloninis antikūnas 1A12 yra labai optimizuotas molekulė ateities terapinės plėtros prieš HER2 teigiamas navikų

nurodomoji dalis:. Ko BK, Choi S Cui LG, "Lee YH, Hwang IS Kim kT, ir kt. (2015) Affinity subrendimas monokloninis antikūnas 1E11 tikslinėmis tikimybių į CDR3 Regionų Optimizuoja Terapinis antikūnas nukreipimas į HER2 teigiamas skrandžio vėžio. PLoS ONE 10 (7): e0134600. Doi: 10,1371 /journal.pone.0134600

redaktorius: Mitchell Ho Nacionalinio vėžio instituto, Nacionalinio sveikatos instituto JUNGTINĖS AMERIKOS VALSTIJOS

Įstojo: balandžio 14, 2015; Priimta 12 Liepos 2015 metų; Paskelbta 30 Liepos 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 Ko et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

finansavimas:. Šis tyrimas parėmė AbClon Inc., ir nacionalinės mokslinių tyrimų fondo Korėjos (NRF) suteikti HS vaistinis Bioconvergence tyrimų centro (NRP-2013M3A6A4044991) , Komercinės finansuotojas (AbClon Inc) numatyta parama atlyginimų forma autoriams (BKK, SC, LGC, YHL, ish, KTK, ir JSL), tačiau neturėjo jokių papildomų vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimą skelbti, ar preparatas rankraščio. Konkretūs vaidmenys šių autorių yra aiškiai nurodyta "Autorius įmokos" skyriuje

konkuruojančių interesų. BKK, SC, LGC, YHL, ish, KTK, ir JSL visi dirba AbClon Inc. gali turėti ITS akcijų. SS yra mokamas konsultavimo į AbClon Inc., taip pat turi savo atsargų. Abclon siekia patentus ir produkto plėtrą junginių, kurie yra paminėti šiame dokumente. BKK, AB, LGC, YHL ISH, KTK, ir JSL yra visų šiuo metu dirba komercinį rėmėjui šio tyrimo AbClon Inc. gali turėti savo atsargų. HS metu mokama KONSULTACIJA į AbClon Inc., taip pat turi savo atsargų. AbClon turi registruotą patentą Korėjoje (KR10-1453462 antikūnai, galinti prisijungti Tiksliau prie HER2) ir padavė PCT paraišką (PCT /KR2014 /004317 antikūnų specifiškai jungiasi prie HER2), kurioje BKK, YHL ISH, KTK, ir JSL yra išvardytos, kaip išradėjai. AbClon taip pat siekia produkto plėtrą humanizuotu, giminingumo-subrendo antikūnų, kurie paminėti šiame dokumente. Tai nekeičia autorių laikomasi visų PLoS ONE politiką dėl dalijimosi duomenimis ir medžiagų.

Įvadas

monokloniniai antikūnai yra pagrindinės procedūros onkologijoje ir autoimuninių ligų, ir tikimasi, kad vaidina svarbų vaidmenį pagal ligos gydymo ateityje [1, 2]. Daugiau nei 30 rekombinantiniai antikūnai šiuo metu yra patvirtintos Jungtinių Valstijų maisto ir vaistų administracija, iš kurių maždaug pusė yra priešvėžinių antikūnai. Skrandžio vėžys yra vienas iš labiausiai paplitusių vėžio ir yra trečioji pagrindinė priežastis, dėl vėžio mirties visame pasaulyje [3]. Skrandžio vėžio, raiškos iš epidermio augimo faktoriaus receptorių (EGFR), žmogaus epidermio augimo faktoriaus receptoriaus 2 (HER2), ir HER3 koreliuoja su blogos prognozės [4, 5]. Neseniai HER2 orientacija monokloninių antikūnų trastuzumabu buvo patvirtinta gydant HER2 teigiamą metastazavusiu skrandžio ir gastroezofaginio sankryžos vėžio remiantis rezultatais ir trastuzumabo su chemoterapija HER2 teigiamas išplitusiu skrandžio vėžiu (Toga) klinikinio tyrimo [6].

Konkretūs deriniai abipusiai nekonkuravimo antikūnų skirtos tą patį receptorių padidinti kovos su naviko veiklą in vitro, parsisiųsti ir vivo
. Kombinuotas HER2 orientacijos antikūnus, trastuzumabu ir pertuzumabas, rodo padidėjusį veiksmingumą HER2 ekspresija krūties vėžio [7]. Į pertuzumabas ir trastuzumabo derinio nauda buvo labiau parodė Ikiklinikinių ir klinikinių tyrimų [8, 9]. Kitos HER2 nukreipimą antikūnai, rodantys geriau derinio veiksmingumas ne kaip pavienių agentų, ir parodė, nuosekliai žemyn reguliavimo HER2 lygį ir naudingų derinio poveikis pelių modelius [10]. Padidėjęs efektyvumas pagal antikūnų deriniai taip pat buvo įrodytas su EGFR nukreipimą antikūnų [11, 12] ir kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus receptorius 3 (KEAFR 3) -targeting antikūnų [13].

Terapinės antikūnai paprastai yra plačiai inžinerijos turėti pageidaujamas biologinių ir fizikinių ir cheminių savybių, tokių kaip mažo imunogeniškumo, didelio afiniteto ir specifiškumo, optimalių efektorines funkcijas, ir gera, tirpumas ir stabilumas [14]. Ypač, antikūnų humanizavimas ir giminystės brendimas yra du dažniausiai taikomų inžinerinių procesų metu Terapinis antikūnas kandidatų plėtrai. Imunogeniškumas Terapinis antikūnas riboja klinikinį naudingumą ir veiksmingumą pagal gamybos kovos su narkotikais antikūnų [15], ir antikūnus iš pelės ar kitų rūšių humanizavimas dabar standartinė procedūra už terapines antikūnų susidarymą. Keletas Humanizavimo metodai buvo sukurtas, kad įdarbinti arba racionalius ar empirinius metodus [16]. Papildomumo nustatantys regionas (REC) persodinimas požiūrį kaip būdas įveikti žmogaus anti-chimeriniq antikūnų (ŽACA) atsakymą [17] yra nusistovėjęs humanizavimo būdas. Tačiau tiesioginis skiepyti pelių CDR ant žmogaus pagrindų akceptinis seka dažnai sąlygoja netenka afiniteto, todėl galines mutacijos sistema regionas likučių (Vernier zona likučiai) remti CDR struktūra kilpos dažnai yra būtina [18]. Dėl in vitro
giminingumas brendimas, trys diversifikacijos metodai paprastai naudojami: Random mutagenezE pagal pvz klaidų tikimybė PGR, tikimybių tikslinių likučių naudojant ISsigimusiq oligonukleotidai ir grandinės shuffling. Į tikslinę tikimybių metodą, CDR yra logiška taikinys daugeliu atvejų tikimybių, nes somatinių hypermutation vystėsi pirmenybę mutacijas CDR antikūnų [19], ir CDR-H3 ir CDR-L3 linkę dominuoti antikūnų antigenų sąveikos [ ,,,0],20]. Vienas iš pagrindinių problemų, susijusių su tikslinės Randomizacijos yra pasirinkti pozicijas, kurios nėra būtina, kad antigenų jungimosi, bet kuris gali padidinti giminingumą, kai yra pagamintas optimalus pakeisti amino rūgšties. Alanino skenavimas gali padėti nustatyti likučių lošimai, ypač kai CDR yra ilgas. Kartais pati alanino mutacijos padidina antikūnų trauka [21].

anksčiau sukūrė pelės antikūno taikymo HER2 (klonas 1E11), kuris rodo sinergetinį priešvėžinėmis kartu trastuzumabu į HER2 skrandžio vėžio ląstelių linijų [22 ]. Šioje ataskaitoje, mes aprašome kaip mes optimizavo 1E11 už Terapinis antikūnas pagal CDR persodinimas į žmogaus gonocitų linijos imunoglobulino kintamos genų ir giminingumo brendimo, tikslingai tikimybių CDR-H3 ir CDR-L3. Optimizuota 1E11 antikūnas (klonas 1A12) rodo sinergetinį priešvėžiniai aktyvumą HER2 teigiamas skrandžio vėžio ksenotransplantavimo modelių kartu su trastuzumabu. Buvo pastebėta, kad už klonas 1E11, žmogaus germinacinės kintamos genai yra tinkami akceptorių humanizavimui be afininės mažinimo, ir CDR-L3 likučių pakeisti, kad yra ne būtina antigenų jungimosi buvo pakankamai, siekiant pagerinti daugiau nei 10 kartų giminingumą.

medžiagos ir metodai

Mobilaus ryšio linijos ir medžiagos

NVI-N87 ląstelės buvo įsigytos iš Amerikos tipas kultūros kolekcijos (ATCC, Manassas, VA, JAV) ir OE-19 ląstelių buvo gauti iš Europos rinkimas ląstelių kultūros (ECACC, Porton žemyn, JK). Ląstelių kultūros terpė buvo RPMI-1640 papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS), ir antibiotikų ir ląstelės buvo auginamos 37 ° C temperatūroje, esant 5% CO _{2. Trastuzumabu ir palivizumabo buvo pagamintas Genentech (Pietų San Francisko, CA, JAV) ir MedImmune, LLC (Gaithersburg, MD, JAV), atitinkamai. ChromPure žmogaus IgG (Jacksonas ImmunoResearch, Vakarų Grove, Pensilvanija, JAV) buvo naudojama kaip žmogaus IgG antikūnų kontrolinės už in vitro
tyrimus. IgG antikūnai gaminami naudojant Freestyle 293 sistema (Invitrogen, Karlovi Varai, CA, JAV) ir išgrynintas naudojant baltymų-A giminingumo chromatografijos (GE Healthcare, Piscataway, NJ, JAV). Endotoksiną buvo pašalintas su endotoksiną valymo komplektas (GenScript, Piscataway, NJ, JAV) ir endotoksiną koncentracija buvo nustatoma naudojant endotoksiną aptikimo rinkinį (GenScript). Rekombinantinių baltymų buvo gaminamas kaip išskiriami baltymai naudojančių Freestyle 293 sistemą ir išgrynintas naudojant baltymų-A arba Ni-NTA chromatografiją (Qiagen, Valensija, Kalifornija, JAV), FC-pažymėtoji arba jo-pažymėtų baltymų, atitinkamai.}

alanino skenavimo mutageninis ir Fab valymo

Svetainės nukreiptas mutageninis už alanino nuskaitymo atliko PGR mutagenezes naudojant QuickChange sait-mutagenezes rinkinį (AGILENT TECHNOLOGIES, Santa Clara, CA, JAV). Mutant Fab baltymai buvo išreikšta ir išgrynintas įvertinti kiekvieno Likučių antigeną surišantis veiklos svarbą. Trumpai tariant, , Escherichia coli
DH5α ląstelių, transformuotų su pComb3X vektoriaus slėpimas mutantas Fab genus buvo auginamos 28 ° C SB sultinio. Išraiška buvo sukeltas su 1 mM izopropilo beta-D-1-thiogalactopyranoside, kai optinis tankis (600 nm) iš kultūros pasiekė 0,8. Mobilaus ryšio granulės buvo resuspenduotos atšaldytos ekstrahavimo buferinio tirpalo (120 mmol Tris, pH 8,0, 0,3 mM EDTA, ir 300 mM sacharozės) ir inkubuojami ant ledo 30 minučių, periplasmic ekstrahuojant. Magnio chloridas (2,5 mm) buvo įtraukta į nuskaidrinto ekstrakto po centrifugavimo Przedmuch nemokamą EDTA prieš imobilizuoto metalo jonas giminingumas chromatografija (IMAC) gryninimo. Išgrynintas Fab baltymai buvo naudojamas ELISA Kietafazės ir K
_{išjungti analizė naudojant paviršiaus plazmonų rezonanso (SPR).}

Affinity brendimo

žmogiškas 1E11 klonuotas pComb3X vektoriaus kaip Fab formatas buvo panaudota kaip pagrindas sutampa pratęsimo polimerazės grandininė reakcija (PGR) mutagenezes šabloną, kaip aprašyta anksčiau [23]. Į degeneruoti oligonukleotidai (Integruota DNR technologijos, Coralville, I., JAV) 5'-CTGCCCGAAGGTCCAGGGMNNMNNMNNMNNCTGCTGGCAGTAATAAGTAGC-3 "(atbulinės eigos) ir 5'-GTCTACTATTGTGCTAGA42S43S11S11S24S14S34STTCGACTACTGGGGCCAGGG-3; (Į priekį) buvo naudojamas L-NNK ir H-XXS bibliotekoje, atitinkamai. N, nurodo A, C, G arba T; M yra C arba A; ir S yra G arba C. Sunumeruotos pagrindo padėčių nurodyti rankomis mišrus nukleotidus, sudaryti iš 70% vienai bazei ir 10% kiekvienos iš kitų trijų bazių: 70% dažnis bazė yra G, A, T, ir C 1, 2, 3, ir 4, atitinkamai. Už H-2AA bibliotekoje, buvo naudojama kaip ne ekvimolinis mišinys iš šių į priekį mutageninio oligonukleotidų: 5'-GTCTACTATTGTGCTAGANNKNNKGGTGGGACCGCCTCCTTCGAC-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACNNKNNKGGGACCGCCTCCTTCGACTAC-3', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGNNKNNKACCGCCTCCTTCGACTACTGG-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTNNKNNKGCCTCCTTCGACTACTGGGGC-3' , 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGNNKNNKTCCTTCGACTACTGGGGCCAG-3 ', ir 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGACCNNKNNKTTCGACTAC TGGGGCCAGGG-3'. K žymi G arba T. Po dviejų turų sutampa pratęsimo PGR, Fab bibliotekos DNR atsitiktinių imčių CDR buvo pjaustomos SfiI, susiūta į SfiI-suardomas phagemid vektoriaus pComb3X ir elektroporacija į El
. coli
padermės ER2537 (New England Biolabs, Beverly, MA, JAV).

didelis afinitetas rišikliai buvo atrinkti naudojant tirpias biotinilintą HER2 EVD baltymų. Karoliukas rišikliai buvo iš anksto išeikvoti inkubuojant antikūnų fago biblioteka su 100 įxL anksto užblokuotas Dynabeads M-280 streptavidinu (Invitrogen) 1 valandą su lėtai rotacija kambario temperatūroje. Biotinilinto HER2 ECD baltymas (100 NM- 12:01) buvo įtraukta į iš anksto išeikvoti antikūnų bibliotekos ir inkubuojami 1 valandą su sukimosi kambario temperatūroje. Tada, buvo pridėta ir inkubuojami ant sukamojo 15 minučių 50 pL užblokuotų streptavidinu-magnetines granules. Granulės buvo plaunamos 10 kartų su 1 mL Tris-buferio druskų tirpalu-Tween 20 (TBST) ir du kartus su 1 ml PBS. Surišti fagai eliuuojami inkubavimą karoliukų su 1 ml 100 mM trietilamino 8 minučių, po to neutralizuotas 0,5 ml 1 M Tris, pH 7,4.

IFA surišimo aktyvumą bandymas

buvo pridėta Antikūnai į Costar 96 duobučių puse paviršiaus plokštelės (Corning, Corning, NY, JAV Produkto kodas 3690) dengta su 1 g /ml antigeno. Po inkubacijos kambario temperatūroje 1 valandą, plokštelės tris kartus buvo plaunamos su TBST ir inkubuojami su triušio anti-žmogaus antikūnų-krienų peroksidazės (HRP) (Pierce, Rockford, IL, JAV) IgG antikūnus ir žiurkių anti-HA-HRP (klonas F10 "," Roche gyvenimas Mokslas, Bazelis, Šveicarija) už Fab antikūnų, atitinkamai. Plokštės tris kartus buvo plaunamos, tetramethylbenzidine (TMB) peroksidazės substratas (SurModics, Eden Prairie, MN, JAV) buvo pridėta ir reakcijos buvo sustabdytos pridedant 1 N sieros rūgšties (DukSan, Ansanas, Korėja). Optinių 450 nm buvo matuojamas naudojant Viktoras X3 priemonę (PERKINELMER, Waltham, MA, JAV).

Paviršiaus plazmonų rezonanso tyrimas

K
_{išjungti analizės Fab baltymų, HER2 ECD-Jo baltymas imobilizuota ant tam CM5 jutiklio lustas (GE Healthcare "), naudojant amino prikabinimo būdą maždaug 2000 reagavimo vienetų (ru) paviršiaus. Išgrynintų Fab baltymai buvo įpurškiamas 2 mikrogramai /ml koncentracijos ir kuris tiekiamas į kolonėlę 50 mikrol /min. Dėl K
išjungti analizė IgG antikūnų, ožkos anti-human IgG (γ) (Invitrogen, Kat. Nr H10500) buvo imobilizuota ant cm5 jutiklio lustas naudoja amino mova, ir antikūnai buvo perimta ne 1 g /ml 4 minutes ir stabilizuotas 5 minutes, srauto greičiui esant 50 pL /min. HER2 ECD-Jo baltymas buvo suleista esant 160 nM koncentracijos. Dėl artimų matavimus, antikūnai buvo perimta maždaug 50 GĮ ožkos anti-human IgG (gama) Sustabdyto ant cm5 lustą. HER2 ECD-Jo baltymas buvo suleista koncentracijos yra intervale nuo 0 iki 640 nM. Sensorgrams buvo gauti kiekvienai koncentracijai ir vertinami naudojant BIAevaluation programinę įrangą. Dėl epitopą rozdzielników IgG forma hz1E11 buvo imobilizuota ant atskirų cm5 jutiklis chip paviršiams maždaug 1000 reagavimo padalinius. HER2 ECD-Jo (320 nM) ir antikūnai (1 g /mL) buvo nustatyti iš eilės pridėta 4 minutes ir stabilizuotas 5 minutes, srauto greičiui esant 50 pL /min.}

Ląstelių gyvybingumas tyrimas

Ląstelės buvo pasėjamos 96-duobučių lėkštelėse (Corning) į 10% FBS terpėje, turinčioje ir iš anksto-kultivuojamos 24 valandas. Ląstelės buvo gydomi antikūnų pasiektų nurodytą koncentracijos ir kultūros 4 dienas. WST-1 reagentas (Dogen EZ-Cytox; Daeil Lab "Paslaugų, Seulas, Pietų Korėja), buvo naudojamas matuoti ląstelių gyvybingumą. Santykinis ląstelių gyvybingumas buvo apskaičiuojamas dalijant kiekvienos absorbcija gerai vidutinę absorbcijos PBS gydytų šulinių kiekvienos plokštelės.

ksenografiniuose tyrimas

Athymic nuogas moterų pelių (Daehan BioLink, Chungbuk, Pietų Korėja ) buvo švirkščiamas į poodį kairės rajone su 5 × 10 ^{6 NVI-N87 ląstelių Matrigel (BD biomokslų, San Chosė, CA, JAV). Navikai buvo leidžiama augti iki maždaug 200 mm 3 dydžio, tada peles buvo randomizuoti į grupes. Gyvūnai gavo į pilvaplėvės ertmę antikūnų tuo nurodytas dozes du kartus per savaitę. Naviko apimtys buvo apskaičiuojamas pagal formulę (L × W × P) /2, kur L žymi prie didžiausios naviko skersmuo ir W reiškia mažiausią naviko skersmuo. Dviejų krypčių pakartotiniai priemonės ANOVA po to Bonferroni po bandymo buvo atlikta statistinės analizės naviko growth.All gyvūnų tyrimai buvo atlikti pagal NIH anketa "vadove priežiūros ir naudojimo gyvūnų" gaires ir gavo patvirtintą protokolą bendrovės įstaiga gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas.}

rezultatai

humanizavimas 1E11 atliko CDR-persodinimas žmogaus gemalo genų

plėtoti žmogiškas antikūno VH ir VL sekos pelės 1E11 buvo lyginamas su žmogaus gonocitų linijos V ir J genų repertories naudojant IMGT /V-QUEST analizės įrankiai [24]. Dėl smarkaus grandinėje, IGHV3-48 * 03 ir IGHJ4 * 01 eksponuojami aukščiausią homologiją į 1E11 kolegomis, dalintis 85% ir 87% tapatybę, atitinkamai. Dėl šviesos grandinės, žmogaus IGKV1-39 * 01 ir IGKJ1 * 01 genai rodomas tapatybę 80% ir 81%, atitinkamai. Šie žmogaus genai buvo pasirinktas kaip akceptorių sekų skirtų pelių CDR persodinimas. Tarp Verniero zonoje, kuri susideda iš likučių pagrindų regione, kurie yra susiję su CDR struktūrų pateikimo remiant CDR ratai [18, 25], tik viena liekana 49 padėtyje _{H sunkiosios grandinės skyrėsi tarp pelių ir žmogaus sekas. Todėl žmogiškas 1E11, hz1E11, turi tik vieną pelių liekanų pagrindų regionai (1 pav).}

įrišimas veikla hz1E11 neląsteliniam regione (ECD) HER2 buvo lygiavertis ch1E11 (pav 2A), ir trastuzumabo giminingumas, ch1E11, ir hz1E11 buvo 3 nM, 23 nM, ir 23 nM, atitinkamai. Mes taip pat patvirtino, kad hz1E11 privalo IV Sub-domeno kaip tėvų ch1E11. Trastuzumabu taip pat jungiasi su IV Sub-domeno [26]. in vitro
antiproliferacinis veikla hz1E11 monoterapijai bei kartu su trastuzumabu taip pat buvo lygiavertės ch1E11 (pav 2C). Ankstesniame tyrime [22] buvo pranešta, kad ch1E11 turėjo vivo
priešnavikinis aktyvumas panašus į trastuzumabu monoterapijai, ir ch1E11 ir trastuzumabo derinio rezultatas yra naviko regresiją indeksą (TGI) iš 95,1%. Panašiai hz1E11 kaip vienas agentas turėjo panašios vivo
priešnavikinis aktyvumas trastuzumabui (S1 pav) ir hz1E11 kartu su trastuzumabu taip pat parodė, dozės priklausomą Priešnavikinio veiklą į NVI-N87 svetimo pelės modelis ( pav 2D). Antikūnų Kombinuotas gydymas 1 mg /kg kiekvienas hz1E11 ir trastuzumabo lėmė panašios priešnavikinis poveikis trastuzumabu vieno gydymo 10 mg /kg, o 2,5 mg /kg kartu ir aukščiau nustatytas navikas stabilizavosi arba ėmė juda atgal (Nėra statistiškai reikšmingas skirtumas [ P
< 0,05] buvo pastebėtas tarp 2,5, 5, ir 10 mg /kg kūno svorio deriniai). Šie rezultatai rodo, kad hz1E11 turi giminingumo ir biologinis aktyvumą, ekvivalentišką ch1E11, ir kad hz1E11 pagerina antinavikinį poveikį trastuzumabo kai ji naudojama kartu.

alaninas nuskaitymas CDR-H3 ir CDR-L3

Jei nustatyti kritinius liekanas antigeno-antikūno sąveika, alanino skenavimo mutagenezė buvo atliktas CDR3 regionuose sunkiosios ir lengvosios grandinių (CDR-H3 ir CDR-L3). Iš mutacijų poveikis buvo vertinamas analizuojant privalomąją veiklą išgryninto Fab baltymus netiesioginė IFA. Be CDR-H3, alanino keitimą padėtyje Gly98 _{O panaikintas privalomas iš Fab prie HER2 ir G97 HA ir T99 H mutantai buvo mažiau privalomąją veiklą (pav 3a). Be CDR-L3, alanino keitimai turėjo daug mažesnius padarinius (pav 3b). K
išjungti vertybes alanino skenavimo mutantai buvo analizuojami naudojant SPR prieš immbolized HER2 ECD baltymų. Mes patvirtino, kad sunkioji grandinė G98A mutantas visiškai prarado įpareigojančius veiksmus, o kaimyninėje T99 H ir G97 HA mutantai atsirado 32 kartų ir 17 kartų didesnis K
Išjungta vertybių , atitinkamai (pav 3C). Šie rezultatai rodo, kad sunkioji grandinė Gly98 H yra funkciškai svarbi ir jos gretimų liekanos yra taip pat funkciškai svarbi antigeno-antikūno sąveika.}

Affinity brendimą hz1E11

buvo atliktas Affinity brendimą hz1E11 iki sunkiosios ir lengvosios grandinės CDR3, variantas bibliotekų statybos, o po to pusiausvyros atrankos fago antikūnų bibliotekų. Dėl šviesos grandinės, glutamino liekanos padėtyse 89 _{L ir 90 L nebuvo įvairus, nes glutaminas yra visuotinai rasti šių devynių amino rūgščių longCDR-L3 sekų pozicijų atitinkamai 59% ir 73% dažnių, atitinkamai [ ,,,0],27]. Užimamos pareigos 91 L-94 L atsitiktiniu būdu buvo suskirstyti naudojant NNK peraugti kodoną (L-NNK). Sunkiąją grandinę, pozicijas 95 H -100a H atsitiktiniu būdu buvo naudojant XXS kodoną (H-XXS), suprojektuoti taip, kad pirmojo ir antrojo nukleotidų pozicijas, nurodytas įvairus kodono laukinių tipo stovu įvyko su 70 % tikimybė, kiekvienas iš kitų trijų bazių įvyko esant 10% dažnio, ir trečioji raidės kodonams buvo susintetinti naudojant ekvimolinis mišinys G ir C (pav 4a). Didelio afiniteto rišikliai buvo atrinkti iš aukštos griežtumo ar mažai griežtumo panning (1 lentelė).}

Palyginti su mažai griežtumo panning L-NNK bibliotekoje, kurioje 100% antrosios, trečiosios, ir ketvirta-turas išvesties klonai tikrinami buvo IFA teigiamas, dėl didelio griežtumo panning ketvirta apvalios produkcija nedavė rišiklis ne visi, ir tik trečdalis iš trečiųjų apvalių išvesties klonų buvo IFA teigiamas (1 lentelė). Pasirinktos klonai iš CDR-L3 bibliotekoje buvo daug sekas, kurios turėjo mutavo visi keturi atsitiktinių imčių CDR-L3 pozicijos, skirtingai nuo CDR-H3 bibliotekų, iš kurių dauguma pasirinktų klonų išlaikė laukinio tipo seka pozicijas 97 _{H -100 H (žr žemiau). Įvairūs panning strategijos davė skirtingus seka sodrinimo modelius. Pavyzdžiui, lengvoji grandinė variantas klonas 1A12 (K 89LQNAYAPWT 97L) buvo izoliuota nuo didelio griežtumo panning, bet ne iš mažai griežtumo panning, ir sunkioji grandinė variantas klonas 1B12 (N 95HYGGTASFDY 102H), taip pat buvo išrinktas tik iš aukštos griežtumo panning. Įdomu tai, kad 59% unikalių antikūnų 4 ^{-asis išėjimas su mažai griežtumo panning L-NNK bibliotekoje turėjo ne poziciją alaninas 92 L, atitinka alanino skenavimo analizė (pav 4b).}}

Beveik visi klonai, kurie buvo išskirti iš H-XXS bibliotekoje turėjo tą pačią seką bent 97 _{H -100 o kaip tėvų klonas, ir parodė aiškų praturtėjimą Asn Tyr seka ne 95-96. Siekiant dar labiau įvertinti CDR-H3 likučių prisidėti prie antigeno-antikūno jungimosi, papildoma CDR-H3 biblioteka buvo pastatyta su dviejų NNK atsitiktinai kodono nuskaitymo CDR-H3 (H-2AA, pav 4a). Mažas griežtumo panning, mutantai padėtyse 95 H 96 H 99 H 100 H ir 100a O buvo pasirinktas pirmasis ištisus panning, bet tik mutantai padėtyse 95 H ir 96 o buvo prisodrintas ketvirtą ištisus produkciją (1 lentelė). Mes negalime aptikti mutantai padėtyse Gly97 H ir Gly98 H jokių stumdymo strategijas ir rezultatų.}

Affinity ir privalomas veikla atrinktų klonų

Jei įvertinti derinio poveikį iš artimų-subrendo sunkiosios ir lengvosios grandinės variantų, IgG antikūnų derinius giminingumo-subrendo sunkiosios ir lengvosios grandinės buvo gaminami ir jų K
_{išjungti vertės buvo nustatyti naudojant SPR analizė (2 lentelė). Tarp dviejų lengvoji grandinė variantų ir du sunkioji grandinė variantų, 1A12 kilęs iš L-NNK parodė didžiausią pagerėjimą (16 kartų). Iš lengvosios grandinės 1A12 su optimizuotu sunkiosios grandinės klono 1B12 derinys lėmė 24 kartų pagerinti K pervežimas Išjungta per tėvų hz1E11, o dėl kitų derinių K
išjungti vertės buvo panašios arba didesnis nei 1A12. Kadangi 1,5 karto papildoma gerinimą L-1A12 + H-1B12 kartu reikšmingai didelis, klonai 1A12 ir 1F11 (lengvosios grandinės variantai) buvo pasirinktas dėl papildomos apibūdinimo sumažinti eilės skirtumą iš artimų-subrendo antikūnų nuo tėvų klonas. Disociacijos konstantos dėl giminystės subrendo klonai, lemia SPR analizę, buvo daugiau nei 10 kartų mažesnė nei vaiko priežiūros klonas hz1E11 ir lyginti su trastuzumabu (3 lentelė).}

Norėdami nustatyti, ar giminystės -matured hz1E11 klonai jungiasi prie to paties epitopq kaip tėvų hz1E11, kad 1A12 ir 1F11 privalomas HER2-EVD, kad buvo iš anksto privalo hz1E11 buvo analizuojami SPR. Abu klonai negalėjome jungiasi prie monomerų HER2 ECD-Jo baltymų užfiksuotas Sustabdyto 1E11 tarpu trastuzumabu galėtų (pav 4c). Be to, ji buvo patvirtinta, kad 1A12 epitopas nepersidengia su, kad trastuzumabo (pav 4d). Klonai 1A12 ir 1F11 taip pat jungiasi prie IV Sub-domeno kaip ir jų tėvų klonas hz1E11 (pav 4E). Šie duomenys rodo, kad epitopus 1A12 ir 1F11 nebuvo pakeista giminingumas brandinimo proceso.

Veiksmingumas giminystės subrendo hz1E11 klonai

Ir 1A12 ir 1F11 antikūnai parodė šiek tiek padidėjo antiproliferacinis veiklą kaip monoterapijai, palyginti su hz1E11 nuo NVI-N87 ir OE-19 skrandžio vėžio ląstelių linijas, kad padidėjusi HER2 (pav 5a ir 5b), kadangi kartu su trastuzumabu, jų antiproliferacinis veikla buvo pranašesnis už tą trastuzumabu vieni ir prilygsta hz1E11 plius trastuzumabu , Anti-proliferacijos veikla 1A12 ir 1F11 patvirtino vivo
į NVI-N87 ksenografiniuose modelį. Geresnis priešnavikinis aktyvumas buvo akivaizdu, kartu su trastuzumabu, kad kad vien kiekvieno agento abiejų ksenografiniuose modelių (pav 5c).

Diskusijos

Nepaisant skatinti klinikinius rezultatus, gautus su HER2 orientacija antikūnų trastuzumabu į gydymas skrandžio vėžio, vis dar yra poreikis daugiau stiprių HER2 skirta terapija [6]. Kombinuotas nekonkurencinio antikūnų skirtomis receptoriai, pavyzdžiui, HER2, EGFR ir KEAFR 3, gali padidinti kovos su naviko veiklą Ikiklinikinių modelius [11-13, 28]. Pertuzumabas, kitas HER2 nukreipti antikūnai, yra aprobuotas naudoti kartu su trastuzumabu metastazavusiam krūties vėžio [29] gydymą. Ankstesniame tyrime, mes sukūrėme naujovišką HER2 taikymo antikūnų, 1E11, kuris buvo įrodyta, turi didelę Priešnavikinio veiklą monoterapijai ir sinergetinį poveikį kartu su trastuzumabu in vitro parsisiųsti ir in vivo
[22]. Priešnavikinis aktyvumas 1E11 ir trastuzumabo derinys derinys yra pranašesnis ne tik trastuzumabo vieną po gydymo, tačiau taip pat su pertuzumabas ir trastuzumabo derinio. Šioje ataskaitoje humanizavimas ir po giminingumas brendimą pelės hibridominių gautas 1E11 monokloninis antikūnas yra aprašyta.

Pradinės metodus, siekiant sumažinti galimą imunogeniškumą nežmogiškieji kintamųjų regionuose CDR-persodinimas į žmogaus sistemą žymiai sumažinti imunogeniškumo terapinių antikūnų [15, 17]. Superhumanization naudojant žmogaus gemalo sistemas kaip šablonas buvo pasiūlyta kaip aukščiausios humanizavimo metodiką, kad būtų išvengta spėjamas efektorines T-ląstelių epitopus išvedami somatinių hypermuations žmogaus sistemą [30-32]. Buvo pasiūlyta, kad antikūnai koduojami gemalo genų segmentų struktūriškai lanksti ir gali prisitaikyti prie privalomas daug įvairių antigenų [33-35]. Iš pelės antikūno 1E11 CDR, taip pat viena liekana Verniero zonoje V _{H (Ala49 H) buvo įskiepyta ant žmogaus gemalo kintamojo ir sujungimo genai, kurių aukštesnės homologiją su galimu motininio antikūno (1 pav). Gautas žmogiškas antikūnų, hz1E11 parodė, beveik identišką pažiūras ir biologinį aktyvumą į tėvų antikūnų (2 pav).}

parinkimas liekanų tikimybių yra svarbus žingsnis tikslingai tikimybių metodą giminystės brendimo dėl praktinių apribojimų antikūnų bibliotekos dydžio ir atrankos paslaugas. Alanino nuskaitymo ir silikochromatas pervežimas analizės antikūnų seka, ypač CDR, yra naudingi atrenkant tikimybių tikslines likučius ir palengvinti Affinity brendimo procesą. Be alanino skenavimo analizės CDR-H3 ir hz1E11, The G98A mutantas visiškai prarado privalomąją veiklą ir G97A mutantas buvo mažiau privalomąją veiklą (pav 3a). Tiesioginis pakeitimas yra esminis paratope liekanos paprastai sukelia viso praradimo privalomas gebėjimas antikūnų [26, 33, 36]. Todėl labiau konservatyvus požiūris į CDR-H3 tikimybių dirbo, naudojant vieną rankoje mišri oligonukleotidą, kad yra linkusi į tėvų eilės arba dviejų nns atsitiktinių kodoną nuskaitymo CDR-H3. Kaip ir tikėtasi iš alanino skenavimo analizės, beveik visi klonai, kurie buvo išskirti iš CDR-H3 bibliotekų turėjo seka 97 _{H-100a H pats kaip tėvų klonas (G 97HGTAS 100aH) .}

alanino skenavimo rezultatai rodo, kad visi CDR-L3 liekanos yra nebūtinas, nors kai kurie iš mutacijų atrodo, kad sumažinti giminingumą (pav 3b). Todėl keturi pozicijos CDR-L3 (91 _{L-94 L), buvo visiškai atsitiktiniu būdu naudojant NNK peraugti kodoną. Seka analizė pasirinktų klonų patvirtino alanino skenavimo analizę; atrinktų klonų iš CDR-L3 bibliotekoje dauguma buvo visi keturi atsitiktinės atrankos CDR-L3 pozicijos pakeistas iš tėvų liekaną, priešingai CDR-H3 optimizavimo rezultatus, kuriame didžioji dalis pasirinktų klonų iš bibliotekų turėjo tą pačią seką, kaip vaiko hz1E11 į vidurinės dalies CDR (1 lentelė). Klonai, turintys didžiausią afininės gerinimo atėjo iš CDR-L3 bibliotekoje. Tikėtina, kad CDR-H3 ir hz1E11 jau beveik optimalus ir labiausiai mutacijų, ypač regionas 97 H-100 H, yra žalingas afinitetas, o CDR-L3 seka nėra kaip optimalus ir šiame regione mutacijos gali sukelti žymiai pagerinti Affinity. L-NNK biblioteka KADRAVIMAS išėjimai buvo praturtintas klonų su hidrofobine amino rūgšties padėtyje, 91 L, mažas aminorūgščių 92 L, ir aromatinio amino rūgšties esant 93 L. Šis modelis yra šiek tiek skiriasi nuo tėvų CDR-L3 seka Q 89LQLYSTPWT 97L ir vėl rodo, kad CDR-L3 seka tėvų 1E11 antikūnų buvo suboptimali ir taip turėjo kambarį afiniteto tobulinti.}