| Stomach Health > skrandžio sveikatos >  > Gastric Cancer > skrandžio vėžys

PLoS ONE: maža molekulė R1498 kaip gerai toleruojamas ir veiklus išgertas kinazės inhibitorius už kepenų vėžio ir skrandžio vėžiui gydyti per Nukreipimas Angiogenezė o mitozės Pathways

Anotacija

proteinkinazes vaidina svarbų vaidmenį navikų vystymąsi ir progresavimą. Daug kinazės inhibitorių sudaręs rinkoje ir parodyti perspektyvių klinikinius teikiamais privalumais. Čia mes pranešti apie naują mažos molekulės atradimas, gerai toleruojamas, veiklus išgertas kinazės inhibitorius, R1498, majorly skirtą tiek angiogeninių ir mitozės kelius dėl kepenų ląstelių karcinoma (HCC) ir skrandžio vėžio (GC) gydymui. Biocheminių ir ląstelių pagrindu tyrimų serija buvo nurodyta, kad tikslinė kinazės klasteris R1498 įtraukti Aurora kinazes ir KEAFR 2 ir kt. R1498 parodė vidutinį vitro
augimo slopinimą nuo naviko ląstelių skydelis su IC50 iš mikromolį diapazone. in vivo
priešnavikinis veiksmingumas R1498 buvo įvertintas nuo GC ir HCC audiniuose, skydelyje lygiagrečiai lyginant su kita kinazių inhibitorius sorafenibu. R1498 parodė geresnį veiksmingumą ir toksiškumo savybes per sorafenibu visų bandymų modeliai su > 80% naviko augimo slopinimas ir naviko regresija kai xenogratfts. Terapinis potencialas R1498 taip pat buvo pabrėžta, jo veiksmingumas trijų žmonių GC pirminio naviko gautų ksenografiniuose modelių su 10-30% naviko regresiją norma. R1498 buvo parodyta aktyviai slopina AURORA A veikla in vivo
ir sumažinti vaskuliarizacijos navikuose. Be to, R1498 pristatyta gera vivo
poveikis ir terapinis langas farmakokinetikos ir dozių diapazono nustatymo tyrimų. Disertacija įrodymai rodo, kad R1498 yra stiprus, gerai toleruojamas, veiklus išgertas multitarget kinazės inhibitorius su unikaliu antiangiogeniniu ir proliferacijos profilio ir suteikti tvirtą pasitikėjimą toliau plėtoti už HCC ir GC terapijos

nurodomoji dalis:. Zhang C wu X, Zhang, M, Zhu L, Zhao R, Xu D, ir kt. (2013) maža molekulė R1498 kaip gerai toleruojamas ir veiklus išgertas kinazės inhibitorius už kepenų vėžio ir skrandžio vėžiui gydyti per Nukreipimas angiogenezę ir mitozės kelius. PLoS ONE 8 (6): e65264. Doi: 10,1371 /journal.pone.0065264

redaktorius Claude Prigent Institut de Génétique et Développement de Rennes, Prancūzija

Įstojo: vasario 22, 2013; Priėmė: Balandžio 23, 2013 m Paskelbta: Birželis 5, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Zhang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Finansuotojų neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų: Visi autoriai yra darbuotojai ar ankstesni darbuotojai Roche R & d centras (Kinija), išskyrus Taiping Chen. , kuris yra iš CRO įmonės pavadinimą Karūnos biologijos Inc Pekinas, Kinija darbuotojas. Tai nekeičia autorių laikytis visų PLoS ONE politikos dalijimosi duomenimis ir medžiagų.

Įvadas

Baltymų kinazės tarnauti kaip tikslų, skirtų naudoti terapijoje intervencijos į vėžio, kuris yra patvirtintas ir įrodytas pagal sėkmingas ir platus taikymas baltymų kinazės inhibitorių keliais vėžio, arba kaip monoterapiją arba derinant režimų. Tačiau, kaip nevienalyčių sukeltos ligos kaupiamųjų kelių genų mutacijų, o ne važiuoti vienu kinazės mutantas, vėžio, turinčių gerą atsakymą į monoterapijai terapija yra labai ribotas. Be to, įgytas atsparumas navikų padėti sau greitai išvengti nuo chemoterapijos, tada recidyvo. Kompleksas netipinė signalizacijos vėžio pritraukia strategijų, kad pagal daugelį biologinių kelius, susijusius su naviko biologijos, pavyzdžiui, platinimo, metastazių ir anti-apoptozės plėtrą. Vienas strategija apima racionalius narkotikų derinius. Pavyzdžiui, iš VEGF derinys tiksliniai monokloninį antikūną su įprastais chemoterapiniais parodė didelę išgyvenimo pranašumą krūties, gaubtinės žarnos, ir plaučių vėžio [1]. Kita strategija yra sukurti junginiai, kurie apima kelis mechanizmus per vieną agentas. Šis metodas turi keletą potencialių pranašumų prieš kombinaciją strategijų, įskaitant paprastumo vystymosi keliu, greitis į rinką, ir mažiau sutapimų šalutinio poveikio. Šiuo metu kinazių inhibitorius sorafenibas naudojamas kaip pirmos eilės gydymą pažangių ir metastazavusiu HCC su gerinti mediana nuo 7,9 mėnesių (placebo grupėje) iki 10,7 mėnesių [2]. Tačiau gydymas sorafenibu rezultatų statistiškai reikšmingas, tačiau kliniškai lengvos, gerinti bendrą išgyvenamumą, laikas iki ligos progresavimo ir ligų kontrolės norma [3]. Tuo tarpu tradicinis cisplatina pagrindu terapija yra vis dar plačiai naudojamas klinikiniuose parametrus pažangių ir metastazavusiu GC. Dėl HER2 /neu ekspresija skrandžio adenokarcinoma, trastuzumabu kartu su chemoterapija pailgina bendro išgyvenamumo mediana nuo 11.1 mėnesius (vien chemoterapija) 13,8 mėnesių [4]. Nors companioned diagnostikos metodika buvo sukurta siekiant ekranas tikslinių pacientų, trastuzumabu neturi didelėje pogrupyje pacientų slėpimas aukšto lygio HER2 /neu su priežasties veiklą būtų galima identifikuoti [5]. Atsižvelgiant į didelį mirtingumą nuo HCC ir GC ir dabartinių terapinių režimų riboto rezultato, vis dar yra didžiulė gydymo poreikis abiems vėžio tipų.

Angiogenezė remiantis vėžio terapija, įskaitant anti-KEAFR-2 antikūnų, mažų molekulių prieš VEGFR -2 signalizavimo [6], [7], ir VEGFR chimerinio baltymo ekspresijai [8], buvo įrodyta, kad būti efektyvus strategija, skirta gydymui iš daugelio vėžio rūšių. Be to, iš daugelio kinazių inhibitoriais sunitinibo ir sorafenibo veiksmingumas iš dalies būtų priskirti VEGF signalizacijos blokuoja [9]. Tačiau pacientų skaičius yra iš esmės atsparios arba atsparumą prieš antiangiogeniniu terapijos plėtoti po kelių gydymo ciklų [10], [11]. Taigi, klinikiniai tyrimai, derinant angiogeninių inhibitoriai ir narkotikų su alternatyvios veikimo mechanizmą tikimasi pagerinti veiksmingumą arba įveikti atsparumą antiangiogeniniu gydymo [12]. Jis buvo plačiai pripažinta, kad padidėjusi Aurora kinazės įvairių vėžio yra dalyvauja Tumorigenesis [13], [14] procese. Aurora kinazės inhibitorius, VX-680 galėjo veiksmingai slopina vėžinių ląstelių augimą, in vitro, parsisiųsti ir vivo
, o vėliau įstojo į klinikinius tyrimus, o tai rodo, kad Aurora kinazės yra druggable tikslai [15] .

Atsižvelgiant į kaupiamųjų įrodymų apie angiogenezę ir Aurora kinazės vėžiu ir jų terapines vertybių įrodyta biologinių ir mažų molekulių inhibitorių, mes atrado kinazės inhibitorius, R1498, kurios iš esmės paveikti pagrindinius kelius angiogenezę ir mitozė. R1498 turi unikalią kinazės slopinimas profilį, didelės potencijos, ir gerą farmakokinetikos ir toksikokinetinių profilius, visa tai remti tolesnį klinikinę raidą.

Medžiagos ir metodai

Etika pareiškimas

naudojimas ir priežiūra eksperimentinių gyvūnų buvo patvirtintas pagal institucinius gyvūnų priežiūrai ir naudojimui komiteto (IACUC), Roche R & d Center "(Kinija). Karūnos biologijos, CRO paslaugų įmonė įsipareigojusi apsaugoti pacientų privatumą ir laikytis visų etikos principų pacientų gaunamų medžiagų, surinktų šviežiai išmestų žmogaus navikų mėginiuose, su IRB (vietos ligoninės prilygsta komitetas) patvirtinimo bei paciento sutikimo reikalavimus. Visi mobilieji linijos buvo įsigytas iš ATCC, JAV, ar Šanchajaus institutų biochemijos ir ląstelės biologijos, Kinijos mokslų akademijos

junginiai

R1498 (grynumas > 98%). Buvo susintetintas Roche R & D Center "(Kinija). Dėl fermentinių tyrimų ir vitro
ląstelėmis tyrimai, R1498 buvo ištirpintas DMSO kaip 0,01 mol /l tirpalo. Gyvūnų tyrimus, R1498 buvo ištirpinta 1% Klucel EF /0,1% polisorbato 80 /0,09% Methylparaben /0,01% propilparabenas vandens, tirpalas buvo paruoštas per savaitę. Sorafenibas buvo susintetintas Roche R & D centras (Kinijos) ir ištirpinama Cremophor EL /etanolio (50:50, Sigma), paruošti 5 mg /ml tirpalo, folija suvynioti ir saugoti kambario temperatūroje. prieinamumo sprendimas buvo ruošiamas kas 3 dienas. Paskutinės dozės sprendimai buvo parengta remiantis naudojimo dieną skiedžiant tirpalą su sterilizuoti vandens.

Mobilaus ryšio linijos

Visos ląstelių linijų iš Amerikos Typical surinkimo centre (ATCC) ir ląstelių banką, Šanchajus institutai Biochemijos ir ląstelių biologijos, Kinijos mokslų akademija buvo palaikoma 37 ° C 5% CO 2 drėkinamame atmosferą terpėje rekomenduoti pagal pardavėjų ir taikomos in vitro
tyrimai tarp ištraukas 8~15 , ląstelių linijų tyrimus su gyvūnais buvo tarp ištraukas 5~10. Žmogaus bambos venos endotelio ląstelių (HUVEC) gauti iš Allcells (EMERYVILLE, CA) buvo laikomi EGM-2 (Lonza, Allendale, NJ) su endotelio ląstelių augimo papildų ir 10% vaisiaus galvijų serumo (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija).

ląstelių proliferaciją Analizės

Kiekviena ląstelė linija sėklomis į 96 šulinėlių audinių kultūros plokštės (Corning, Niujorkas) iš anksto nustatytu tankiu 180 įxL pilnas vidutinio, pridedamas naktį ir gydomi junginio į kitą 72 val. Tada vidutinės buvo sunaikinti arba pakeisti su 10% CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonija) visiškai terpėje, tada inkubuojami Plokštelės dar 2 val. Optinio tankio 450 buvo matuojamas SpectraMAX 190 spektrofotometru (MDS, Sunnyvale, Kalifornija). Fono sugeriamumas OD tuščią buvo atimama iš visų šulinių. Tada slopinimo lygis (IR) buvo nustatomas pagal formulę:. IR (%) = (OD DMSO-OT junginių) /OD DMSO × 100%

VEGF sukeltas HUVEC platinimu testą, HUVECs suspenduotos 170 iL visuotinio akcininkų susirinkimo-2 su 0,5% FBS buvo sėklomis ir inkubuojama per naktį. Po to, kai prie jų esančių rišamųjų ląstelių, 10 pL 1 mikrogramai /ml rekombinantinio žmogaus VEGF 165 (R & D sistemos, Mineapolis, MN) buvo įtraukta į kiekvieną šulinėlį kartu su 20 mikrol, kombinuotųjų tirpalo, paruošto pagal EGM-2 su 0,5% FBS. CCK-8 tyrimas, kaip nurodyta pirmiau buvo naudojama siekiant nustatyti ląstelių gyvybingumą.

kinazės Bandymai

Iš R1498 giminingumas prieš 402 kinazės nulėmė KINOMEScan® (taikymo sritį biomokslų, San Diego, CA) ir duomenys buvo pateikiami kaip disociacijos konstanta (Kd) vertybių [16]. Slopinimas dėl kinazės aktyvumo Aurora kinazės ir KEAFR 2 Toliau buvo būdingas Z'-Lyte kinazės aktyvumo tyrimai pagal atitinkamas ATP koncentraciją.

HUVEC vaizdeliai formavimas Analizės

HUVEC vamzdis formavimas tyrimas buvo atliktas anksčiau pranešė [17]. Trumpai tariant, Matrigel ™ ( "BD biomokslai Franklin ežerų NJ) buvo atšildyti 4 ° C 3~4 h. 100 mikrol, skystis Matrigel ™ buvo įtraukta į iš anksto aušinamas 96-duobučių audinių kultūros plokštelę, ir plokštelės buvo inkubuojamos 37 ° C temperatūroje, 5% CO 2 sudrėkintas atmosferos 1 h sukietėti Matrigel ™. HUVECs buvo auginamos EGM-2 su 0,5% FBS per naktį, ir pasėjamos 90 mikrol EGM-2 su 0,5% FBS esant tankio 2,2 × 10 5 ląstelių /ml dėl Matrigel ™ padengtas plokštės. Ląstelės buvo gydomi junginio arba ekvivalentinį kiekį DMSO. Plokštelė buvo inkubuojamos 37 ° C temperatūroje, 5% CO 2 sudrėkintas atmosferoje 7 valandas, po to ląstelių morfologija buvo perimta su fazinio kontrasto mikroskopu (IX71, Olympus, Hamburgas, Vokietija).

Western Blot

Mobilusis lizatas buvo parengta Ripa buferio ir kiekybiškai pagal bicinchoninic rūgštis (BCA) metodu (Pierce, Rockford, IL). Trisdešimt mikrogramų baltymo vienam mėginio buvo pakrautas ant 4~12% NuPAGE® Novex SDS gelio (Invitrogen). Baltymų buvo perkeltas kurį iBlot® sausoje blotingo įrenginio (Invitrogen) nitroceliuliozės membranas. Po blokavimo nespecifinis privalomas su TBS /Tween20 (0,1%) (TBS /T), kurioje yra 5% lieso pieno 1 val kambario temperatūroje, to membraną fosfo-Aurora A (Thr288) (C39D8) triušis monokloninis antikūnas ( Mobilusis Signalizacijos technologijos CSTij9 Beverly, MA) arba PHOSPHO-Histono H3 (Ser10) triušis polikloninis antikūnas (BSTϊ1) (1:1000 į TBS /T yra 3% galvijų serumo albumino (BSA) ir švelniai pakratyti ne 4 ° C temperatūroje per naktį. po to membraną plaunamas TBS /T tris kartus pašalinti nesurištam antikūną, tada inkubuojami su antriniu antikūnu (HRP-konjuguoto ožkos anti-pelės IgG arba ožkos anti-triušio IgG, 1:10000, KangChen Biotech ", Šanchajus, Kinija) 1 val kambario temperatūroje, atitinkamai. Baltymų juostos buvo ryškinamos su patobulinta chemiluminescencja (ECL) komplektas (Pierce, Rokfordas, Ilinojus).

Imunofluorescentinis

pasėtų ląstelių ant kameros skaidres buvo nustatytas 4% paraformaldehido kambario temperatūroje, tada laidžiomis su 0,15% Triton-X100 į TBS ir blokavo 3% BSA TBS /t. pirminės antikūnus (PHOSPHO Aurora A (Thr288) (BSTĵ7), PHOSPHO -Histone H3 (Ser10) (CSTϊ1) ir MPM2 (anti-fosfo-Ser /Thr-Pro), "Millipore-368) buvo inkubuojamos su skaidres drėgnoje kameroje, esant 4 ° C temperatūroje per naktį. Antriniai antikūnai Alexa Fluor® 488 ožkos anti-triušio IgG (H + L) arba Alexa Fluor® 594 ožkos anti-pelės IgG (H + L) (INVITROGEN) buvo taikomi atitinkamai už vieną valandą po skaidrės buvo plaunami TBS kruopščiai. Po Neribojama antikūnai buvo pašalintas, skaidrės buvo išdžiovinti ir montuojamos DAKO antifide montavimo terpėje. Vaizdai buvo perimta su IX71 pagal atitinkamas žadinimo ir emisijos filtrai.

tėkmės citometrijos

DNR kiekis buvo matuojamas FACS-Calibur citometre (Becton Dickinson, San Chosė, Kalifornija) ir ląstelių ciklo paskirstymo buvo apskaičiuotas kaip aprašyta anksčiau [18].

tubulino in vitro
polimerizacija Analizės

in vitro
tubulino polimerizacija tyrimas buvo atliktas taip, kaip aprašyta anksčiau [18 ]

vienkartinės dozės farmakokinetikos (SDPK) tyrimas

naudojimu ir priežiūra eksperimentinių gyvūnų buvo patvirtintas pagal institucinius gyvūnų priežiūrai ir naudojimui komiteto Roche R &. d centras (Kinija). Vyras nuogas pelėms (kūno svoris 19 į 24 G) buvo naudojami SDPK tyrimas. Prieš farmakokinetikos tyrimo duomenimis, gyvūnai buvo atsitiktinai skiriamas ėminių ėmimo grupių (3 gyvūnai per laiko momentu). Dešimt papildomų pelėms buvo naudojamas surinkta plazmos tuščias kalibravimo kreives. Pelės nemaitinami, per naktį prieš vartoti per burną.

Kraujo mėginiai buvo surinkti šviesą-orbitos pradūrimo kuris vykdomas iš anksto dozės ir 0,033, 0,083, 0.25,0.5, 1, 2, 4, 6, 8, ir 24 valandų po dozės. Plazmoje mėginiai ir dozės kompozicija buvo laikomi -20 ° C temperatūroje, kol bioanalysis. Duomenų rinkimo ir kontrolės sistema buvo sukurta naudojant analitikas 1.4 programinę įrangą iš "ABI Inc. koncentraciją plazmoje žemiau kiekybinio riba (LOQ = 1 ng /ml) buvo paskirtas nulio. Farmakokinetikos duomenų analizė buvo atlikta naudojant noncompartmental analizės modulius WinNonlin Professional v5.2 (Pharsight, JAV) .Sriegines biologinis prieinamumas buvo apskaičiuota kaip F (%) = (dozė IV × AUC PO (0-∞)) /(dozė PO × AUC IV (0-∞)) * 100%. Dėl žiurkių, šunims ir beždžionėms SDPK, kraujo mėginiai buvo imami iš jungo venos punkcija.

ksenografiniuose veiksmingumo tyrimas su ląstelių linijų ir paciento Išvesta Navikai

naudojimu ir priežiūra eksperimentinių gyvūnų buvo patvirtinta institucinis gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas Roche & D Center "(Kinija). Naviko ląstelės buvo pasėta į dešinio krašto BALB /C Nu /Nu
moterų nuogas pelėms (5~6 savaites, 16~18 G, gautų iš Kinijos ir Didžiosios Britanijos SIPPR /BK Lab. Gyvūnų Ltd, Šanchajus, Kinija) optimaliu tankio remiantis mūsų in-house tinkamumo patvirtinimo tyrimą. Po navikas buvo įkurta ir pasiekė 100~150 mm 3, pelėms buvo randomizuoti į dešimt pelių vienoje grupėje ir pagal grafiką gydyti. Navikas augimas buvo stebimas tris kartus per savaitę su ilgio (L) matavimo ir plotis (W) pagal slankmačiu, ir apskaičiuojamas taip naviko tūrio (TV, mm 3) = 0,5 * L * W * W (mm) , Navikas augimo slopinimas buvo apskaičiuota kaip TGI% = (1- (vidurkis tiriamojoje naviko tūrį pirmąją dieną-vidutinis naviko gydymo grupės apimties galutiniam dieną) /(vidurkis kontrolinėje grupėje auglio apimtis pirmas dieną vidutinė naviko tūris kontrolinės grupės dėl galutinio dieną)) × 100%. buvo apibrėžta naviko regresiją individualaus pele -. navikas tūris pabaigoje buvo mažesnis nei naviko tūrio, kai gydymas buvo pradėtas

žmogaus pirminių navikų modelių, švieži žmogaus skrandžio navikų audiniuose buvo tiesiogiai implantuojami į nonobese cukriniu diabetu ir sunkus kombinuotas imuninė trūkumas (NOD-SCID) pelėms per 5 valandas po operacijos su 5 mm 3 fragmentai nustatyti pirminio naviko ksenografiniuose modelius. Kiekvienas navikas modelis buvo tikrinamas ne mažiau kaip trys serijos vivo
ištraukas parodyti prigijimą stabilumą. Navikai iš ištraukas 4-7 buvo po oda pasėta troakarų į dešinę kraštais BALB /C Nu /Nu moterų nuogas pelėmis (5~6 savaites, 16~18 g). Gydymo prasidėjo, kai navikas apimtis sudarė 100~150 mm 3. Navikas matavimas ir valdymas protokolas buvo toks pats kaip ląstelių linijos gauto naviko modelį.

imunohistocheminis

8 mkm parafine naviko audinio skaidres, pagaminti iš auglio in vivo, pervežimas veiksmingumo tyrimai buvo kaitinamas sauso džiovinimo spintoje, esant 60 ° C temperatūroje 1 valandą, tada deparaffinized ir hidrolizuotas kambario temperatūroje Leica autostainer XL ST5010. Antigenas paieškos buvo atliktas 95~99 ° C citrato buferio (0,01 M, pH 6,0) į pašildytą iki 92-98 ° C temperatūroje, naudojant medicinos mikrobangų 5 min, tada atšaldomas iki kambario temperatūros. Tada peroksidazės blokavimo reagentas (DAKO, DK-2600, Glostrup Danija) buvo taikomas numalšinti vidinį peroksidaze. Skaidrės buvo inkubuojami blokuoja serumą 20 min, tada apėmė 100 įxL PHOSPHO Aurora A (Thr288) (C39D8) Triušis mAb (BSTij9, 1:200 į TBS /T) arba triušio prieš žmogaus CD31 polikloninis antikūnas ( Santa Cruz Biotech ", SC-8306, Santa Krusas, Kalifornija, JAV; 1:200 į TBS /T), esant 4 ° C temperatūroje per naktį, tada inkubuojami 100 iL DAKO Įsivaizduoti + /HRP, triušis /pelė po to kruopščiai nuplauti TBS. Šimtas mikro litrų substrato-chromogeninių tirpalo (DAB), yra susiję su skaidres ir inkubuojami kambario temperatūroje 10 min. Skaidres buvo atidžiai nuplauti vandeniu iš čiaupo 15 min. Kontrasto ir dehidratacija buvo atliekamas kambario temperatūroje XL ST5010. Galiausiai, skaidres buvo sumontuoti su Permount montavimo terpės (Fisher Scientific, Majamis, FL).

Dozė intervalo nustatymo ir toksiškumo tyrinėjimo

dozių diapazonas išvada ir toksikokinetinė tyrimas buvo atliktas žiurkėms ir Biglis šunys remiantis in vitro
identifikuoti metabolitus. Wistar žiurkių (Vyras: 3, Panelių 3 kiekvienoje grupėje, iš Vital upės, Pekinas, Kinija) buvo pasninkavo per naktį, o tada gavo bandomųjų gaminių kaip 0, 6,25, 50 ir 100 mg /kg du kartus per dieną vienam per zondą už 14 įvedimo dienos nuolat režimas. Judrumas pastebėjimas buvo taikomas kasdien bazių rasti didžiausią tolerantišką dozė gyvūnams. Gyvūnai buvo paaukotas ant D14 ir taip toksikologija stebėjimas buvo atliekamas įskaitant kūno svorio pasikeitimų, klinikinius stebėjimus, bendrasis skrodimas, hematologijos chemija ir histopatalogiją. Birželio 1 dieną ir dieną 14 kraujo mėginiai buvo gauti per jungo venų punkcijos iš visų gyvūnų (jei gyvas, naudojant EDTA K2 vamzdžiai). Mėginiai buvo švelniai sumaišomas ir ant smulkinto šlapias ledas, kol centrifuguojant, kuris buvo atliekamas nedelsiant. Mėginiai buvo centrifuguojamas maždaug 15 minučių, esant 4 ° C 2,700 rpm. Gautas plazmos buvo atskirta, perduoti vienareikšmiškai žymėtųjų aiškiais polipropileno vamzdžių ir užšaldyti iš karto per kietas anglies dioksido (sausas ledas), iki patenka į maždaug -80 ° C temperatūroje. Kiekvienas gyvūnas buvo nuleistas kraujas ne toliau nurodytų terminų kiekis: maždaug 5 minutės, 15 minutės, 30 min, 1, 2, 4, 8 ir 24 valandoms po jo suvartojimo pirmoji dozė nuo konkretaus dieną. Narkotikų koncentracijos kraujo plazmoje buvo nustatomas pagal LC-MS /MS. Farmakokinetikos analizė atlikta naudojant WinNonlin programinė įranga (Versija 5.2, Pharsight korporacija, Kalifornija, JAV), ir farmakokinetiniai parametrai buvo apskaičiuoti naudojant nesekcijinį modelio metodą.

bigliams (maždaug 8-10 mėnesių nuo Pekinas Maršalo biotechnologijos Co Ltd, Pekinas, Kinija) buvo atliktas į tyrimo protokolą, kaip aprašyta aukščiau. Kiekviena grupė turi bent vieną jo vyrų ir vieną moterų šuo, kuri bandymo straipsnyje dozės buvo: 0, 1, 7,5 ir 15 mg /kg kūno svorio, atitinkamai. Naudojimas ir priežiūra eksperimentinių gyvūnų buvo patvirtintas pagal institucinius gyvūnų priežiūrai ir naudojimui komiteto Roche R &. D Center (Kinija)

Duomenų analizė ir statistika

Nepriklausomos t testas buvo naudojamas nuolat duomenys analizė ir χ2 testas buvo taikomas kategorinių duomenų. Duomenys buvo laikomi reikšmingais, kai p reikšmės buvo. ≪ 0,05

Rezultatai

1. Apibūdinimas R1498 kaip daugelio kinazių inhibitorius

Pyrazolobenzodiazepine analoginis R1498, su pastoliais remiantis benzodiazepino ir pirazolo žiedas (1a pav) sintezės, anksčiau buvo nustatyta, kad silpnas cikloniniai priklausoma kinazės 2 (CDK2) inhibitorius [19]. Ši molekulė parodė tam kinazių inhibitorius pobūdį, kai mes išanalizavo kinazės inhibitorius biblioteką. Kinazė slopinimas profilis R1498 (1 pM) buvo būdingas per KINOMEScan® ne ATP koncentracijos aplink kiekvieną kinazės Km. Slopinimas norma R1498 yra daugiau kaip 80%, palyginti su 39 kinazės iš 402 kinazės, įskaitant 359 laukinio tipo kinazės ir 43 kinazės mutantų (S1 paveiksle). Disociacijos konstantos (Kd) 39 hit kinazės tada buvo nustatyta, o kinazės su Kd < 0,2 mkm buvo parodyta 1B pav. Dauguma potencialių hitai priklauso tirozino kinazės (TK) šeimos ir AGC šeima. Be to, Z-Lyte tyrimas buvo atliktas naujo nustatoma kinazės slopinimo aktyvumą iš R1498. Rezultatai parodė, kad IC50s apie R1498 buvo 25 ± 6, 67 ± 4, 167 ± 13 nm bangos ilgiui KEAFR 2, Aurora kinazės A ir B, atitinkamai (1c pav). Tada mūsų tyrimas buvo sutelktas į antiangiogeninis ir anti-mitozės būdų majorly nukentėjo R1498.

16 vėžio ląstelių linijas, įskaitant kepenų vėžį, skrandžio vėžiui ir nosiaryklės karcinomą ląstelių linijų panelė, buvo naudojamas siekiant nustatyti in vitro
kovos neplatinimas gebėjimas R1498. Dauguma ląstelių linijų yra įsteigta iš Azijos vėžio, kaip Azijos paplitę vėžio yra mūsų dėmesys. Hepatokarcinoma ir skrandžio vėžio ląstelių linija panelė buvo jautresni R1498 gydymo nei nosiaryklės vėžio ląstelių linijas. Bendras vidutinis IC50s buvo 7.81, 7.55 ir 30.07 m, atitinkantis epatocellular karcinoma, skrandžio vėžiui ir nosiaryklės karcinomą ląstelių linijas, atitinkamai. Ląstelių linijų, gautų iš Azijos gyventojų (BEL-7402, QGY-7701 ir QGY-7703) jautrumas buvo panaši į Hep3B jautrumo, kuris buvo iš Kaukazo (1d pav.)

2. R1498 slopina Aurora kinazės ir skatina ląstelių ciklo arešto

"Aurora kinazės slopinimas R1498 buvo ryškinamos imr.rnofluorescencija skrandžio vėžio ląstelių linijos SGC-7901. Tiesioginiai fosforilinimo vietos fosfo-Aurora kinazės A (T288) ir fosfo-histono H3 (S10) buvo naudojamas nurodyti kinazės aktyvumą Aurora A ir B, atitinkamai [20], [21]. PHOSPHO-Ser /Kt Pro Mitozinis baltymų monokloninis(MPM2) buvo naudojamas kaip mitoziniam persekiotoją (raudona) Ženklinant mitozės ląstelių. Aurora kinazės A (T288) fosforilinimo įvyksta mitozės ląstelių (žali) Centrosoma. Po ląstelės buvo gydomi 5 pm MR1498 24 h, "Aurora T288 žalia židiniai ir mitozės ląstelių tapo silpnesni arba dingo (2a pav viršutinis skydelis), rodo, kad Aurora kinazės A veikla sumažėjo nuo R1498 gydymą. Iš Histonas H3 fosforilinimas (S10) daugiausia lokalizuojasi apie mitozės ląstelių centromeras. Po ląstelės buvo gydomi R1498, The PHOSPHO-iuose H3 (S10) smarkiai sumažėjo (žalia spalva). Šis pastebėjimas leidžia manyti, kad Aurora kinazės B veikla taip pat sumažėjo nuo R1498 gydymą. Šie rezultatai iš imr.rnofluorescencija buvo patvirtinta Vakarų dėmė. Kaip parodyta 2B paveiksle, iš PHOSPHO-Aurora kinazės A (T288) ir PHOSPHO-iuose H3 (S10) fosforilinimo sumažėjo koncentracijos priklausomu būdu ūminio elgesio R1498.

slopinimas Aurora kinazės A ir B gamina įvairių fenotipo pokyčius ląstelės ciklo. Slopinimas Aurora "A sukelto ląstelių ciklo G2 fazės areštas [22], o slopinimas nuo Aurora kinazės B Pranešama, kad sukelti poliploidiją ląstelėse dėl endoduplication be citokinezė [15]. Po ląstelės buvo gydomi 10 mikromolių R1498, tiek SGC-7901 (skrandžio vėžys ląstelių) ir BEL-7402 (kepenų ląstelių karcinoma ląstelių) parodė G2 /M fazių suėmimą ir kaupimą Poliploidinių ląsteles. Dėl BEL-7402, ląstelės platinti G2 /M fazės padidėjo nuo 25,6% iki 57.0%, tuo tarpu, ląstelės su > 4 N. DNR kiekis padidėjo nuo 6,7% iki 17,6%. SGC-7901 buvo jautresni, su G2 /M gyventojų padidėjo nuo 25,2% iki 75,5%, o poliploidiniai ląstelės išaugo nuo 3,1% iki 21,6% (2c pav). Mikrotubulės stabilizatorius (pavyzdžiui, taksolio) ir destabilizer (pavyzdžiui, kolchicino) sukels G2 /M fazės suimti, taip pat. Norėdami suprasti, ar R1498 yra mikrotubulės skirta reagentas, in vitro
tubulino polimerizacija tyrimas buvo atliktas. Duomenys parodė, kad R1498 nei stabilizavosi, nei sutrikdė mikrotubulės polimerizacija net esant aukštam R1498 koncentracijos (40 mikromolių) in vitro
(2D paveikslas), o tai rodo, kad ląstelės ciklo G2 /M areštas sukėlė ne mikrotubulės citoskeleto trikdžių. Kartu paėmus, šie duomenys rodo, kad R1498 slopino Aurora kinazės A ir B ląstelių ir pateikė fenotipo pokyčius ląstelėse.

3. R1498 antagonizmą angiogenezę pažangą žmogaus endotelio ląsteles

Angiogenezė buvo inicializuoti sekrecijos angiogeniniai augimo faktoriaus iš vėžinių ląstelių, tada endotelio ląstelės dauginasi, migruoti ir forma laivų vamzdžiai ir atsakymuose į VEGF stimuliacijos. Spręsti R1498 specifiką antagonizuojančiam endotelio ląstelių augimą stimuliuoja VEGF, žmogaus bambos venos endotelio ląstelių (HUVECs) buvo veikiami dviejų skirtingų dirgiklius, VEGF ir FBS, pagal R1498 gydymo 72 val. Pagal kultūros sąlygomis, kurių sudėtyje yra VEGF arba FBS, HUVECs parodė skirtingą atsakymą į R1498. Į IC50s buvo 89 ir 2064 Nm VEGF ir FBS, atitinkamai; tai rodo, kad R1498 slopinti į HUVEC augimą orientuotus VEGF stipresnis nei FBS (3a pav.) Be HUVEC vamzdis formavimosi tyrime, po 8 val poveikio R1498, HUVECs suformuota mažiau nepaliestas tube akis negu DMSO gydytų grupių (3b pav.) R1498 nepaveikė HUVEC platinimu pagal šį gydymo būklės (duomenys neparodyti).

4. R1498 slopina žmogaus vėžio ksenoimplantai

farmakokinetinių savybių turinčių vieną dozę R1498 į buvo nustatyta keletas rūšių augimą. Pusinės eliminacijos laikas (t1 /2) ir žodžiu biologinis prieinamumas (žodžiu BA%) skatina toliau veiksmingumo tyrimas, nuogas pele (lentelė S1) su du kartus per parą per zondą grafiką. Iš audiniuose, įskaitant Azijos skrandžio vėžio, kepenų vėžį ir nosiaryklės vėžiu panelė dirbo palyginimui tarp R1498 ir kita kinazių inhibitorius sorafenibu (4 pav, stalo S2). Sorafenibas yra patvirtintas kaip pirmos eilės gydymą kepenų vėžį [2], yra klinikinio tyrimo dėl kombinatorinė terapija išplitusiu skrandžio vėžiu [23]. Paralelinis palyginimas sudarė naviko augimo slopinimas, regresijos ir kūno svorio pokyčiai gyvūno su dozavimo 25 mg /kg, du kartus per parą vienam žodžiu. Visų tirtų audiniuose,, R1498 parodė geresnį naviko augimo slopinimo greitis (TGI%) per sorafenibu. Dėl kepenų vėžį, The TGI% nuo R1498 yra 10-19% daugiau nei TGI% sorafenibo, skrandžio vėžio, 2-12% per TGI% sorafenibo. Regresijos norma naviko taip pat buvo įtrauktas kaip kito terapinio pasekmės. Be kepenų vėžį skydelyje, naviko regresija buvo pastebėtas BEL-7402 modelio, 8/10 (80%) gyvūnai buvo regresiją R1498 grupės, o 1/10 (10%) šalutiniai gyvūniniai turėjo regresiją sorafenibo grupės (4 pav BEL-7402) , Skrandžio vėžio skydelyje MSV-803 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ksenoimplantai turėjo tą pačią regresijos norma reaguojant į bandomųjų gaminių: 5/10 (50%) už R1498 ir 2/10 (20%) už sorafenibu (4 pav, SGC -7901, ir lentelė S2),. Remiantis vertinamosios baigties iš visų 7 išbandytų modelių, R1498 yra veiksmingesnės už Sorafenibas pagal tą pačią gydymo grafiką. Be to, R1498 parodė gerą veiksmingumą viename nosiaryklės ksenotransplantanto, TGI% iš R1498 (90%, 25 mg /kg kūno svorio, du kartus per parą, už per zondą) buvo pranašesnis per standartą neatsargaus ciklofosfamido (60%, kas 10 dienų, Intraperitoninis įpurškimas) (4 pav CNE-2). Kūno svorio pokyčiai, kurie buvo įrašyti į visų modelių toksiškumo palyginimas parodė, kad nuogas pelės visą gydymo BEL-7402, SGC-7901 ir CNE-2 modelių metu parodė daugiau toleruotinos R1498, nors kūno svorio padidėjimas šiek tiek sumažėjo per 10 dienų po gydymas (4 pav, Stalo S2),. Tačiau sorafenibas sukelia nuolatinį lašą į gyvūno kūno svorį. Dėl sorafenibo apdorotą pele Bel-7402 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 modelių, kūno svorio procentais viršijo 15% nutraukimo dienos. Kaip parodyta S2 lentelėje R1498 parodė mažesnį poveikį pelių kūno svorio nei Sorafenibo padarė, kuris teigė, kad R1498 vyksta geriau saugumas.

5. R1498 Down reguliuoja fosforilinimo Aurora A ir kraujagyslių Tankis naviko

fosforilinamos "Aurora A (T288) ir CD31 navikuose iš veiksmingumo tyrimo buvo naudojami nustatant on-taikinio poveikio R1498. Išgauta iš BEL-7402 ksenografiniuose tyrimo naviko masė buvo parengtas į parafino įdėta skaidres ir taikomos immunohistochemisty vizualizavimo angiogenezę virimo aparatas žmogaus CD31 ir "Aurora kinazės A veikla žymeklis PHOSPHO-Aurora A (T288). Bel-7402 auglių CD31 dažymo R1498 gydymo grupių sumažėjo nuo dozės priklausomu būdu, kuris pasiūlė navikuose vaskuliarizacijos buvo slopinamas (5a pav). Aurora kinazės A veikla taip pat buvo sumažintas nuo R1498 gydymo, kuris rodė silpnesnės dažymo PHOSPHO Aurora A (T288) ir R1498 elgiamasi navikų (5b pav.)

Žmogaus pagrindinis skrandžio navikas kilęs svetimo modelio buvo atliekami, siekiant numatyti, kad klinikinei efektyvumą. Vėžinės audiniai iš trijų atskirų skrandžio vėžiu sergantiems pacientams buvo persodinti į pele ir ksenoimplantai apibrėžtos skirtingų augimo kreives in vivo
. Į ksenoimplantai parodė skirtingą poveikį kūno svorio pokyčių šeimininkai. Pelėms buvo gydomi R1498 (25 mg /kg) už nurodytą laikotarpį, galutinis TGI% pasiekė 73,6 ~ 91,6%, su regresijos normos 10~30%. Riboti kūno masės pokyčiai rodo, kad navikas guolis pelėms buvo gerai toleruoja R1498 (6 paveikslas).

6. R1498 turi gerą farmakokinetikos pobūdis (PK) ir terapinio lango

SDPK nurodė, kad priimtinas biologinis prieinamumas ir pusinės eliminacijos periodui savybės R1498 tarp nuogas pelių, žiurkių ir šunų (lentelė S1). Susumavus kepenų mikrosomų buvo naudojami prognozuoti pagrindinius metabolitus skirtingų rūšių. Žiurkė ir Biglis šuo su panašiomis mikrosomų metabolitų žmogaus buvo naudojami maksimaliai tolerantiškas dozė (DTD) tyrimas, siekiant nustatyti terapinį langą tarp efektyvių ir toksiškų pozicijų (lentelė S4). Moteris ir vyrai žiurkė skirtingą atsakymą į pratęstus dozių R1498.

  • skrandžio vėžys

    • skrandžio vėžys

    skrandžio vėžys

    Other Languages

    skrandžio sveikatos © https://www.stomachillness.com/lt