PLoS ONE: MYC Deregulering bij maagkanker en haar clinicopathologische Implicaties

Abstract

Onze studie onderzocht de relatie tussen de MYC
wijzigingen en clinicopathologische functies in maagkanker. We evalueerden het effect van MYC
mRNA en eiwit immunoreactiviteit, alsmede kopieaantal variant promoter DNA methylering en puntmutaties in 125 maagdarmkanker en 67 paried niet-neoplastische weefsels. We vonden dat 77% van de tumoren gepresenteerde MYC immunoreactiviteit die geassocieerd is met verhoogde mRNA expressie ( p
< 0,05). Deze observaties werden geassocieerd met diepere tumoruitbreiding en de aanwezigheid van metastase ( p
< 0,05). MYC eiwit expressie werd ook vaker waargenomen in de darm-type dan in diffuse-type tumoren ( p Restaurant < 0,001). Bovendien, MYC
mRNA en eiwit expressie waren significant geassocieerd met een aantal kopieën ( p Restaurant < 0,05). De winst van de MYC
kopieën werd geassocieerd met late-onset, intestinale-type, geavanceerde tumor stadium, en de aanwezigheid van verre metastase ( p Restaurant < 0,05). Een hypomethylated MYC
promotor werd gedetecteerd in 86,4% van de tumor samples. MYC
hypomethylatie werd geassocieerd met diffuse-type, geavanceerde tumor stadium, dieper tumor uitbreiding, en de aanwezigheid van lymfeklier metastase ( p Restaurant < 0,05). Bovendien achttien tumormonsters gepresenteerd ten minste één bekende mutatie. De aanwezigheid van MYC
mutaties werd geassocieerd met diffuse-type tumor ( p Restaurant < 0,001). Onze resultaten toonden aan dat MYC
deregulering vooral geassocieerd met slechte prognostische factoren maar ook versterkt de aanwezigheid van verschillende routes betrokken bij intestinale-type en diffuse type maagkanker. Zo, onze bevindingen suggereren dat MYC
kunnen een nuttige merker voor klinische stratificatie en prognose

Visum:. De Souza CRT, Leal MF, Calcagno DQ, Costa Sozinho EK, Borges BdN, Montenegro RC, et al. (2013) MYC
Deregulering bij maagkanker en haar clinicopathologische implicaties. PLoS ONE 8 (5): e64420. doi: 10.1371 /journal.pone.0064420

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Ontvangen: 30 januari 2013; Aanvaard: 12 april 2013; Gepubliceerd: 22 mei 2013

Copyright: © 2013 de Souza et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. De auteurs zijn dankbaar voor Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; CRTdS, AKCRdS, SEBdS, RRB en MdACS) en Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; DQC en MFL) dat deze studie als subsidies en beurzen te ondersteunen. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is de vierde meest voorkomende vorm van kanker en blijft de tweede belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd [1]. Deze vorm van kanker wordt meestal gediagnosticeerd in een vergevorderd stadium en de enige curatieve therapie beschikbaar vereist chirurgische resectie [2]. Aldus maagkanker is een ernstig probleem voor de volksgezondheid in de wereld. Een beter begrip van de biologie van deze neoplasma kritisch en kan nuttig zijn voor behandeling van de patiënt te leiden, en om nieuwe therapeutische opties worden onderzocht.

MYC
is een van de meest bestudeerde oncogenen voortvloeiende van de associatie met een groot aantal ziekten [3]. MYC speelt een rol in verschillende basisfuncties van celbiologie, waaronder de regulering van celgroei en proliferatie, metabolisme, differentiatie, apoptose en angiogenese (voor review zie [4], [5]). Derhalve MYC een integrator van extracellulaire en intracellulaire signalen en het cellulaire fenotype afhankelijk weefsellocatie [6], [7]. Niet verrassend, deregulering van MYC functies draagt ​​bij aan de tumor fenotype.

MYC
deregulering als gevolg van genamplificatie [8], [9], translocatie of insertie [10], [11] mutaties [12] en epigenetische veranderingen [13], [14], is gemeld bij verschillende soorten kanker, met name bij maagkanker. MYC expressie wordt vaak verhoogd of gedereguleerde in menselijke gezwellen [4], en lijkt te zijn op het kruispunt van een aantal belangrijke trajecten en processen die betrokken zijn bij het ontstaan ​​van kanker [15], die een belangrijke gebeurtenis in de maag carcinogenese [9]. Voorheen onze groep aangetoond dat MYC
mRNA expressie en kopieer aantal neemt toe tijdens de opeenvolgende stappen van intestinale-type maagkanker in een niet-menselijke primaat model [16], wat suggereert dat MYC
kan zij worden betrokken bij de maag tumor initiatie en progressie.

het begrip van MYC
biologie is van het allergrootste belang is voor haar rol toe te lichten in de pathogenese van maagkanker. Tot op heden is er geen studie correleren MYC
mutatie, versterking, eiwit /mRNA-niveaus, en methylatie in deze neoplasie. Hier, evalueerden we de relatie tussen de MYC
wijzigingen en clinicopathologische functies bij maagkanker. Daarnaast MYC
mRNA en eiwit immunoreactiviteit, evenals verschillende moleculaire mechanismen die eerder in verband met de deregulering copy number variation (CNV), mutatie en DNA methylatie, geanalyseerd in dezelfde set maagkanker samples.

Materialen en methoden

Ethics Verklaring

Alle monsters werden afgeleid met schriftelijke informed consent en goedkeuring van het Universitair Ziekenhuis (Belém, Pará, Brazilië) ethische review boards ( protocol nummer. 142004)

klinische monsters

125 adenocarcinoom van de maag en 67 overeenkomstige niet-neoplastische maag weefsels (controlemonsters) werden chirurgisch verkregen van patiënten van het João de Barros Barreto University Hospital in Pará State, Brazilië. Alle proefpersonen werden niet blootgesteld aan chemotherapie of radiotherapie voor de operatie. Maag-tumoren werden geclassificeerd volgens Lauren [17] en tumoren werden opgevoerd met behulp van standaard criteria door TNM enscenering [18]. De klinische en pathologische kenmerken worden weergegeven in tabel 1 en 2.

De ontlede tumor en controlemonsters werden snel ingevroren in vloeibare stikstof tot nucleïnezuur zuivering. Een ander deel van hetzelfde weefsel was formaline gefixeerd en in paraffine ingebed. Voor de fluorescerende in situ
hybridisatie (FISH) analyse, werd de overblijvende tumormonster uitsplitsingen eerder beschreven [19].

MYC immunoreactiviteit

immunohistochemische analyses van MYC eiwit waren uitgevoerd op 125 formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde tumorsecties. Immunohistochemische kleuring werd uitgevoerd volgens Calcagno et al.
[10]. Tumor weefselcoupes (3 of 4 mm dik) werden van paraffine ontdaan in xyleen en gerehydrateerd in een gegradeerde reeks van ethanol. Na warmte-geïnduceerde epitoop werden de weefselcoupes geïncubeerd met primair monoklonaal muizenantilichaam tegen MYC (verdunning 1:50, SC-40, Santa Cruz Biotechnology, USA en Zymed®, USA). Een universele peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam kit (LSAB System, DakoCytomation, USA) werd gebruikt voor het detectiesysteem. We gebruikten 3,30-diamino-benzidine /H _{2O 2 (DakoCytomation, Denemarken) als chromogeen en hematoxyline als tegenkleuring. Nucleaire vlek met of zonder cytoplasmatische kleuring werd als een positief resultaat, ongeacht intensiteit. Een MYC-positieve zaak werd gedefinieerd als één die 10% of meer tumorcellen positief voor dit eiwit.}

nucleïnezuurextractie

De genomisch DNA (gDNA) werd geëxtraheerd met behulp van de QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. Totaal RNA werd geëxtraheerd met Tri-reagent® (Life Technologies, USA) volgens het protocol van de fabrikant. DNA- en RNA-concentratie en kwaliteit werden bepaald met de NanoDrop spectrofotometer (Kisker, Duitsland). RNA integriteit werd bepaald door gelelektroforese (1% agarose gels). Alle monsters werden opgeslagen bij -80 ° C tot gebruik.

MYC
mRNA

Om mRNA niveaus kwantificeren MYC
, totaal RNA werd geïsoleerd 49 van gepaarde normale en tumorweefsels met behulp van Trizol (Life Technologies, USA). Het RNA werd omgekeerd getranscribeerd met behulp van de High-Capacity cDNA Archive kit volgens het protocol van de fabrikant (Life Technologies, USA). Complementair DNA werd vervolgens geamplificeerd door real-time PCR met de TaqMan probes verkoop Assays-on-demand Producten voor genexpressie (Life Technologies, USA) op een 7500 Fast Real Time PCR (Life Technologies, USA). GAPDH
gen werd geselecteerd als een interne controle voor RNA-input en reverse transcriptie efficiëntie. Alle real-time reverse transcriptie van kwantitatieve PCR (RT-qPCR) werden in drievoud uitgevoerd voor zowel de target-gen ( MYC
: Hs00153408_m1) en interne controle ( GAPDH Twitter: NM_002046.3).

de relatieve kwantificatie (RQ) van de genexpressie werd berekend volgens Livak en Schmittgen [20]. Het overeenkomstige controle monster werd aangewezen als een calibrator uit elke tumor.

MYC
aantal kopieën

FISH en qPCR werden gebruikt om evalueren MYC
aantal kopieën in een subset van 49 tumoren, dezelfde die in de studie van de expressie. FISH werd uitgevoerd volgens het protocol van Pinkel et al.
[21] met de wijzigingen die bij Calcagno et al.
[22]. De cellen werden gehybridiseerd met Spectrum Orange
Probe (LSI Vysis /Abbott, Inc., IL) voor de MYC
gen regio (8q24.12-q24.13) en kernen werden tegengekleurd met 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol antifade. Fluorescentie werd gedetecteerd onder gebruikmaking van een Olympus BX41 fluorescentie microscoop (Olympus, Japan) met excitatie filters voor 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (260 nm) en rhodamine (570 mn). Voor elk geval werden 200 interfase kernen geanalyseerd met behulp van een ASI beeldanalyse-systeem (Applied Spectral Imaging, Israël). Positief MYC
gen signalen verscheen als rode vlekken in de kernen en werden gescoord met behulp van de criteria van Hopman et al.
[23]. Om misverstanden te voorkomen als gevolg van een technische fout, normale lymfocyten kernen en de normale maag weefsel werden gebruikt als een controle. De FISH resultaten werden gepresenteerd als percentage MYC
amplificatie door een cel waarin berekenden we het percentage cellen toont 3 of meer signalen voor de MYC
probe door cel.

qPCR werd uitgevoerd met behulp van kwantitatieve TaqMan CNV assays (Life Technologies, USA) voor de MYC
gen (Hs01764918_cn) en voor de interne controle RNAse P
(Ƹ3326). Multiplex qPCR reacties werden uitgevoerd in viervoud met gDNA volgens het protocol en fietsen voorwaarden van de fabrikant in 7500 Fast Real-Time PCR (Life Technologies, USA). Het relatieve aantal kopieën werd geschat voor elk monster met behulp van de Copy Caller Software V1.0 (Life Technologies, USA). Commerciële menselijke gDNAs (G1521 en G1471, Promega, USA) werden gebruikt voor de kalibratie

MYC
methylatie

De methylatie patroon en de frequentie van de MYC promoter werden geëvalueerd in 125 tumoren en 67 gepaard controlemonsters door Methyl-specifieke PCR (MSP) zoals eerder beschreven [24]. gDNA (2 ug) van alle monsters werd gemodificeerd door bisulfiet behandeling omzetten ongemethyleerde cytosinen te uracillen en verlaten gemethyleerde cytosins ongewijzigd [25]. Specifieke primers voor MYC
promoter is als volgt: F5'-TAGAATTGGATTGGGGTAAA-3 'en R5'-CCAACCAAAAATCAACATGAAT-3' voor de gemethyleerde reactie (verwachte product grootte van 291 bp); F5'-TAGAATTGGATCGGGGTAAA-3 'en R5'-CGACCGAAAATCAACGCGAAT-3' voor de gemethyleerde reactie (verwachte product grootte van 290 bp), zoals eerder beschreven [26].

PCR reacties werden uitgevoerd met 0,1 umol /L dNTP's, 2 umol /L MgCl _{2, 0,5 pmol primers, 1,25 U Taq DNA polymerase en 100 ng bisulfiet-gemodificeerd DNA. Na aanvankelijke denaturatie gedurende 5 minuten bij 94 ° C, 40 cycli bij 9 4 ° C gedurende 45 s, 52,4 ° C gedurende 45 s en 72 ° C gedurende 30 s werden herhaald, gevolgd door een laatste verlenging gedurende 5 minuten bij 72 ° C. PCR-producten werden direct geladen op 3% agarosegels en elektroforese. De gel werd gekleurd met SYBR® Safe DNA Gel Stain (Life Technolgies, USA) en direct zichtbaar onder UV-belichting. Als positieve controle van MSP reacties, een gDNA monster was volledig gemethyleerde CpG methylase gebruikt (SSSI, New England Biolabs, USA) volgens de instructies van de fabrikant. . Bovendien is de primers voor wild-type gebruikt om volledige omzetting van DNA verkregen in de bisulfiet reactie volgen}

De monsters werden gestratificeerd als: 1) hypomethylated monsters als positief amplificatieproduct alleen in de PCR werd gedetecteerd met specifieke primers voor niet-gemethyleerde sequenties; 2) gehypermethyleerd monsters als positief amplificatie alleen in de PCR met specifieke primers voor gemethyleerde sequenties gedetecteerd; 3) gedeeltelijke gemethyleerde monsters als positief amplificatie werd gedetecteerd in de PCR met de twee primer sets.

MYC
genotypering

De drie exons van de MYC
gen werden geselecteerd voor mutatieanalyse in alle 125 maagkanker monsters. De volgende primers werden ontworpen voor PCR amplificatie en sequencing: exon 1 F5'-TTTATAATGCGAGGGTCTGGA-3 'en R5'-GCATTCGACTCATCTCAGCA-3' (verwachte product grootte van 654 bp); exon 2 F5'-CTGCCTCCCGCTTTGTGT-3 'en R5'-TTTGATGAAGGTCTCGTCGT-3' (verwachte product grootte van 423 bp), F5'-TGGGAGGAGACATGGTGAA-3 'en R5'-TGCCAATGAAAATGGGAAAG-3' (verwachte product grootte van 507 bp); exon 3 F5'-TGTCCAGAGACCTTTCTAACGTAT-3 'en 5'-CCGTAGCTGTTCAAGTTTGTG-3' (verwachte product grootte van 663 bp), 5'-TGTCCGTCCAAGCAGAGG-3 'en 5'-TGATGAAAACAAACAGGGATG-3' (verwachte product grootte van 639 bp).

De PCR reacties werden uitgevoerd met 0,1 umol /l dNTPs, 2 umol /L MgCl _{2, 0,5 umol /l primers, 1 U Taq polymerase en 100 ng DNA uitgevoerd. De PCR-omstandigheden waren 95 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 35 cycli van 1 minuut denaturatie bij 95 ° C, 1 min annealing temperatuur (bereik 59-61 ° C), en 1 min verlenging bij 72 ° C. De amplicons werden gescheiden op een 2% agarose gel gekleurd met SYBR Safe DNA Gel Stain (Life Technolgies, USA) en is rechtstreeks zichtbaar gemaakt onder UV-belichting.}

amplicons werd de sequentie bepaald met de Sanger methode [27]. Directe sequentiebepaling werd uitgevoerd met behulp van de Big Dye® Terminatorv3.1 Cycle Sequencing kit (Life Technologies, USA) en geanalyseerd op een ABI PRISM® 3130 Genetic Analyzer (Life Technologies, USA) met behulp Pop 7 polymeer. De mutatie in silico onderzoek werd uitgevoerd met de Chromas Pro 1,5 (Technelysium Pty Ltd, Australië). De referentie-sequentie werd Gene ID: 4609 (NCBI). Varianten met minder dan 1% kleinere allel frequentie gemeld. Pathogeniciteit van missense mutaties werd bepaald door in silico analyse met behulp van PolyPhen (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/) en zeef (http://sift.jcvi.org).

Statistische analyse

MYC
methylatie, mutatie, of zijn producten immunoreactiviteit odds ratio (OR) voor clinicophatological functies werd geschat door logistische regressie. De leeftijd van de maag weefsel bemonstering werd gedefinieerd als covariaat in de regressie model.

De normaliteit van de distributie voor de kwantitatieve variabelen werd getest door testen van de Shapiro-Wilk's. Gegevens die niet normaal zijn verspreid werden getransformeerd (z-score transformatie) in een normale verdeling voor analyse. Analyse van de MYC
mRNA expressie en aantal kopieën werden uitgevoerd door de Algemene Linear Model (GLM) met correctie voor leeftijd, waardoor het effect formaat biedt en waargenomen vermogen (OP) van elke analyse. De grootte effect GLM analyses was gebaseerd op Eta Squared (η ^{2), waarbij 0,15 en lager bepaald als een klein effect size, 0,16-0,40 als middelmatige grootte en boven 0,40 een groot effect size.}

de correlatie tussen mRNA expressie en kopieaantal werd geanalyseerd door de Pearson test, waarbij een waarde van de correlatiecoëfficiënt (r) in 0,30 werd bepaald als een zwakke correlatie, 0,30-0,70 als medium correlatie en boven de 0,70 als een sterke correlatie.

In alle analyses, het betrouwbaarheidsinterval bedroeg 95% en p
waarden van minder dan 0,05 werd als significant beschouwd.

Resultaten

MYC
amplificatie is bekend met betrekking tot eiwitrijke /mRNA expressie in maagkanker [28], echter de beste weten, weinig studies uitgevoerd om de rol van methylering en beschrijven MYC
mutaties in dit proces. Om dit doel te bereiken, hebben we geanalyseerd 125 gevallen waarin de 68% waren mannen en 32% waren vrouwen. De gemiddelde leeftijd van onze steekproef set was 62 jaar (range van 26-89 jaar). Een iets hogere frequentie van intestinale-type (56,8%) en niet-cardiale (58,4%) werden tumoren waargenomen (Tabel 1 en 2).

MYC kerneiwit was positief in 76,8% gevonden (96/125) van maag tumoren (figuur 1). MYC eiwit expressie werd vaker waargenomen in de darm-type dan diffuse-type tumoren ( p Restaurant < 0,001, OR = 7,856, CI 95% = 2,803-22,013) (tabel 1). MYC immunokleuring werd ook geassocieerd met late-onset (p = 0,026, OR = 3,276; CI 95% = 1,152-9,315), dieper tumor uitbreiding ( p
= 0,045, OR = 2,975, CI 95% = 1.027 -8,623), en de aanwezigheid van verre metastase ( p Restaurant < 0,001, OR = 17,682, CI 95% = 3,914-79,882) (tabel 1). Bovendien zijn MYC immunoreactiviteit werd geassocieerd met een verhoogde mRNA expressie ( p
= 0,003, η ^{2 = 0,178, OP = 0.870) en MYC
aantal kopieën door FISH ( p
= 0,009, η 2 = 0,139, oP = 0,759) en qPCR ( p
= 0,003, η 2 = 0,177, oP = 0,869) (tabel 1).}

De expressie niveau van de MYC
mRNA was hoger in alle tumor samples dan hun gepaarde controles (RQ = 3,39 ± 0,14; range van 1,57-5,18). Een verhoogde MYC
mRNA expressie was geassocieerd met diepere tumor extensie ( p
= 0,006, η ^{2 = 0,152, OP = 0,801), de aanwezigheid van lymfeklier metastase ( p
= 0,023, η 2 = 0,107, OP = 0,632), en verre metastase ( p Restaurant < 0,001, η 2 = 0,788, OP = 1) (tabel 2 ). Daarnaast werd het mRNA-niveau direct gecorreleerd aan de MYC
aantal kopieën ( p Restaurant < 0,01; r = 0,716).}

Gain van MYC
kopieën werd gevonden in alle adenocarcinoom stalen door FISH en qPCR assays. Door FISH, het gemiddelde percentage cellen presenteren MYC
amplificatie was 72,1% (bereik van 50-83,5% cellen met amplificatie) (Figuur 2 A en B). Het gemiddelde van kopieën MYC
door qPCR was 4,5 (range 3-9 kopieën) (figuur 2 C).

FISH en qPCR analyses toonden aan dat de toegenomen MYC
aantal kopieën werd geassocieerd met late-onset ( p Restaurant < 0,001; η ^{2 = 0,257, OP = 0,976; p
= 0,025; η 2 = 0,103, OP = 0,662, respectievelijk), intestinale-type kanker ( p
= 0,037; η 2 = 0,091, OP = 0,557; p
= 0,009; η 2 = 0,139, OP = 0,762, respectievelijk), en de aanwezigheid van verre metastase ( p
= 0,001; η 2 = 0,221, OP = 0,942; p Restaurant < 0,001; η 2 = 0,356, OP = 0,999, respectievelijk). Daarnaast MYC
amplificatie door FISH werd geassocieerd met gevorderde tumorstadia ( p
= 0,037; η 2 = 0,091, OP = 0,558), maar slechts twee vroege tumoren in dit deel van de monsters (tabel 2) geanalyseerd.}

Alle maagkanker monsters gepresenteerd positieve amplificatie met een niet-gemethyleerd primer set. Interessant is dat 86,4% van de monsters kanker werden hypomethylated. Anderzijds, de aanwezigheid van gemethyleerde sequenties aan de MYC
promoter waargenomen in 28,4% van controlemonsters (gedeeltelijk gemethyleerde monsters), suggereert het verlies van methylatie in deze monsters (figuur 3). De primers De specificiteit en MSP resultaten werden bevestigd met behulp van de bisulfiet sequencing PCR (BSP) aanpak [29], waarin we willekeurig geselecteerde vijf hypomethylated monsters; hypermethylated vijf monsters en vijf gedeeltelijk gemethyleerde monsters (gegevens niet getoond). MYC
hypomethylatie werd vaker waargenomen in de diffuse-type ten opzichte van de intestinale type maagkanker ( p
= 0,007, OR = 8,554; 95% CI = 01.798-40.695, middels diffuse-type als referentiegroep). Bovendien, MYC
hypomethylatie werd geassocieerd met geavanceerde tumorstadia ( p
= 0,033; OR = 6,602; 95% CI = 1,162-37,501), dieper tumor uitbreiding ( p
= 0,022; OR = 4,752; 95% CI = 1,257-17,965), en de aanwezigheid van lymfeklier metastase ( p
= 0,032; OR = 5,12; 95% CI = 1,149-22,814) (Tabel 1).

met betrekking tot sequencen geen nieuwe mutatie gedetecteerd in maagtumoren. Dertien (10,4%) tumormonsters gepresenteerd minstens een bekende mutatie, met varianten van minder dan 1% kleinere allel frequentie. In totaal werden 18 mutaties geïdentificeerd, met 4 monsters vertonen co-voorkomende mutaties. In exon 1, vijf met GG en vier met CG bij rs117856857; een met GG op rs73707292; en vier met CT rs4645949. In exon 2, met betrekking tot missense mutaties, twee tumoren koesterde een mutatie op codon 47 resulteert in een verandering van tyrosine naar histidine (rs114570780; SIFT voorspelling = schadelijk; PolyPhen voorspelling = waarschijnlijk schadelijk), en twee op codon 72 resulteert in een verandering van proline naar serine (rs28933407; SIFT voorspelling = getolereerd; PolyPhen voorspelling = waarschijnlijk te beschadigen). Alle tumor met een mutatie in exon 2 presenteerde een of twee bekende mutatie in exon 1. Exon 2 mutaties werden alleen in de diffuse-type tumoren ontdekt in een vergevorderd stadium. Geen mutatie werd geïdentificeerd in exon 3. De aanwezigheid van bekende MYC
mutaties werd geassocieerd met diffuse-type tumoren ( p
= 0,004, OR = 21,717, 95% CI = 2,678-176,111; met behulp van diffuse-type als referentiegroep) en de aanwezigheid van verre metastase ( p
= 0,032, OR = 4,492, 95% CI = 1,141-17,679).

Discussie

de MYC eiwit een invloed op ongeveer 15% van de genen in het menselijke genoom [30]. Aldus kan MYC deregulering tot wijzigingen in verschillende biologische routes betrokken bij initiatie en progressie van kanker [5]. Echter, up-to-date, de relatie tussen de MYC
wijzigingen en clinicopathologische parameters is nog niet goed begrepen. De monsters presenteerde een man-vrouw verhouding van 02:01 en de meerderheid van de patiënten ouder dan vijfenvijftig. Bovendien is de intestinale-type maagkanker was vaker dan de diffuse-type en tumoren kwamen vaker voor bij niet-cardia. Deze epidemiologische gegevens zijn in overeenstemming met eerdere studies [28], [31] - [33].

chromosomale translocaties in de MYC
locus is zeer commun in hematopoietische kankers. Echter, in vaste humane tumoren zoals maagkanker, MYC
veranderingen zijn algemeen vanwege genamplificatie [34]. Bovendien, MYC
wordt erkend als de meest versterkte-eiwit-coderende gen in alle soorten kanker [35] zijn. In de huidige studie, zagen we drie of meer MYC
gen exemplaren onder de maag tumoren onderzocht, bevestigende met eerdere studies in primaire maag tumoren van mensen uit onze bevolking [10], [28], [36] - [39] alsook uit Oost Azië en Europa [40] - [42]. Ook MYC
amplificatie werd waargenomen in plasma [43] en in de maag in onze groep gevestigde kanker cellijnen [44] - [47]. Bovendien had de groep opgemerkt dat klonale hoge versterking van de MYC
minder frequent in diffuse-type dan in de darm-type primaire maagkanker [10], [22], [28], en dit werd versterkt door deze studie.

MYC overexpressie wordt beschreven varieert van 15,6% tot 100% primaire maagkanker [9]. In vitro studies met
aangereden MYC expressie in maagkanker cellijnen toonde de cruciale rol van MYC expressie in de maag tumorcelgroei, overleving en handhaving van tumorcel parameters die kunnen bijdragen tot maligne potentieel [48 ]. Bovendien Mehndiratta et al.
, [49] een significante afname (40%) in MYC expressie van zowel mRNA en eiwit en de benedenstroomse targets middels siRNA.

In de onderhavige studie, 76,8% van maag tumoren toonde immunoreactiviteit MYC en alle tumoren, darm- en diffuus type gepresenteerd verhoogde mRNA-expressie in vergelijking met hun gepaarde controles. Daarnaast zagen we dat MYC immunoreactiviteit en verhoogde expressie van mRNA geassocieerd met diepere tumoruitbreiding en aanwezigheid van metastase. Deze bevindingen suggereren dat MYC een rol in de tumor invasiviteit, métastase, en dus agressiviteit, bevestigende een eerder onderzoek [37]. Hoewel sommige analyses een klein effect formaat gepresenteerd, deze bevindingen zijn ook in overeenstemming met een eerdere studie van onze groep in niet-menselijke primaten, waarin we blijk gegeven van een voortdurende stijging van de MYC
mRNA expressie en kopieer nummer tijdens de achtereenvolgende stappen van intestinale-type maagkanker in N-methyl- nitrosoureum (MNU) behandeld primaten [16]. Anderzijds, organisaties tussen MYC en histologische graad, tumorlokalisatie, lymfeknoop metastase, of pathologische stadium werd gedetecteerd in een maagcarcinoomstudie ontwikkeld in een Chinese populatie [50], de versterking van de etniciteit van de getroffen populatie tot biologisch en klinisch maagkanker subgroepen [51].

Hoewel, is genamplificatie niet per se geassocieerd of nodig zijn voor de overexpressie, onze studie blijkt dat MYC immunologische, MYC
mRNA-niveaus, en het kopienummer rechtstreeks gecorreleerd.

DNA methylatie is een krachtige mechanisme van transcriptionele repressie. Proper genomische methylatie-patronen raken ingrijpend veranderd in kankercellen: zowel winsten (hypermethylatie) en verliezen (hypomethylatie) van gemethyleerde sites zijn waargenomen [52], [53]. Hypomethylatie op specifieke promoters kunnen de afwijkende expressie van oncogenen en verlies van imprinting activeren sommige loci [44]. Tot nu toe, weinig studies gesproken over de relatie tussen de methylatie patroon van de MYC Kopen en het effect daarvan op genexpressie en kankerverwekkende processen. MYC
hypomethylatie is eerder geassocieerd met het oncogene progressie en metastase-inductie in een rat model van leverkanker [54] en in de menselijke colorectale kanker monsters [55]. Daarnaast MYC
hypomethylatie werd ook geassocieerd met
MYC expressie in maagtumoren [26], [56] - [58] en cellijnen [48]. Maar we waren niet in staat om een ​​significant verband tussen MYC
hypomethylatie en de uitdrukking in onze monsters te nemen. Naast andere factoren, kan het ontbreken van associatie door de aanwezigheid van MYC
amplificatie in alle tumoren met hypomethylated promoters (86,4% van de monsters) en dus, het maskeren van de mogelijke invloed van deze epigenetische modificatie op MYC
transcriptionele regulatie.

Suzuki et al.
[59] toonden eerder aan dat een hoog hypomethylatie was van ontoereikend prognose bij zowel maag- en darmkanker en epigenetische veranderingen was leeftijd afhankelijk, voorkomende voordat genetische veranderingen. In de huidige studie, een aantal controles reeds gepresenteerd gemethyleerd sequenties in de MYC
promotor. Bovendien toonden we aan dat MYC
hypomethylatie werd geassocieerd met een agressievere fenotype (tumor agressiviteit, aanwezigheid van ganglionaire metastase en histologische typen kanker). Deze bevindingen suggereren dat MYC
demethylering kan ophopen tijdens tumorprogressie en dit kan een gemeenschappelijke gebeurtenis in gastrische carinogenesis zijn [60], [61], aangezien dit mechanisme is waargenomen voor andere genen in verschillende soorten tumoren [ ,,,0],62], [63]. Zoals reeds voor DNA Hypermethylering [64] voorgesteld, kan de promotor hypomethylatie worden gebruikt als een nieuwe generatie van biomarkers en houdt diagnostische en prognostische belofte voor clinici.

Aan het beste van onze kennis, MYC
gen exons nooit volledig gesequenced menselijke maag tumoren. Hier hebben we de sequentie van de drie exons van MYC Twitter: exon 1 is een niet-coderende eiwitten, exons 2 en 3-eiwit-coderende [zie voor een overzicht (Pelengaris & Khan, 2003)]. Er zijn geen nieuwe mutatie te vinden, maar we hebben geconstateerd dat de 4 tumoren gepresenteerd missense mutaties (rs114570780 en rs28933407) op exon 2. Deze mutaties waren in een evolutionair geconserveerde sequentie van MYC Twitter: het transactivatie domein [4] , [65]. Daarnaast werden zowel geïdentificeerde mutaties beschouwd als waarschijnlijk schadelijk volgens de PolyPhen software. De verandering van proline naar serine op codon 72 werd eerder gemeld als pathogene variant in de NCBI databank dbSNP (http://omim.org/). Aldus kan zowel mutaties in exon 2 MYC activiteit beïnvloeden maagtumoren. Bovendien is de aanwezigheid van MYC
mutaties geassocieerd met verre metastasen. Echter, verder onderzoek nodig om te verduidelijken of MYC
mutaties hebben een rol in het metastatische proces.

Volgens Lauren indeling, adenocarcinoom van de maag is ingedeeld voornamelijk in darm- en diffuse soorten [17]. Intestinale type maagkanker doorloopt een aantal opeenvolgende stappen, beginnend met atrofische gastritis gevolgd door intestinale metaplasie intraepitelial neoplasie en carcinoma [66]. Anderzijds, het diffuse type algemeen niet evolueren van precancereuze laesies [67], [68]. In de onderhavige studie hebben we vastgesteld dat de intestinale type gepresenteerd vaker MYC immunoreactiviteit, evenals een hoger aantal MYC
kopieën dan diffuse type tumoren, die bevestigt eerdere studies van onze groep [10] , [22], [28], [38]. Bovendien, MYC
hypomethylatie en puntmutaties werden vaker waargenomen in diffuse-type ten opzichte van intestinale-type tumoren. Dus onze bevindingen ondersteunen dat deze twee histologische subtypes volgen verschillende genetische pathways en kunnen twee afzonderlijke entiteiten [67].

Tot slot, onze gegevens suggereren dat MYC
overexpressie en promotor hypomethylatie kan hebben een rol in het proces maagkanker. MYC
deregulering werd vooral geassocieerd met slechte prognostische kenmerken. Onze resultaten ook de aanwezigheid van verschillende routes betrokken bij intestinale-type en diffuse type maagkanker versterken. Aldus onze bevindingen suggereren dat MYC een bruikbare merker voor klinische stratificatie en prognose kunnen zijn.

• PLoS ONE: Ontdekking van Tumor Markers voor maagkanker door Proteomics
• PLoS ONE: Staging maagkanker met Dual Energy Spectral CT Imaging