PLoS ONE: PFTK1 Bevordert maagkanker Progression door het reguleren van proliferatie, migratie en Invasion

Abstract

PFTK1, ook wel bekend als PFTAIRE1, CDK14, is een nieuw lid van Cdc2-gerelateerde serine /threonine proteïne kinasen. Recente studies tonen aan dat PFTK1 hoog tot expressie in verschillende kwaadaardige tumoren zoals hepatocellulair carcinoom, slokdarmkanker, borstkanker, en betrokken bij de regulatie van de celcyclus, tumoren proliferatie, migratie en invasie dat de prognose van tumoren verder te beïnvloeden. De expressie en fysiologische betekenis van PFTK1 bij maagkanker onduidelijk. In deze studie analyseerden we de expressie en klinische betekenis van PFTK1 door Western blot 8 gepaarde verse maagkanker weefsels nontumorous maagslijmvlies weefsels en immunohistochemie op 161 paraffinembedded segmenten. PFTK1 hoge expressie werd gecorreleerd met tumorgraad, lymfeklieren invasie en Ki-67. Door Cell Counting Kit (CCK) -8 assay, flowcytometrie, kolonievorming, wondgenezing en transwell assays, het vitro studies toonden aan dat overexpressie PFTK1 bevorderde proliferatie, migratie en invasie van maagkanker cellen terwijl PFTK1 knockdown tot tegengestelde resultaten. Onze bevindingen voor het eerst gesteund dat PFTK1 een belangrijke rol zou kunnen spelen bij de regulatie van de maag-proliferatie kanker, migratie en zou een nieuwe veelbelovende therapeutische strategie tegen menselijke maagkanker bieden

Visum:. Yang L, Zhu J, Huang H, Yang Q, Cai J, Q Wang, et al. (2015) PFTK1 Bevordert maagkanker Progression door het reguleren van proliferatie, migratie en invasie. PLoS ONE 10 (10): e0140451. doi: 10.1371 /journal.pone.0140451

Editor: Keping Xie, de Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center, VERENIGDE STATEN

Ontvangen: 7 mei 2015; Aanvaard: 25 september 2015; Gepubliceerd: 21 oktober 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Natural Science Foundation of China (nr 81302285, nr 81402015)

Competing belangen. de auteurs hebben verklaard dat geen tegenstrijdige belangen bestaan.

Introductie

Maagkanker is de vierde meest voorkomende kwaadaardige tumor en de tweede belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte in alle soorten kanker wereldwijd [1]. Het is moeilijk te genezen tenzij blijkt vroegtijdig [2]. Door het gebrek aan specificiteit, vroege diagnose is laag en de meerderheid van maagkanker patiënten een middelbare laat stadium bij diagnose. 40% -60% van de patiënten met maagkanker ontving maagkanker radicale operatie hebben vaak postoperatieve herhaling en metastase, deze kenmerken ernstige gevolgen hebben voor het voortbestaan ​​op lange termijn bij patiënten met maagkanker [3,4]. Ondanks de grote vooruitgang van nieuwe diagnostische en therapeutische strategieën van maagkanker, blijft de exacte moleculaire mechanismen van maagkanker slecht te begrijpen. Aldus kan de identificatie van het moleculaire mechanisme tijdens maagkanker en metastase patiënten met nieuwe diagnostische en therapeutische strategieën.

PFTK1 (ook bekend als PFTAIRE1, CDK14) is een nieuw lid van Cdc2-gerelateerde serine /threonine proteïnekinasen die eerst is geïdentificeerd in de muis zenuwstelsel en is een cruciale regulator van cyclinen en celcyclus [5,6]. Er zijn maar weinig studies zijn uitgevoerd om de fysiologische functie of biologisch belang te karakteriseren. Het is gemeld dat PFTK1 hoog tot expressie in hersenen, pancreas, nieren en eierstok. CDK's binden aan specifieke cyclinebox functionele proteïne kinase complexen en gedeeltelijk gereguleerd door zijn subcellulaire lokalisatie [7]. Bijvoorbeeld, Cycline Y, een nieuw membraan-geassocieerde cycline samenwerkt met PFTK1 verhoogt PFTK1 kinaseactiviteit en rekruteert PFTK1 naar de plasmamembraan [8]. PFTK1 interageert met cycline B2 co-lokalisatie in de kern van hepatocellulaire carcinoma [9]. De fundamentele functie van PFTK1 wordt gerapporteerd als cycline-afhankelijke kinase (CDK) reguleren celcyclus en celproliferatie door specifieke interactie met leden van cycline eiwitten zoals cycline D3 (CCND3), Cycline Y (CCNY) en vormt een ternair complex met de celcyclus inhibitor p21, fosforyleert waardoor de tumor suppressor Rb G1 /S overgang [10]. Knockout cycline Y in glioma cellijnen maakt de celcyclus geblokkeerd in S-fase [11]. Cycline Y interageert met PFTK1 passen M fase van mitose [12]. Deze bevindingen samen impliceren dat PFTK1 kan functioneren als een tumor promotor via het reguleren van de celcyclus. Ondertussen verscheidene studies aangetoond dat PFTK1 ook andere belangrijke functies. PFTK1 moduleert oligodendrocyt differentiatie via PI3K /AKT-route [13]. Onlangs PFTK1 verleent HCC celmotiliteit door middel van het inactiveren van de actine-bindende beweeglijke onderdrukken functie van TAGLN2 via fosforylering [14]. PFTK1-gemedieerde fosforylering maakt vereniging CAD tot F-actine filamenten, wat resulteert in het verbeteren van de polymerisatie van het actine stress-vezels, dus het bevorderen van celmigratie en invasie in HCC cellen [15,16]. Overexpressie van PFTK1 kan een beweeglijke fenotype in kwaadaardige hepatocyten [9] te verlenen. In overleg met de moleculaire bevindingen, CCNY en /of PFTK1 alleen kan noncanonical Wnt-signalering activeren om celbeweeglijkheid verbeteren in HCC cellen [17]. Al deze studies impliceren dat PFTK1 betrokken kan zijn bij de verspreiding en de beweeglijkheid cel, maar de expressie en de betekenis van PFTK1 bij maagkanker cellen zijn nog steeds onduidelijk.

In onze studie, gericht we een uitgebreide analyse van de uit te voeren PFTK1 expressie en prognose rol bij maagkanker cellen. We hebben gekeken naar de expressie van PFTK1 en de associatie met klinische kenmerken en Ki-67 door Western Blot en immunohistochemie (IHC). De studie toonde aan dat PFTK1 versterkte proliferatie, migratie en invasiviteit van maagkanker cellen door CCK-8, flowcytometrie geanalyseerd, kolonievorming analyses, Transwell test beïnvloedde de expressie van verwante eiwitten. Deze bevindingen werden eerst gemeld bij maagkanker cellen en kan een nieuw inzicht in de ontwikkeling van experimentele behandelingen bij maagkanker.

Materialen en methoden

weefselmonsters

Honderdzestig -een maagkanker weefselmonsters en afgestemd aangrenzende noncancer weefsels werden geselecteerd uit patiënten die een operatie tussen 2007 en 2013 onderging bij afdeling Pathologie, Nantong Tumor Hospital. Deze weefsels werden bewaard bij -80 ° C onmiddellijk na chirurgische verwijdering. Voor histologisch onderzoek werden alle maag weefselmonsters gefixeerd in 10% gebufferde formaline en ingebed in paraffine voor het snijden. Resectiepreparaten werden ingedeeld naar de zevende editie van de TNM classificatie voor maagkanker [1] .Alle de clinicopathologische opgenomen informatie leeftijd, geslacht, infiltratie diepte, differentiatie status, lymfeklier invasie, zenuw invasie en TNM stadium. De goedkeuring van het verwijderde weefsel voor onderzoeksdoeleinden werd verkregen van de ethische commissie van Nantong Tumor Hospital. Getekend informed consent werd ook verkregen van elke patiënt. De belangrijkste klinische en pathologische variabelen werden samengevat in Tabel 1.

Western blotanalyse

Western blot assay werd gebruikt om bepaalde eiwitten [18-20] detecteren. Ten eerste de maag caner weefsels en cellen werden gebroken in lysis buffer (1 M Tris-HCl pH 7,5, 1% Triton X-100, 10% natriumsulfaat (SDS), 1% NP-40, 0,5 M EDTA, 0,5% natrium- deoxycholaat, 10 ug /ml aprotinine, 1 mM PMSF, 10 ug /ml leupeptine) en daarna gecentrifugeerd bij 10.000 xg gedurende 30 minuten aan het supernatant te verzamelen. Het supernatant werd verdund in 2 x SDS ladingsbuffer en gekookt. Een equivalente hoeveelheid van eiwitten van elk monster werd aan elektroforese door 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) en daarna overgebracht op een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan (Millipore, Bedford, MA). Daarna werden de membranen geblokkeerd gedurende 2 uur bij kamertemperatuur en vervolgens gedurende de nacht geïncubeerd bij 4 ° C met primaire antilichamen. Na wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die 0,1% Tween 20 drie maal, telkens 5 minuten, werden de membranen geïncubeerd met mierikswortel peroxidase-gekoppelde IgG als secundair antilichaam gedurende nog 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. De membranen werden vervolgens ontwikkeld met het ECL detectiesysteem (Imaging Technology, Ontario, Canada). De antilichamen gebruikt in deze studie waren: anti-PFTK1 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), anti-cycline E (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), anti-PCNA (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology), anti- GAPDH (1: 1000, Sigma), anti-β-catenine (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology), anti-Dvl1 (1: 600, Santa Cruz Biotechnology), anti-Dvl2 (1: 600, Santa Cruz Biotechnology), anti-Naked1 (1: 500, Cell Signaling), anti-MMP2 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology).

Immunohistochemische analyses

in het kort werden coupes was ontdaan in xyleen en gerehydrateerd door middel van gesorteerde ethanolen. Vervolgens afgeschrikt de secties 3% methanolisch peroxide gedurende ongeveer 10 minuten om endogene peroxidase activiteit te blokkeren. Bij hoge druk en temperatuur in een autoclaaf, werd de immunoreactiviteit versterkt in 0,1 M citraatbuffer gedurende 3 min. De weefselcoupes werden geïncubeerd met het anti-PFTK1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology) en anti-Ki-67 (1: 400, Santa Cruz Biotechnology) gedurende 120 min bij kamertemperatuur. Volgens de instructies van de fabrikant, na wassen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), weefsels werden geïncubeerd met mierikswortelperoxidase-geconjugeerd anti-muis Ig polymeer als tweede antilichaam (Envision kit, Dako) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Tenslotte werden dia's met hematoxyline, gedehydrateerd en bevestigd in hars mount. Om PFTK1 en Ki-67 eiwitexpressie zowel de mate van immunoreactiviteit en de intensiteit werden geëvalueerd en gescoord kwantificeren. Vijf high-power velden werden willekeurig gekozen voor elke sectie en ten minste 300 cellen per veld geteld. Voor statistische analyse van PFTK1 werd elke dia geëvalueerd met behulp van een semikwantitatieve scoresysteem voor zowel de intensiteit van de vlek en het percentage positieve maligne cellen. 1 (≤25% gekleurde tumorcellen), 2 (26% -50% gekleurde tumorcellen), 3 (51% -75% gekleurde tumorcellen), 4 (76% -100% tumorcellen: de cellen werden als volgt gescoord gebeitst). Voor de evaluatie dichtheid: 1 zwakke kleuring; 2 matige kleuring; 3 sterke kleuring. Vervolgens vermenigvuldigd we de twee scores en geclassificeerd ze in twee groepen: lage expressie en hoge expressie. Zoals voor statistische analyse van Ki-67, < 50% tumorcellen gekleurd zo laag expressie en ≥50% tumorcellen gekleurd zoals hoge expressie. Om technische fouten voorkomen, werd kleuring driemaal herhaald en vergelijkbare resultaten werden verkregen.

Celkweken en transiënte transfectie

MGC803 en HGC27 waren maag cellijnen die werden verkregen van de celbibliotheek van de Chinese Academy of Sciences. Beiden werden gekweekt in RPMI-1640-medium (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA). SGC7901 en GES1 waren andere maag-cellijnen, die vriendelijk verzocht werden verstrekt door de afdeling Pathologie Onderzoek van Nantong University. SGC7901 en GES1 werden gekweekt in DMEM-medium (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA). Alle medium werden gemaakt met 10% foetaal runderserum (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA) aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 U /ml penicilline-streptomycine-mengsel (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA ), bij 37 ° C en 5% CO _{2. PFTK1 kleine interfererende RNA (siRNA) werden ontworpen en gesynthetiseerd door Shanghai Genechem (China). De siRNA gericht PFTK1 sequenties waren als volgt: 5'-GTTCATTCTTTACCACATT-3 ', 5'-AGGTTGCATCTTTGTTGAA-3', 5'-AAAGAGTCACCTAAAGTTA-3 ', 5'-ACCCATACAGGAAATCCAA-3'. De vlag-PFTK1 plasmide werd gekocht van Shanghai Genechem (China). Lipofectamine 2000 transfectiereagens (Life Technologies) werd gebruikt voor transfectie cellen volgens de instructies van de fabrikant.}

Flow cytometrische analyse

Ten eerste zijn alle cellijnen maag gefixeerd in 70% ethanol overnacht bij -20 ° C. tweede, na door citraat-fosfaatbuffer PBS gewassen en de cellen werden geïncubeerd met 1 mg /ml RNaseA gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Daarna werden de cellen gekleurd met 50 ug /ml propidiumjodide in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) -Triton nog eens 20 min bij 4 ° C. Tenslotte werden de cellen geanalyseerd met behulp van een Becton Dickinson FACScan flowcytometer BD (San Jose, CA) en CellQuest acquisitie analyseprogramma's. Het experiment werd driemaal uitgevoerd.

kolonievorming assays

MGC803 cellen in zes putjes (Corning Inc., Corning NY) gekweekt bij een dichtheid van 200 cellen /putje na transfectie PFTK1 #siRNA en vlag-PFTK1 volgens de instructies van de fabrikant. Na twee weken werden de celkolonies (≥50 cellen /kolonie) geteld door kleuring met 0,5% kristalviolet.

celproliferatie assays

MGC803 cellen die normaal opgenomen transfectie van siRNA # PFTK1 en Flag-PFTK1 werden gezaaid in 96-well celcultuur cluster platen (Corning Inc., Corning NY) bij een dichtheid van 2 x 10 ^{4 cellen /putje in 100 pl kweek en gedurende de nacht gekweekt. Volgens de instructies van de fabrikant werden de cellen gemeten met een commercieel CCK-8 (DOJINDO, Kumamoto, Japan). CCK-8 reagentia werden toegevoegd aan elk putje gedurende 2 uur incubatie bij 37 ° C. De absorptie werd afgelezen bij een golflengte van 450 nm in een geautomatiseerde plaatlezer. De experimenten ten minste driemaal herhaald.}

wondgenezing assay

MGC803 cellen in zes putjes (Corning Inc., Corning NY) gekweekt bij een dichtheid van 5 x 10 ^{5 cellen /putje en gekweekt om 's nachts confluentie. Na getransfecteerde 48 uur werden de cellen geïncubeerd met serumvrij medium. Een lijn is gekrast in de conflent cellaag met de fie einde van een 10 ml pipet tip (tijd 0) en cellen werden gewassen met PBS. Beelden van migrerende cellen werden achtereenvolgens genomen na 24 uur, 48 uur bij het sluiten van de gewonde gebied.}

Trans-well migratieanalyse

Celmigratie werd uitgevoerd met behulp transwell kamer (8,0 lm poriegrootte; Costar, Cambridge, NY, USA). Ongeveer 1 x 10 ^{5 cellen /ml werden gezaaid in de bovenste kamers in medium en RPMI-1640 werd toegevoegd aan de onderste kamers. Na 24 uur werden de bovenste cellen die niet zijn gemigreerd verwijderd en de onderste cellen die waren gemigreerd werden gefixeerd met paraformaldehyde en gekleurd met kristalviolet. Het aantal migrerende cellen in 5 velden geteld onder 200 x vergroting, en de middelen voor elke kamer bepaald. Alle experimenten werden driemaal herhaald}

Trans-well assay inval

Celmigratie werd uitgevoerd met behulp transwell kamer (8,0 lm poriegrootte; Costar, Cambridge, NY, USA).. BD MatrigelTM basaalmembraanziekte Matrix werd toegevoegd aan de bovenste kamer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Vervolgens, 500 gl medium dat chemotactische factor werd in de onderste kamer. Ongeveer 1 x 10 ^{5 cellen /ml werden in de bovenkamers geënt bij 37 ° C gedurende 24 h.Cells werden vervolgens gefixeerd met paraformaldehyde en gekleurd met kristalviolet. Alle experimenten werden driemaal herhaald.}

Statistische analyse

Alle statistische analyse werden met behulp van de SPSS Statistics 19 softwarepakket uitgevoerd. De PFTK1, Ki-67 expressie en de clinicopathologic functies werden geanalyseerd met behulp van de χ ^{2-test. Totale overleving werden berekend met de Kaplan-Meier-methode en werden getest met de log-rank test. Multivariate analyse werd geanalyseerd met Cox proportional hazards model, de risicoverhouding en 95% betrouwbaarheidsinterval werden geregistreerd voor elke marker. De waarden werden uitgedrukt als gemiddelde ± SE, en P
< 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.}

Resultaten

PFTK1 is overexpressie in de maag tumorweefsels

Het is gemeld dat PFTK1 is een belangrijk cycline afhankelijke kinase die celcyclus kan regelen, maar het onderzoek naar maagkanker is nooit onderzocht. Omdat overexpressie van PFTK1 werd gevonden in de lever en slokdarmkanker in vergelijking met normale weefsels. Het is dus interessant om de analyse van de expressie van PFTK1 in de maag tumor weefsels en haar coorelation met prolifererende cel nucleair antigen (PCNA). Eerst onderzochten we de expressie van PFTK1 in 8 paren maag tumorweefsels en hun overeenkomstige nontumorous gastrische mucosale weefsels door Western blot. Zoals getoond in figuur 1, in vergelijking met aangrenzende normale weefsels, opregulatie van PFTK1 werd gedetecteerd in alle acht gastrische weefsels in overeenstemming met PCNA. Om de klinische betekenis van PFTK1 bij maagkanker progressie bevestigen immunohistochemische analyses (IHC) werd gebruikt om de expressie van eiwit PFTK1 observeren 161 maagkanker weefsels. Zoals verwacht, werd de expressie van PFTK1 en tumorgraad negatief samen. PFTK1 hadden een significant hogere expressie in slecht gedifferentieerde exemplaren dan in goed gedifferentieerde exemplaren, die in overeenstemming was met de Ki-67. PFTK1 werd uitgedrukt in celmembraan, cytoplasma terwijl, Ki-67 voornamelijk in de kern. Het resultaat is weergegeven in figuur 2. Vervolgens onderzochten we de correlatie tussen PFTK1 en Ki-67 door Pearson correlatiecoëfficiënt. We zien in figuur 3A dat PFTK1 positief werd geassocieerd met Ki-67 (Pearsons γ = 0,833, P Restaurant < 0,001).

PFTK1 wordt geassocieerd met negatieve klinische kenmerken en een slechte maag tumor patiënten 'survival

Klinisch associatie studie werd onderzocht om de correlatie van PFTK1 met maagkanker clinicopathologische functies te analyseren onder 161 weefsels. De klinische en pathologische gegevens zijn vermeld in tabel 1. Hoge expressie van PFTK1 werd in verband met tumor waardering ( P
= 0,009), infiltratie diepte ( P
= 0,002), lymfeklier invasie ( P
= 0,000) en Ki-67 ( P
= 0,000). Maar er was geen correlatie tussen PFTK1 expressie en andere klinische variabelen, zoals leeftijd, geslacht, zenuw invasie, en TNM stadium.

Daarnaast werd Kaplan-Meier-analyse gebruikt om de associatie tussen PFTK1 meningsuiting en 161 analyseren patiënten 'survival. Volgens de overleving curves, werd hoge expressie van PFTK1 duidelijk gecorreleerd met een slechte algehele overleving, terwijl de lage expressie van PFTK1 was gecorreleerd met een betere totale overleving. En de mediane overleving tijd en hazard ratio werd toonde in figuur 3B. Bovendien univariate analyse bij maagkanker weefsels toonde aan dat de tumor waardering ( P
= 0,020), infiltratie diepte ( P
= 0,011), lymfeklier invasie ( P
= 0,011), TNM stadium (P = 0,031), PFTK1 uitdrukking ( P
= 0,002), en Ki-67 expressie ( P
= 0.013) werden prognostische factoren van de totale overleving (tabel 2 ). Multivariate analyse met behulp van Cox's proportionele hazards model voorgesteld PFTK1 was een onafhankelijke prognostische indicatoren van de patiënten 'totale overleving ( P
= 0,048, tabel 3). Kortom, onze resultaten toonden aan dat de expressie van PFTK1 significant wordt geassocieerd met klinische kenmerken en een slechte algehele overleving.

De expressie van PFTK1 in getransfecteerde en getransfecteerde maagkanker cellen

Als PFTK1 wordt overexpressie in de maag tumor weefsels, vervolgens geanalyseerd we expressie van PFTK1 in cellijnen waaronder MGC803, SGC7901, HGC27, GES1. Uit figuur 4A, de expressie van PFTK1 in normale maag cellijn GES1 was lager dan in de maag cellijnen MGC803, SGC7901, HGC27. Voor de functie van PFTK1 bij maagkanker cellen verder te bestuderen in vitro
MGC803 cellen werden getransfecteerd met PFTK1-siRNA en SGC7901 cellen werden met Flag-PFTK1. Western blot werd gebruikt om de expressie PFTK1 meten. Wanneer vlag-PFTK1 werd getransfecteerd in SGC7901, PFTK1 had een hogere expressie (figuur 4B). Terwijl PFTK1-siRNA werd getransfecteerd in MGC803, PFTK1-siRNAhet hoogste cijfer knockdown doelmatigheid in vergelijking met andere PFTK1-siRNA (figuur 4C). Dus hebben we gekozen voor de vlag-PFTK1 en PFTK1-siRNAvoor de volgende experimenten voort te zetten.

PFTK1 kan bevorderen cellen migreren en invasieve In vitro

Het is gemeld PFTK1 overexpressie kunnen CAD-fosforylering te verhogen en CAD-te binden aan F-actins, die hepatocellulair carcinoom cellen migratie [16] te bevorderen. Gezien het feit dat PFTK1 was gerelateerd aan lymfeklier invasie in maagkanker monsters, bestudeerden we of PFTK1 invloed kunnen zijn op maagkanker cellen migratie en invasie. Wondgenezing assay en transwell assays toonden dat de migratie van Flag-cellen PFTK1 gebied duidelijk verhoogd in vergelijking met controlecellen. Integendeel, de migratie van PFTK1-siRNAcellen verlaagd vergeleken met controlecellen (figuur 5A en 5B). Verder Matrigel invasie assays toonde ook aan dat opregulatie van PFTK1 door transfecteren vlag-PFTK1 het invasieve vermogen kon vooruit te helpen, en knock-down van PFTK1 kon het invasieve vermogen van maagkanker cellen (figuur 5C) verzwakken. Algemeen, kunnen we de conclusie dat PFTK1 bevorderen migratie en invasie van maagkanker cellen komen.

Expressie van PFTK1 bevorderen proliferatie van maagkanker cellen

Volgens de hierboven beschreven resultaten, PFTK1 was positief gecorreleerd met PCNA, Ki-67 expressie en tumor rang, welke cellen waren proliferatie marker. We analyseren de rol van PFTK1 op het reguleren van de proliferatie vermogen. Eerst werden MGC803 cellen die met PFTK1-siRNA, vlag-PFTK1 en werden bepaald CCK-8 assay. Overexpressie van PFTK1 aangetoond dat de maag cellen groei dan de controle te verhogen, terwijl het neerhalen van PFTK1 bleek het tegenovergestelde resultaat (figuur 6A). In overeenstemming met het verbeteren van de cel groei na PFTK1 overexpressie, kolonievormende assay toonde ook het kon kolonievorming te verhogen. En knockdown van PFTK1 vertoonde hetzelfde resultaat met CCK-8 assay (figuur 6B). Uiteindelijke ontdekten wij de proliferatie mechanisme van PFTK1 door flowcytometrische analyse en cijfers dat meer maagkanker cellen in de S-fase in de aanwezigheid van ectopische PFTK1, minder maagkanker cellen in de S-fase in transfecteren met PFTK1- siRNA(figuur 6C). Samenvattend, deze gegevens blijkt dat PFTK1 deelgenomen celcyclus regulatie door versnelling G0 /G1-S overgang.

De signaalroute van PFTK1 bevordering proliferatie en migratie

Om verder het mechanisme te onderzoeken van die PFTK1 geregeld maagkanker cellen proliferatie, migratie, invasie, hebben we besloten om de bijbehorende eiwit veranderd door Western blot toen PFTK1 werd overexpressie of knockdown in MGC803 detecteren. Zoals gemeld, kon PFTK1 noncanonical Wnt-signalering in leverkanker [17] te activeren. Wnt-signalering werd in verband met tumoren proliferatie en migratie. Opregulatie van PFTK1 gedeeltelijk geactiveerd Dvl2, Naked1, MMP2 en verhoogde de expressie van celcyclus regulator Cycline E, maar niet veranderd Dvl1, β-catenine. Wat meer is, vonden we dat knockdown van endogene PFTK1 uitdrukking kon Dvl2, Naked1, MMP2, Cycline E expressie, verminderen, maar niet veranderd Dvl1, β-catenine (Fig 7).

Discussie

Being één van de hoogste incidentie van kanker in de wereld, de 5-jaarsoverleving van maagkanker is minder dan 20% -25% in de VS, Europa en China als gevolg van gemakkelijk tot recidief en metastase hoge snelheid in postoperatieve [2]. Helicobacter pylori infectie, de verandering van oncogeen en tumor suppressor genen, de regulering van de celcyclus en telomerase activatie geassocieerd met maagkanker [21]. Abnormale regulering van de celcyclus in de ontwikkeling van maagkanker heeft het onderwerp van het onderzoek in de afgelopen jaren. Accurate en strikte regulering van de celcyclus afhankelijk van een aantal factoren, waaronder controle celcyclus afhankelijke kinase (CDK), celcyclus eiwit (Cyclinen), en celcyclus afhankelijke kinase-inhibitoren (CKiS). Iedereen is bekend met 11 klassieke CDK (CDK1-11), PFTK1 als een nieuwe celcyclus afhankelijke kinase wordt niet langs gevonden en de verbinding tussen PFTK1 en kanker is niet veel, ook bij maagkanker [22].

PFTK1 werd oorspronkelijk gevonden in het zenuwstelsel van ratten [23]. PFTK1 moduleert oligodendrocyt differentiatie via PI3K /AKT-route [13]. Het meest recente onderzoek meldde dat PFTK1 wordt opgereguleerd in menselijke slokdarmkanker, leverkanker en associeert met tumorgroei, migratie en invasie [14,24]. In onze studie hebben we onderzocht of de expressie van PFTK1 was betrokken bij maagkanker celproliferatie, migratie en invasie. Eerst hebben we aangetoond dat expressie PFTK1 hoger maagkanker weefsels dan in aangrenzende weefsels nontumor met Western blot die volgens de resultaten andere kankers (figuur 1). Vervolgens immunohistochemie toonde hoge expressie van PFTK1 werd in verband met tumor rang, infiltratie diepte, lymfeklier invasie evenals Ki-67 in 161 maagkanker weefsels. Deze bevindingen gevraagd PFTK1 invloed kunnen zijn op de maag-proliferatie en migratie kanker. Kaplan-Meier-analyse onthulde dat PFTK1 voorspelde slechte overleving (Figuur 3B). Multivariate analyse met behulp van Cox's proportionele hazards model voorgesteld PFTK1 was een onafhankelijke prognostische indicatoren van de totale overleving van patiënten. Om het regulerende effect van PFTK1 op gastrische cellen verder te begrijpen, werden cellen getransfecteerd met MGC803 PFTK1-siRNA, Flag-PFTK1 in vitro
(figuur 4). Figuur 6 vertoonde PFTK1 van proliferatie bevorderen door CCK-8, kolonievormende assay. Tegelijkertijd, PFTK1 verhoogde de G1-S-fase transformatie volgens cytometrische stromen, samenvallend met de bevinding van PFTK1 in hepatocellulaire carcinoma [10]. Cycline E was een van de belangrijke regulerende factoren gedurende G1-S-fase transformatie en cycline E-eiwit als prognostische factor voor patiënten met maagkanker [25] kan definiëren. Interessant, werd PFTK1 niveau verhoogd na transfecteren met Vlag-PFTK1 consistented met PCNA, MMP2 en Cycline E (Fig 7).

Daarnaast hebben we ook onderzocht of PFTK1 zou kunnen beïnvloeden cellen migratie en invasie vermogen van wondgenezing Transwell test en assays. De resultaten toonden aan dat de overexpressie van PFTK1 cellen migratie en invasie verhoogt, wat kan worden veroorzaakt door een verandering van stroomafwaarts van de PFTK1 signaalpaden (figuur 5). Zoals gemeld in hepatocellulaire kanker, PFTK1 en /of CCNY kon alleen niet-canonieke Wnt-signalering te activeren waardoor cellen migratie en invasie [17]. Wnt trajecten omvatte de Wnt /β-catenine signalering en niet-canonieke Wnt signalering manier (Wnt /Ca ^{2 + en Wnt /PCP). Wnt signalering manier een belangrijke rol gespeeld bij de ontwikkeling van kanker en gereguleerde celproliferatie, migratie en invasie [26]. Vervolgens vonden we expressie van eiwitten β-catenine, Dvl1, Dvl2, Naked1. Dvl2 en Naked1 werden positief gecorreleerd met PFTK1 en Wnt /β-catenine gerelateerde eiwitten β-catenine was Dvl1 niet veranderd (figuur 7). Uit het bovenstaande, we dan ook gespeculeerd dat PFTK1 migratie en invasie zou kunnen bevorderen door middel van de regulering van niet-canonieke Wnt-signalering. En er waren ook artikelen prompt niet-canonieke Wnt-signalering bevordert migratie en invasie vermogen van maagkanker cellen [27,28].}

In een woord, de uitdrukking van PFTK1 aanzienlijk werd verhoogd in het menselijke maagkanker weefsels. Overexpressie of knockdown van PFTK1 door transfecteren met Vlag-PFTK1 of PFTK1-siRNAduidelijk aangetaste maagkanker cellen proliferatie, migratie en invasie. Onze resultaten verschaffen bij de eerste keer nieuw bewijs PFTK1 in de ontwikkeling van maagkanker en levering laboratorium basis voor klinische behandeling. Maar verdere studies nodig zijn om het precieze mechanisme van PFTK1 invloed proliferatie, migratie en invasie vermogen van maagkanker cellen te begrijpen.

• PLoS ONE: detectie en typering van uitgezaaide kanker cellen in de mesogastrium van maagkanker patiënten
• PLoS ONE: vetinname en risico van maagkanker: een meta-analyse van observationeel Studies