PLoS ONE: de apoptotische effect van HIF-1α Remming Gecombineerd met Glucose plus insulinebehandeling op maagkanker onder hypoxische condities

Abstract

Maagkanker groeit onder een zuurstofarme omgeving. HIF-1α speelt een belangrijke rol spelen bij het regelen van de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de mitochondria onder hypoxische omstandigheden. We eerder vastgestelde HIF-1α knockdown (KD) cellen en controle (SC) cellen in de 58As9 maagkanker cellijn. In deze studie hebben we aangetoond dat KD cellen, maar niet SC cellen geïnduceerde apoptose onder omstandigheden van hypoxie (1% O _{2) als gevolg van overmatige productie van ROS. Een kwantitatieve RT-PCR analyse toonde aan dat de uitingen van tien genen die betrokken zijn bij de controlemechanismen van ROS (inclusief Warburgeffect, mitofagie, elektronen transportketen [ETC] modificatie en ROS scavenging), gereguleerd door HIF-1α. Bovendien is de bevordering van glucoseopname door insuline plus glucose (GI) behandeling versterkt het apoptotisch effect, die gepaard ging verder ROS productie in hypoxische cellen KD. Een Western blot analyse toonde dat de expressie van vliezige GLUT1 in KD cellen werd verhoogd door glucose en /of insuline behandeling, wat aangeeft dat de GI-geïnduceerde glucoseopname wordt gemedieerd door de verhoogde translocatie van GLUT1 op de celmembraan. Tenslotte het antitumoreffect van HIF-1α knockdown (KD) plus GI werd geëvalueerd met behulp van een tumor xenograft model, waarbij een zuurstofarme omgeving nature aanwezig. Dientengevolge, de GI behandeling sterk remde de groei van de tumoren KD waarbij apoptose sterk werd geïnduceerd in vergelijking met de controlebehandeling. Daarentegen werd de groei van de tumoren tot expressie SC HIF-1α niet beïnvloed door de GI behandeling. Samengenomen suggereren de resultaten dat HIF-1α remming plus GI ideale therapie, omdat de apoptose als gevolg van de vernietiging van ROS homeostase specifiek maagkanker die groeit onder een zuurstofarme omgeving wordt geïnduceerd, maar niet in het normale weefsel onder de aërobe omstandigheden}

Visum:. Tanaka T, Kitajima Y, Miyake S, Yanagihara K, Hara H, Nishijima-Matsunobu A, et al. (2015) de apoptotische effect van HIF-1α Remming Gecombineerd met Glucose plus insulinebehandeling op maagkanker onder hypoxische condities. PLoS ONE 10 (9): e0137257. doi: 10.1371 /journal.pone.0137257

Editor: Ester Hammond, University of Oxford, Verenigd Koninkrijk

Ontvangen: 30 april 2015; Geaccepteerd: 13 augustus 2015; Gepubliceerd: 4 september 2015

Copyright: © 2015 Tanaka et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de ondersteunende informatie bestanden

financiering:.. de auteurs hebben geen steun of financiering aan te melden

Competing belangen. de auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

De zuurstofarme omgeving is aanzienlijk in solide tumoren, waar het versnelt hun kwaadaardig gedrag [1-4]. Als andere vaste tumoren, is maagcarcinoom bekend uitgestrekte gebieden van hypoxie omvatten in de tumor [5-7]. Hypoxische omstandigheden induceren verschillende biologische gebeurtenissen zoals angiogenese, lokale invasie, metastase radio- of chemoresistance en veranderde energiestofwisseling in vele carcinomen, wat leidt tot een slechte prognose bij patiënten [2-4].

De transcriptiefactor hypoxia-induceerbare factor 1 (HIF-1) is de voornaamste mediator van de cellulaire aanpassing aan hypoxie [8-10]. HIF-1 is een heterodimeer eiwit bestaande uit een constitutief tot expressie β-subeenheid (HIF-1β) en een hypoxia-induceerbare α (HIF-1α) subeenheid [8-10]. HIF-1α subeenheid wordt afgebroken door de ubiquitine-proteasoomroute onder normoxia. Daarentegen onder hypoxie, HIF-1α gestabiliseerd en dimeriseert met HIF-1β interactie met CBP /p300, die dan bindt aan de hypoxie responselement (HRE) aan het promotorgebied van honderden doelwitgenen [11-16]. Deze eerdere verslagen hebben geleid tot de herkenning van HIF-1α als een centrale regulator in de pathogenese van vaste kanker

reactive oxygen species (ROS) zoals superoxide anion (O _{2 ^{. - ), waterstofperoxide (H 2O 2), en hydroxyl radicaal (HO •) bestaan ​​uit radicale en niet-radicale zuurstofsoorten gevormd door de gedeeltelijke reductie van zuurstof. Intracellulair ROS worden voornamelijk geproduceerd in de mitochondriën van oxidatieve fosforylering (OXPHOS), een proces uitgevoerd door de elektronentransportketen (ETC) [17]. Wanneer ROS overweldigen de cellulaire antioxidant afweersysteem, oxidatieve stress optreedt. Overmatige oxidatieve stress veroorzaakt de ROS-gemedieerde beschadiging van nucleïnezuren, eiwitten en lipiden en leidt tot celdood [17, 18].}}

HIF-1α is gemeld dat ROS productiebeheersing onder hypoxische omstandigheden door meerdere mechanismen met name de omschakeling van de energiestofwisseling van OXPHOS glycolyse, die wordt aangeduid als de Warburgeffect [19-23], de inductie van mitochondriale selectieve autofagie (aangeduid als mitofagie) [24, 25], ETC modificatie door een subeenheid schakelaar cytochroom c oxidase (COX) [26] en ROS scavengers [27]. In de metabole route van de Warburg effect, HIF-1α activeert eerst de transcriptie van GLUT1
aan de opname van glucose in de cellen te verhogen. Glucose wordt vervolgens omgezet in pyruvaat door de acties van glycolytische enzyme leden, die bekend zijn doelwitten voor HIF-1α [28, 29]. Onder aërobe omstandigheden is pyruvaat omgezet in acetyl-CoA (AcCoA) van pyruvaat dehydrogenase (PDH) voor binnenkomst in de tricarbonzuur (TCA) cyclus. Omgekeerd, in kankercellen blootgesteld aan hypoxie, pyruvaat wordt van de mitochondriën, waarbij HIF-1α zorgt voor opwaartse regulering van de expressie van PDK1 om de PDH-activiteit te remmen overbrugd. Daarna LDHA alternatief zet pyruvaat naar lactaat en MCT4 transporteert de lactaat uit de cel. Deze genen worden ook gereguleerd door HIF-1α [16, 30, 31]. Hypoxie induceert mitofagie buitensporige ROS productie waarmee de beschadigde mitochondria via lysosomale digestie [24, 25] geëlimineerd voorkomen. Recente studies hebben aangetoond dat HIF-1α activeert de transcriptie van de genen die coderen BNIP3 en BNIP3L, essentiële factoren in de mitofagie procedure [32]. Een andere studie rapporteerde dat HIF-1α regelt de COX4 subeenheid schakelen door het activeren van de transcriptie van de ETC-gerelateerde genen COX4-2 en LON, een mitochondriale protease dat COX4-1 afbraak vereist onder hypoxie [26]. De COX4 subeenheid switch werd gerapporteerd als een belangrijke stap in ROS homeostase, vanwege zijn rol bij het optimaliseren van de efficiëntie van de ademhaling onder hypoxie [26]. De ROS scavenger MnSOD is bekend dat superoxide radicalen zetten in waterstofperoxide. Een eerdere studie heeft gemeld dat MnSOD opgereguleerd onder hypoxie, maar of dit opregulatie wordt gemedieerd door HIF-1α is nog niet aangetoond [27]. Recentelijk ander rapport toonde het interessante bevinding dat de embryonale fibroblasten (MEF) van hypoxische HIF-1α-null muizen stierven door overmatige ROS productie, terwijl MEF werden gered door behandeling met het antioxidant N- acetyl-L-cysteïne (NAC) [ ,,,0],33]. Samengevat, deze rapporten aan dat HIF-1α speelt een centrale rol bij de organisatie van de mitochondriale ROS productie in levende cellen onder hypoxie.

In deze studie was het doel om een ​​therapeutisch model aangetoond dat hypoxie-geïnduceerde apoptose via vastgesteld de overproductie van ROS kan worden ingevoerd om HIF-1α deficiënte maagkanker cellen. We aanvankelijk bepaald of hypoxia induceert celdood door overmatige ROS in de HIF-1α knockdown (KD) cellen. Daarna gerichte we de hypothese dat de invoering van hoge glucosespiegels door behandeling van cellen met insuline KD het apoptotische effect kunnen versterken. Tot slot, met behulp van een tumor xenograft model, we voorgesteld dat HIF-1α remming gecombineerd met glucose plus insuline (GI) behandeling een potentiële therapie voor maagkanker kan zijn.

Materialen en methoden

Cell cultuur omstandigheden en reagentia

de maagkanker cellijn 58As9 werd vriendelijk verschaft door Dr. K. Yanagihara (National Cancer Center Hospital East, Chiba, Japan) december in 2009. de 58As9 cellijn werd oorspronkelijk opgericht uit de scirrhous maag-carcinoom afgeleide cellijn HSC-58 [34]. Deze cellijn werd vervolgens verder geverifieerd op 24 februari ^{th 2015 door de JCRB Cell Bank (Osaka, Japan). Een ander maagkanker cellijn, MKN74 werd gekocht van Cell Bank, RIKEN Bio Resource Center (Tsukuba, Japan). In de huidige studie, gebruikten we stabiele HIF-1α knockdown cellen KD en 74 KD-, zijn respectievelijk ingesteld bij de transfectie van de siRNA plasmide dat de sequenties in de RNAi 58As9 en MKN74 cellen zoals eerder [7, 35] beschreven. De sequenties van siRNA gericht HIF-1α en controle scrambled siRNA werden als volgt gemaakt: HIF-1α siRNA voor KD en 74 KD-(5'-CAT CCA TCA CGT ATA TGA T-3 ') en scramble siRNA SC of 74- SC (5'-TCT TAA TCG CGT ATA AGG C-3 '). De cellen werden gekweekt in RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 100 ug /ml kanamycine (Meiji, Tokyo, Japan ) en geïncubeerd bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer. De cellen werden gekweekt onder hetzij normoxische omstandigheden (20% O _{2 en 5% CO 2 in lucht) of hypoxische omstandigheden (1% O 2, 5% CO 2 en 94% N 2) in een hypoxische kamer (ASTEC, Fukuoka, Japan) en vervolgens behandeld met NAC (Sigma-Aldrich) en insuline (Wako, Osaka, Japan) bij een uiteindelijke concentratie van 5 mM en 500 ng /ml. De concentratie van de hoge glucose medium werd bereid door toevoeging van 45% D - (+) - glucose-oplossing (Sigma-Aldrich) en de eindconcentratie werd bepaald op 10 g /l, wat 5 keer hoger dan in normaal RPMI-1640-medium.}}

Cell levensvatbaarheid assay

De levensvatbaarheid cel onder normoxia of hypoxie werd vastgesteld door trypan blauwe kleurstof uitsluiting assays. Voor de evaluatie van therapie effecten, zoals NAC, hoge glucose en /of insuline op de levensvatbaarheid van de cellen, 1 x 10 ^{5 cellen werden gezaaid op 6 cm kweekschalen. De cellen werden behandeld met verschillende geneesmiddelen bij de aangegeven concentraties en gekweekt onder normoxie of hypoxia gedurende 24 h tot 96 h. Aan het einde van de incubatie werden de drijvende en hechtende cellen verzameld en gepelleteerd door centrifugeren (3000 rpm, 5 min). De cellen werden geresuspendeerd in 90 ul van het compleet medium, gemengd met 10 pl van 0,4% trypan blauwe oplossing en geteld met een hemocytometer onder een microscoop. De celdood werd bepaald als de verhouding van het aantal dode cellen /het totale aantal cellen. Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd en herhaald onafhankelijk ten minste drie maal.}

Western blotanalyse

Hele cellysaten uit gekweekte cellen en de xenograft tumoren in muizen werden bereid met lysisbuffer bestaande uit 150 mmol /L NaCl, 50 mmol /L Tris-HCl (pH 7,6), 0,5% Triton X-100 en een cocktail van proteaseremmers mix (Roche, Mannheim, Duitsland). Cellysaten van de cytosolische fractie en celmembraanfractie werden bereid onder toepassing van een cytochroom c loslaten Apoptose Assay Kit en een plasma membraaneiwit Extraction Kit (BioVision Inc., Milpitas, CA, USA) volgens de instructies van de fabrikant. De Western blot analyse werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [7]. Fracties bevattende 30 ug eiwit werden elektroforetisch gescheiden op 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) en overgebracht naar een Amersham Hybond-ECL-membraan (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) in een transferbuffer. Na het blokkeren met 5% huidmelk voor 30 minuten werd het membraan geïncubeerd met primaire antilichamen gedurende de nacht bij 4 ° C. De volgende primaire antilichamen werden gebruikt: anti-HIF-1α (1: 1000 verdunning, Abcam, Cambridge, UK), anti-gesplitst caspase 3 (1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-cytochroom c (1 : 500 verdunning, BioVision), anti-GLUT1 (1: 100.000 verdunning Abcam) en anti-β-actine (1: 10.000 verdunning; Sigma-Aldrich, Inc.). Na incubatie met de bijbehorende secundaire antilichamen werden de signalen die zijn ontwikkeld met behulp van een Amersham ECL Plus Western Blotting Detection System (GE Healthcare).

Detectie van de intracellulaire ROS door flowcytometrie

De intracellulaire ROS waarden werden geëvalueerd met een totale ROS Detection Kit (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Kortom, KD, SC, werden de cellen gekweekt onder omstandigheden van zowel normoxie en hypoxie met en zonder behandeling met medicijnen (d.w.z., NAC, hoge glucose en /of insuline) gedurende 24 uur, 48 uur en 72 uur. 74 kD en 74-SC werden gekweekt onder omstandigheden van zowel normoxie en hypoxie 24, 48 en 72 uur zonder behandeling met geneesmiddelen. De cellen werden gewassen en opnieuw gesuspendeerd in de ROS opsporen oplossing. ROS fluorescentie werd gedetecteerd door FACS Calibur flowcytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA) en geanalyseerd met de Cell Quest software. Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd. De gemiddelde fluorescentie van ROS productie automatisch bepaald en weergegeven als het gemiddelde GEO.

Totale RNA-extractie en kwantitatieve RT-PCR

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit cellijnen met een Isogen RNA extractie kit ( Nippon Gene, Osaka, Japan). Eén ug RNA werd omgezet in cDNA met een ReverTra Ace (Toyobo) reverse transcriptiereactie kit. Het cDNA werd gebruikt als een matrijs voor de PCR. Een real-time kwantitatieve RT-PCR (RT-qPCR) werd uitgevoerd door middel van de Light Cycler instrument systeem (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Duitsland) met een Light-Cycler-FastStart DNA Master SYBR Green I kit (Roche). De tien genen die werden geanalyseerd met de RT-qPCR waren: glucose transporter 1 ( GLUT1
), aldolase C ( ALDOC
), pyruvaat dehydrogenase kinase 1 ( PDK1
), lactaat dehydrogenase A ( LDHA
) en monocarboxylaat transporter 4 ( MCT4
), Bcl-2 /adenovirus EIB 19-kDa interactie eiwit 3 ( BNIP3
), BINP3 zoals ( BNIP3L
), mitochondriale mangaansuperoxydedismutase ( MnSOD
), een mitochondriale protease LON Kopen en cytochroom oxidase subunit 4-2 ( Cox4 - 2
). De primers werden ontworpen volgens de gerapporteerde cDNA sequenties (GenBank, Bethesda, MD) (Tabel 1). Na het uitvoeren van een denaturatiestap bij 95 ° C gedurende 3 min werd PCR-amplificatie uitgevoerd met 50 cycli van 15 s denaturatie bij 95 ° C, 5 s annealen bij 60 ° C en 10 s bij 72 ° C. Kwantitatieve waarden werden genormaliseerd naar de β-actine ( ACTB
) expressie (Tabel 1). Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd en het gedurende ten minste drie keer herhaald.

Glucose opname assay

De glucoseopname in gekweekte cellen werd bepaald met een 2-deoxyglucose (2DG) Opname Meting Kit (COSMO BIO Co. Ltd., Tokyo, Japan). In het kort werden de cellen gekweekt onder een serum uitgehongerd voorwaarde voor 6 uur, gevolgd door het verder kweken gedurende 18 uur regelmatig medium aangevuld met 10% FBS. De cellen werden gedurende 24 uur onder normoxie en hypoxie. Daarna werden de cellen behandeld met of zonder 500 ng /ml insuline 18 min. Tenslotte werden de cellen behandeld met 2DG gedurende 20 minuten en onderworpen aan de meting van de opname 2DG volgens de instructies van de fabrikant. Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd en de gemiddelde waarden werden berekend.

Animal studies

Het dier protocollen werden door de Institutional Animal Care en gebruik Commissies van Saga University (protocol 24-008-0 goedgekeurd ) en gelijkvormigheid aan het BEREIKT richtlijnen voor het gebruik van dieren in het onderzoek. Vrouwelijke 4 weken oude athymische BALB /cA Jcl muizen (nu /nu) werden verkregen van Nihon Crea Co. (Osaka, Japan). Dieren werden onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden gehouden. Ze kregen steriel voedsel en geautoclaveerd water met een 12-uur licht-donker cyclus. Muizen werden gewend aan de omgeving voor 7 dagen voor de experimenten. KD of SC cellen (3 x 10 ^{6) werden subcutaan geïnjecteerd in de ruggen van de muizen (n = 9 per cellijn). Tien dagen na de subcutane inoculatie van de xenotransplantaten beide cellen werden voelbaar. Negen muizen die KD of SC xenotransplantaten werden verdeeld in drie groepen voor behandeling door glucose (8 g /kg /dag, Sigma), glucose plus insuline (GI) (1 eenheid per 3 g glucose /dag, Wako) of fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) als controlebehandeling. Elk van deze geneesmiddelen werden intraperitoneaal toegediend in drie muizen (zes tumoren totaal) per 24 uur vanaf dag 1 tot dag 11. Gedurende deze periode werden de tumoren gemeten in 2 loodrechte dimensies met een dikte elke vier dagen. De grootte van de tumor ( T Shirts) werd geëvalueerd als de maximale cut gebied en wordt bepaald door de volgende formule: T Shirts = π /4 × een
× b
, waarbij een
is de kortere as (mm) en b
is de langere as (mm). De muizen werden 12 dagen na de behandelingen met medicijnen opgeofferd en de tumoren werden geoogst voor de volgende experiment.}

kleeft caspase 3 immunohistochemie en de beoordeling van apoptose In vivo

bevroren tumoren werden ingebed met Tissue-Tek oktober Verbinding. Deze blokken werden gesneden in 4-um-dikke panelen. Voor antigen retrieval, werden de objectglaasjes verwarmd in Tris-EDTA buffer (pH 9,0) in een magnetron (500 watt) gedurende 5 min. De coupes werden vervolgens geïncubeerd met anti-gesplitst caspase 3 (1: 200, Cell Signaling Technology) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur en de DAKO Envision + System (Dako Cytomation, Glostrup, Denemarken) werd gebruikt als secundair antilichaam. De signalen werden zichtbaar gemaakt met diaminobenzidine tetrahydrochloride (0,02%). Voor de beoordeling van apoptose, gesplitst caspase 3-positieve cellen met bruin gekleurde kernen werden geteld in vijf velden bij 400x vergroting en het gemiddelde werd berekend. De immunohistochemische expressie van gesplitst caspase 3 werd blind beoordeeld en beoordeeld door een gecertificeerde patholoog (Dr. AN).

Statistische analyse

De gegevens werden geanalyseerd door een ANOVA met behulp van de Prism 5 softwarepakket ( GraphPad Software, La Jolla, CA). Voor de vergelijking tussen twee groepen werden de verschillen in de gemiddelde waarden geëvalueerd t-
test van Student en de Mann-Whitney U Electronics Test. Voor de vergelijking tussen drie of meer groepen werden Bonferroni post hoc tests voor een one-way ANOVA. Een waarde van p < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant. Alle gegevens worden uitgedrukt als gemiddelden ± SEM.

Resultaten

HIF-1α knockdown geïnduceerde apoptotische celdood onder hypoxie 58As9 maagkanker cellen

De HIF-1α expressie was beoordeeld in stabiele HIF-1α knockdown (KD) cellen en SC (als controle cellijn) cellen. Een Western blot analyse toonde dat de HIF-1α expressie volledig was neergeslagen in de KD cellen na 8 uur onder hypoxie opzichte van de SC cellen (Figuur 1A). De cel sterftecijfer werd geschat na 24 uur tot 96 uur onder normoxie en hypoxie. Het sterftecijfer was hoger in de KD cellen dan in de SC cellen onder normoxie gedurende 24 tot 96 uur, maar de verschillen waren niet statistisch significant (figuur 1B). Daarentegen werd de cel sterftecijfer in de KD cellen sterk toegenomen tijdens hypoxie en significant hoger dan die waargenomen bij de SC cellen bij 72 en 96 uur (figuur 1C). De Western blot analyse toonde aan dat gesplitst caspase 3 en cytosolische cytochroom c werd verhoogd in de KD cellen, maar niet in het SC cellen onder hypoxia gedurende 8 uur (Figuur 1D en 1E). Hypoxie geïnduceerde celdood werd ook bij andere HIF-1α knockdown maagkanker cellen 74 kD (Fig S1). Deze resultaten gaven aan dat hypoxie sterk geïnduceerde apoptose in het HIF-1α knockdown cellijn KD.

opruiming ROS teruggedraaid de apoptotische fenotype waargenomen in HIF-1α knockdown cellen

De intracellulaire ROS-niveau werd geschat en vergeleken bij de KD en SC cellen. Het ROS-niveau verhoogd in een tijdsafhankelijke wijze de KD cellen onder hypoxie, terwijl het niveau flauw werd verhoogd in de SC cellen (figuur 2A). ROS-niveau in de KD-cellen was significant hoger onder hypoxie gedurende 24 tot 72 uur dan in de SC cellen (figuur 2A). De ROS niveaus werden ook beoordeeld in de 74-SC cellen en 74-KD-cellen (Fig S2). De ROS niveaus verschilden niet tussen de 74-SC en 74-KD cellen onder normoxia (S2A figuur). Krachtens hypoxie, ROS niveaus waren in het 74 KD-cellen significant hoger dan in de 74-SC cellen 48 tot 72 uur (Fig S2B). NAC, een antioxidant, significant af het ROS-niveau in de KD cellen onder hypoxie gedurende 48 tot 72 uur (Figuur 2B). Om te kunnen beoordelen of de ROS productie induceert hypoxie-geïnduceerde celdood in KD cellen, de cel sterftecijfer met of zonder NAC werd geëvalueerd in KD cellen onder normoxia en hypoxie. NAC behandeling beïnvloedde de snelheid van celdood in de KD cellen onder normoxia (figuur 2C). Daarentegen NAC verminderde significant de celdood in de KD cellen onder hypoxie gedurende 48 tot 96 uur (figuur 2D).

HIF-1α knockdown verminderde de hypoxische inductie van verscheidene genen die betrokken zijn bij de controle van de productie van ROS

de hypoxia-geïnduceerde ROS accumulatie in de HIF-1α knockdown cellen, de mRNA expressie van tien genen die betrokken zijn bij de ROS regelmechanisme ( GLUT1
, ALDOC onderzoeken
, PDK1
, LDHA
, MCT4
, BNIP3
, BNIP3L
, LON
, COX4-2 Kopen en MnSOD
) werden geanalyseerd met behulp van een RT-qPCR. De hypoxische inductie van genexpressie werd bepaald door de voudige inductie (FI). De FI in de tien genen waren de KD cellen significant lager dan in de SC cellen (figuur 3). Wanneer verder beperkt tot hypoxische omstandigheden, de expressieniveaus van alle tien genen waren significant lager in de KD cellen dan de SC cellen. Deze resultaten toonden aan dat HIF-1α knockdown duidelijk verminderd de hypoxia-geïnduceerde expressie van de tien genen. Anderzijds, onder normoxie, de expressie van PDK1 en BNIP3L was de KD cellen significant lager dan in de SC cellen. Omgekeerd, de expressieniveaus van LON en COX4-2 waren significant hoger in de KD cellen in vergelijking met de SC cellen.

Glucose en insuline behandelingen verhoogde apoptotische celdood in cellen onder hypoxie KD

vervolgens onderzochten we of de bevordering van de opname van glucose beïnvloedt de hypoxia-geïnduceerde apoptose in cellen KD. De levensvatbaarheid van de cellen werd beoordeeld in het KD en SC cellen na behandelingen met controle (PBS), hoge glucose, insuline of hoge glucose plus insuline (GI). Hypoxie-geïnduceerde celdood werd geschat door de FI. De cel sterftecijfer onder hypoxie werd vergeleken tussen de controlebehandeling en andere behandelingen in beide cellijnen (figuur 4). In de SC cellen werden geen significante verschillen in de FI en celdood snelheid onder hypoxie waargenomen bij elk van de behandelingen (figuur 4A). In de KD-cellen, werd de FI significant verhoogd door hypoxie in alle behandelingen. In het bijzonder GI behandeling leverde de hoogste FI van alle behandelingen (figuur 4B). De cel sterftecijfer onder hypoxie was de GI-behandelde cellen significant hoger dan in de controle behandelde cellen (Figuur 4B). Om te onderzoeken of de behandelingen van invloed op de ROS productie, werd het ROS-niveau geanalyseerd in de KD-cellen. In vergelijking met normoxische omstandigheden werd het ROS-niveau significant verhoogd in de KD cellen onder hypoxische omstandigheden (Figuur 4C). Onder hypoxie, werd het ROS-niveau in KD cellen aanzienlijk verhoogd door de hoge glucose, insuline en GI behandeling in vergelijking met de behandeling te controleren. Het hoogste niveau ROS werd positief waargenomen in de GI-behandelde KD cellen (Fig 4C).

Evaluatie van de opname van glucose na insulinebehandeling

De opname van glucose mogelijkheid werd geanalyseerd in een 2DG incorporatie studie . In de SC en KD cellen onder normoxia, werd de 2DG opname significant verhoogd door de behandeling 2DG in vergelijking met onbehandelde cellen. De 2DG incorporatie werd verder vergroot door de extra insuline behandeling in beide cellen (Figuur 5A). In vergelijking met normoxia, hypoxia sterker gestimuleerd 2DG de opname in de SC cellen, met of zonder insuline (Figuur 5B). Soortgelijke bevindingen werden waargenomen in de KD cellen onder hypoxie (figuur 5B). Echter, onder hypoxie, werd minder 2DG opgenomen in de KD cellen dan in de SC cellen, met of zonder bijkomende insulinebehandeling (figuur 5B). Het mechanisme van insuline-afhankelijke glucoseopname beoordelen, de expressie van vliezige GLUT1 werd geanalyseerd in de KD cellen onder normoxie en hypoxie. Onder normoxia, werd de membraneuze GLUT1 verhoogde expressie met hoog glucosegehalte en /of insulinebehandeling in vergelijking met die zonder behandeling (figuur 5C). Vergeleken met die waargenomen onder normoxie, onder hypoxie, werd de membraneuze GLUT1 expressie verhoogd in alle behandelingen. Bovendien werd de expressie verhoogd met een hoog glucosegehalte en /of insuline behandeling, vergeleken met die van geen behandeling (figuur 5C). Met name werd de membraneuze GLUT1 expressie het sterkst toe door de hoge glucose en insuline (GI) behandeling in hypoxische cellen KD (figuur 5C). Anderzijds, de expressie van GLUT andere familie, GLUT-3 werd waargenomen in het zwak KD cellen, en deze bevinding werd niet veranderd tussen deze verschillende behandelingen (gegevens niet getoond). In deze studie werden GLUT2 en GLUT4 niet tot uitdrukking in de KD cellen.

HIF-1α knockdown plus GI behandeling sterk onderdrukt de groei van tumor xenotransplantaten in naakt muizen

Tenslotte hebben we de in vivo
effect van de GI-behandeling op de KD en SC tumor xenotransplantaten. Figuur 6A toont de experimentele opzet van het xenograft muismodel. Tien dagen na de subcutane inoculatie van SC of KD cellen werden xenotransplantaten gekweekt op de rug van naakt muizen. Op dit moment, een Western blot analyse bevestigde de HIF-1α expressie in de SC tumoren, maar niet in de KD tumoren (figuur 6B). Daarna drie geneesmiddelen, bestaande uit PBS, glucose of GI, werden intraperitoneaal geïnjecteerd in naakt muizen met een SC of KD tumor (dagelijks van dag 1 tot dag 11). De representatieve beelden van de tumordragende muizen die werden behandeld met PBS (SC-PBS en KD-PBS), glucose (SC-glucose en KD-glucose) of GI (SC-GI en KD-GI) getoond in figuur 6C . De KD-glucose en KD-GI tumoren bleek kleiner dan de andere tumoren. Figuur 6D toonden de groeicurve van de 6 tumoren. De afmetingen van de KD-glucose en KD-GI tumoren significant kleiner dan de KD-PBS tumor op dag 12. De KD-GI tumor was de kleinste. Anderzijds, in het SC muizen, was er geen significant verschil in grootte van de SC-PBS, SC-glucose en SC-GI tumoren (figuur 6D). Een immunohistochemische analyse van gesplitst caspase 3 werd uitgevoerd om de apoptose geïnduceerd door glucose of GI behandeling bepalen. De positieve expressie van gesplitst caspase3 werd vaak waargenomen in de KD-Glucose en KD-GI tumoren (figuur 6E). Echter, alle KD tumoren vertoonden een zekere gesplitst caspase 3 (figuur 6F). Daarentegen was er geen significant verschil in expressie van het caspase 3 gesplitst tussen de SC-PBS, SC-glucose en SC-GI tumoren. In de KD tumoren, de positieve uitdrukking van gesplitst caspase3 was de KD-PBS tumor significant hoger dan in de SC-tumor PBS. Bovendien is de expressie van gesplitste caspase3 was significant hoger in de KD-glucose of KD-GI tumoren dan in de KD-PBS tumor. De hoogste expressie werd waargenomen in de KD-GI tumor.

Discussie

In de onderhavige studie werden HIF-1α knockdown cellen gebruikt om te onderzoeken of letale ROS productie onder hypoxie geïnduceerd kan worden. De resultaten toonden aan dat de apoptotische celdood geïnduceerd in KD cellen, maar niet in de controle SC cellen onder hypoxie. Tegelijkertijd ROS verzameld in de knockdown cellijn volgens de duur van hypoxie. Hypoxie- geïnduceerde celdood en ROS accumulatie werden ook waargenomen in de verschillende HIF-1α knockdown 74 KD-cellen, maar niet in de controle 74-SC cellen. Bovendien NAC behandeling remde de hypoxia-geïnduceerde celdood in de cellen KD. Deze resultaten geven het optreden van hypoxie-geïnduceerde apoptose door overmatige ROS accumulatie in KD cellen en ondersteund een eerdere studie die HIF-1α knockout MEF stierf als gevolg van overmatige productie van ROS [33].

ROS voornamelijk gegenereerd de mitochondria van de ETC [17, 19]. Er werd gemeld dat de mitochondriale ROS verhoogd onder hypoxische condities [17, 19]. Als hypoxie aanhoudt, de inductie van HIF-1α leidt tot adaptieve mechanismen te verminderen ROS en herstellen redox homeostase via de opregulatie van relevante genen [19]. We aldus onderzocht of HIF-1α knock-down invloed op de mRNA expressie van tien genen die betrokken zijn bij de controle van ROS productie onder hypoxie ( GLUT1
, ALDOC
, PDK1
, LDHA Kopen en MCT4
met betrekking tot de Warburg effect; BNIP3 Kopen en BNIP3L
betrekking tot mitofagie; LON Kopen en COX4-2
in verband met de ETC, en MnSOD
een ROS aaseter). De geïntegreerde analyse van de RT-qPCR series aangetoond dat hypoxie-geïnduceerde expressie van alle tien genen significant werd onderdrukt in de KD cellen, terwijl onder normoxie, de mRNA expressie van LON en COX4-2 was significant hoger in de KD cellen dan in de SC cellen. Deze resultaten gaven aan dat de letale ophoping van ROS onder hypoxie in HIF-1α knockdown cellen door meervoudige verstoringen van de ROS controlemechanisme kan zijn. Daarom kunnen kankertherapie gericht HIF-1α effectief in het hypoxische gebied binnen maagkanker weefsel. Het mechanisme achter de opgereguleerd mRNA expressie van LON en COX4-2 in de KD cellen onder normoxia kon niet worden verduidelijkt.

Volgens de bovenstaande bevindingen, we de hypothese dat de bevordering van de opname van glucose-geïnduceerde hypoxie kan versnellen apoptose door verdere ROS productie in HIF-1α knockdown KD cellen. Zoals verwacht, de GI behandeling verhoogde de celdood in hypoxische cellen KD, die gepaard ging met verhoogde ROS productie. In de glucoseopname studie verhoogde insuline de opname 2DG in zowel de SC en KD cellen. In vergelijking met die waargenomen onder normoxia, hypoxia verhoogde de 2DG opname in de SC en KD cellen behandeld met of zonder insuline. De opname werd sterker in de SC dan KD cellen toegenomen, wat wijst op een verschil als gevolg van de verzwakte GLUT1 inductie in de hypoxische KD cellen. Anderzijds, een Western blot analyse toonde dat de membraneuze GLUT1 expressie was verhoogd bij hoge glucose en /of insuline behandelingen tegen controlebehandeling in normoxische en hypoxische cellen KD. In het bijzonder GI behandeling het sterkst steeg de membraneuze GLUT1 expressie in hypoxische KD cellen. Een eerdere studie gerapporteerd die insuline stimuleert glucose transport door het stimuleren van de translocatie van GLUT4 uit intracellulaire opslag blaasjes naar de plasmamembraan in skeletspiercellen of adipocyten [36, 37].

• PLoS ONE: Copy Number Winsten op 8q24 en 20q11-Q13 bij maagkanker komen vaker voor in de darm-Type dan Diffuse-Type
• PLoS ONE: Serum HER2 is een potentiële surrogaat voor Tissue HER2 Status bij maagkanker: een systematische review en meta-Analysis