PLoS ONE: HIF-1α induceert multidrug resistance bij maagkanker Cellen door het induceren van MiR-27a

Abstract

Deze studie had als doel om de correlatie tussen HIF-1α en miR-27a expressie en om het effect van te evalueren bepalen remming van HIF-1α uitdrukking op miR-27a expressie en resistentie tegen geneesmiddelen bij maagkanker (GC). In deze studie, real time-PCR en Western blot werden uitgevoerd om de expressie van HIF-1α in GC weefsels en cellijnen te detecteren. Vervolgens werden OCUM-2MD3 /L-OHP cellen getransfecteerd met HIF-1α-siRNA, een miR-27a bootsen of pcDNA-HIF-1α en celoverleving werd bepaald via de MTT-bepaling. De expressie van HIF-1α, miR-27a, en MDR-gerelateerde genen werd gemeten via real-time-PCR en Western blot. ChIP en dubbele luciferaseactiviteit assays werden uitgevoerd om de transcriptionele regulatie van HIF-1α en miR-27a beoordelen. De resultaten lieten zien dat transfectie met HIF-1α-siRNA aanzienlijk verlaagde niveaus van de miR-27a, resulteert in drastisch verbeterde remming van de proliferatie percentage OCUM-2MD3 /L-OHP cellen. Vergeleken met niet-getransfecteerde cellen, werd de overleving significant verminderd in de cellen getransfecteerd met HIF-1α-siRNA na behandeling met L-OHP. De cel overleving was significant verhoogd in OCUM-2MD3 /L-OHP cellen die met de miR-27a na te bootsen, terwijl HIF-1α overexpressie leidde niet tot een duidelijke verandering in de overleving van de cel. De resultaten van de duale luciferase activiteit test toonde aan dat HIF-1α verhoogt de transcriptionele activiteit van de miR27a promotor in cellen getransfecteerd met een reporter plasmide dat de stroomopwaartse promotorregio van miR27a met pcDNA-HIF-1α. ChIP analyse suggereerde dat HIF-1α direct bindt aan het promotorgebied van miR27a. Remming van HIF-1α of miR27a expressie afgenomen MDR1 /P-gp, LRP, en Bcl-2 expressie in OCUM-2MD3 /L-OHP cellen. Zo vonden we dat HIF-1α nauw geassocieerd met MDR in GC en dat HIF-1α kan MDR1 /P-gp, LRP en Bcl-2 expressie onderdrukken door het remmen van miR-27a expressie

Citation:. Zhao Q, Li Y, Tan Bb, Fan Lq, Yang Pg, Tian Y (2015) HIF-1α induceert multidrug resistance bij maagkanker Cellen door het induceren van MiR-27a. PLoS ONE 10 (8): e0132746. doi: 10.1371 /journal.pone.0132746

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, VERENIGDE STATEN

Ontvangen: 5 januari 2015; Aanvaard: 17 juni 2015; Gepubliceerd: 20 augustus 2015

Copyright: © 2015 Zhao et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidie:. het Provinciaal Natural Science Foundation van de provincie Hebei (nr H2013206311 tot Qun Zhao)

concurrerende belangen. de auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is een van de meest voorkomende kwaadaardige tumoren, waardoor ernstige schade wereldwijd [1, 2] Na jaren van technologische vooruitgang in de diagnose en behandeling van GC, hebben de incidentie en sterfte wereldwijd gedaald, maar blijft hoog in Aziatische landen [3, 4]. Momenteel maagresectie is de enige beschikbare methode voor GC genezen. Het is echter moeilijk om een ​​volledige harding te bereiken ondanks chirurgische verwijdering van de tumor, omdat de meeste patiënten lijden aan gevorderde GC na diagnose [5, 6]. Daarom chemotherapie speelt een uiterst belangrijke rol bij de uitgebreide behandeling van GC. Hoewel chemotherapie aanzienlijk gevorderd met betrekking tot de behandeling van gevorderde GC, [7, 8] de prognose voor GC steeds onvoldoende, met een 5-jaars overleving van minder dan 30% [9]. Deze prognose is vooral te danken aan de multidrug resistentie (MDR) van GC cellen. MDR in GC leidt vaak tot het falen van chemotherapie [10-12]. Daarom is er een dringende noodzaak nieuwe veelbelovende therapeutische strategieën te ontwikkelen om effectief verminderen MDR GC.

zuurstoftekort heerst in vaste tumoren en wordt geassocieerd met een verscheidenheid aan biologische functies. Op dit moment, hypoxie-induceerbare factor (HIF) -1α wordt beschouwd als nauw geassocieerd worden met hypoxie. HIF-1α sterk tot expressie gebracht in een verscheidenheid van kwaadaardige tumoren [13, 14] en fungeert als een essentiële factor om de aanpassing van tumorcellen reguleren hypoxia [15]. HIF-1α is gesuggereerd nauw geassocieerd met GC MDR [16, 17]. Het is echter niet duidelijk welke route de rol van HIF-1α GC MDR medieert.

De laatste jaren is de rol van microRNA (miRNAs) bij kanker is uitgegroeid tot een algemeen mechanisme onderzocht tumor initiatie en behandeling. miR-27a, lid van de familie miRNA, is aangetoond dat de MDR GC [18] beïnvloeden. Voorts wordt de expressie van miR-27a verhoogd in een zuurstofarme omgeving [19]. Deze bevindingen suggereren dat HIF-1α de expressie van miR-27a kunnen reguleren en beïnvloeden GC MDR. De specifieke regulerende mechanismen moeten nog worden opgehelderd. Deze studie toonde aan dat de expressie van HIF-1α en miR-27a aanzienlijk opgereguleerd in GC weefsels en cellijnen, met name in resistente cellijnen.

Transfectie met een bepaalde kleine interfererende RNA endogene HIF blokkeren -1α resulteerde in een vermindering van miR-27a expressie en de verlichting van MDR GC cellijnen. Deze nieuwe bevindingen suggereren dat remming van HIF-1α expressie onderdrukt de transcriptie van de MDR-gerelateerde genen MDR1 /P-gp, LRP en Bcl-2 te verminderen MDR GC cellen door het onderdrukken van miR-27a expressie.

Materialen en methoden

1.1 Materials

maag-cellijn OCUM-2MD3 was van professor Masakazu Yashiro in Japan Oita Medical Surgery [20]. De stabiele resistente cellijn OCUM-2MD3 /L-OHP2 werd via het kweken en selectie verkregen door onze onderzoeksgroep. De GSE-1 cellijn werd gekocht van de Cell Resource Center in Shanghai Institutes voor Biologische Wetenschappen van de Chinese Academie van Wetenschappen. RPMI 1640 kweekmedium en trypsine werden gekocht bij Gibco Company; Trizol reagens en Lipofectamine 2000 transfectiereagens werden gekocht bij Invitrogen. De reverse transcriptie kit en fluorescentie kwantitatieve PCR-reagentia werden verkregen van Promega Corporation. PCR-primers en kleine interfererende RNA werden gesynthetiseerd door Shanghai Biological Engineering Company. Het eiwit extractie kit werd verkregen van Beyotime Company, China. Primaire antilichamen tegen HIF-1α, MDR1 /P-gp, GST-π, LRP, Bcl-2, TS of GAPDH werden gekocht van Santa Cruz. MTT werd verkregen van Sigma. Ons onderzoek werd goedgekeurd door de ethische commissie van de vierde Affiliated Hospital van Hebei Medical University.

1.2 Klinische monstervoorbereiding

Alle 65 patiënten met GC werden geselecteerd na maagresectie en pathologische bevestiging in de Vierde ziekenhuis van Hebei Medical University, waaronder 42 mannen en 23 vrouwen in de leeftijd 60,5 ± 8,1 jaar die geen preoperatieve bestraling of chemotherapie hadden gekregen. Kanker en para-carcinoom weefsels (ongeveer 1,0 cm x 0,5 cm x 0,5 cm) werden uit elke patiënt, en de monsters werden snel bevroren in vloeibare stikstof en vervolgens overgebracht naar -80 ℃ behoud. Alle deelnemers ondertekenden het informed consent.

1.3 Cel cultuur en transfectie

De OCUM-2MD3, OCUM-2MD3 /L-OHP en GSE-1 cellijnen werden gekweekt in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U /ml penicilline en 100 mg /ml streptomycine. Met name, het medium van de OCUM-2MD3 /L-OHP cellen behandeld met L-OHP in een concentratie van 75 ug /ml om hun resistentie fenotype, een week te behouden voor de operatie om de behandeling te stoppen. De cellen werden geïncubeerd in een bevochtigde 5% CO _{2 atmosfeer bij 37 ° C}

Drie HIF-1α-siRNA sequenties werden ontworpen met behulp BLOCK-iT RNAi Designer (sequentie 1:. GAGGAAACUUCUGGAUGCUGGUGAUtt; sequentie 2: GGAUGCUGGUGAUUUGGAUAUUGAAtt, sequentie 3: CAGGACAGUACAGGAUGCUUGCCAAtt), waarvan elk respectievelijk werd gehybridiseerd met hun complementaire sequentie en getransfecteerd in de OCUM-2 MD3 /L-OHP GC cellen. Een niet-specifiek siRNA sequentie (NS-siRNA: GAGUGGGUCUGGGUCUUCCCGUAGAtt) werd gebruikt als een negatieve controle. De miR27a nabootsende sequentie was 5'-UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC-3 '. Menselijke full-length HIF-1α coden sequentie werd gesubkloneerd in pcDNA3.1 vector. pGL3-miR27a-luc werden pcDNA-HIF-1α, pGL3-Basic en pRL-TK plasmiden geconstrueerd en bewaard in ons laboratorium.

De GC-cellen werden uitgezaaid in 6-well platen voor 24 uur vóór transfectie bij een dichtheid van 4 x 10 ^{5 cellen /ml. De plasmidevectoren, siRNA of miR27a nabootser werd getransfecteerd in de GC cellen of geneesmiddel-resistente cellen met het transfectiereagens Lipofectamine volgens de instructies van de fabrikant. Vervolgens werden de cellen gewassen met serumvrij RPMI 1640 ontbreekt antibiotica. De transfectie-efficiëntie werd 24 uur later gemeten, gevolgd door de volgende experimenten.}

1,4 MTT assay

GC normale weefsels en para-carcinoom weefsel werd gehomogeniseerd enkelvoudige celsuspensies te bereiden door filtreren door een 300 maas koper raster. De GC cellen gedigereerd behulp 0,02% EDTA-0,25% trypsine werden geënt bij een dichtheid van 5 x 10 ^{4 cellen /ml in 96-well platen. Zodra de cellen bereikt ongeveer 60% confluentie werd HIF-1α-siRNA getransfecteerde of een chemotherapeutisch geneesmiddel (150μg /ml L-OHP) aangebracht. Elke groep bestond uit zes putjes. Vervolgens 20 ui 5 mg /ml MTT werd toegevoegd gedurende 4 uur voor het einde van het experiment. De cellen werden gedurende 4 uur en vervolgens werd het kweekmedium weggegooid. Vervolgens werd 150 pl DMSO toegevoegd aan elke well, en de OD-waarden werden gemeten bij 490 nm met een microplaat reader na het schudden de plaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Experimenten werden driemaal herhaald.}

1,5 RNA-isolatie en kwantitatieve RT-PCR

Totaal RNA werd geëxtraheerd met behulp van Trizol éénstapswerkwijze en 2 ug RNA werd gebruikt voor reverse transcriptie tot cDNA matrijs te genereren. De relatieve mRNA-niveaus werden bepaald via kwantitatieve PCR, GAPDH diende als een interne referentie gen. De PCR-parameters waren als volgt: 95 ° C gedurende 5 min gevolgd door 45 cycli van denaturatie bij 94 ° C gedurende 30 s en gloeien bij 60 ° C gedurende 30 s. De primer sequenties werden ontworpen met behulp van Primer 5.0 en werd gezocht naar specificiteit. De primersequenties zijn als volgt: HIF-1α (93 bp): (F) 5'-GACAGCCTCACCAAACAGAG-3 'en (R) 5'-CTCAAAGCGACAGATAACACG-3'; MDR1 (126 bp): (F) 5'-GAATGTTCAGTGGCTCCGAG-3 'en (R) 5'-ACAATCTCTTCCTGTGACACC-3'; GST-π (151 bp): (F) 5'-ATACCATCCTGCGTCACCTG-3 'en (R) 5'-TCCTTGCCCGCCTCATAGTT-3'; Bcl-2 (98 bp): (F) 5'-TGTGTGGAGAGCGTCAACC-3 'en (R) 5'-TGGATCCAGGTGTGCAGGT-3'; LRP (129 bp): (F) 5'-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 'en (R) 5'-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3'; TS (129 bp): (F) 5'-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 'en (R) 5'-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3'; en GAPDH (138bp): (F) 5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3 'en (R) 5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'. De kwantitatieve PCR-resultaten werden berekend met behulp van de 2 ^{-ΔΔCt methode}

1.6 Western Blot

De weefsels en cellen monsters werden gelyseerd met behulp van RIPA lysis buffer. 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,0, 0,2 mM Na3VO4, 0,2 mM fenylmethylsulfonylfluoride en 0,5% NP-40. Gelijke hoeveelheden van het eiwit monsters werden gescheiden op 10% polyacrylamide SDS-gels (SDS-PAGE) en werden electroforese een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan (Amersham Pharmacia Biotech). De membranen werden geblokkeerd met 5% BSA gedurende 2 uur en geïncubeerd met het primaire antilichaam overnacht bij 4 ° C. De membranen werden gedurende 2 uur in een mierikswortel peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam. De doelbandbreedtes werden gedetecteerd onder toepassing van een versterkte chemiluminescentie (ECL) detectie kit (Santa Cruz, USA). β-actine werd gebruikt als endogene controle gen. Het experiment werd driemaal herhaald.

1,7 Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) test

ChIP assays werden uitgevoerd volgens de werkwijze van Wang et al. [21]. Cellen met verschillende behandelingen werden gefixeerd met 1% formaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en beëindigd door een eindconcentratie van 0,125 M glycine. Vervolgens werden de cellen gelyseerd middels 300 pl lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 0,5% deoxycholaat, en proteaseremmers). De cellysaten werden gesoniceerd in ijs waterbad chromatine fragmenten op ongeveer 600 bp, zoals bepaald door agarose gelelektroforese. Na centrifugatie bij 13.000 rpm gedurende 10 minuten werden de supernatanten genomen en pre-vrijgegeven voor 15 min bij 4 ° C via incubatie met 30 pl proteïne A-Sepharose kralen en gescheurd zalmsperma DNA. Na centrifugatie bij 13.000 rpm gedurende 5 minuten werden de supernatanten verdeeld in drie gelijke delen: één voor input, de andere twee voor immunoprecipitatie met of zonder HIF-1α antilichaam. De volgende dag, de immuuncomplexen werden geprecipiteerd met proteïne A-Sepharose kralen en gescheurd zalmsperma DNA, waarna de korrels gewonnen na tweemaal met de wasbuffer I (20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100 en 2 mM EDTA), gevolgd door wasbuffer II (20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 500 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100 en 2 mM EDTA) en wasbuffer III (10 mM Tris-HCl, pH 8,1, 0,25 M LiCI, 1% Nonidet P-40, 1% deoxycholaat, en 1 mM EDTA), en de laatste wasbuffer IV (10 mM Tris-HCl, pH 8,1 en 1 mM EDTA). De immunoprecipitaten werden geëlueerd met 200 ui elutiebuffer (1% SDS en 0,1 M NaHCOs _{3), gevolgd door incubatie bij 65 ° C overnacht. De volgende dag, DNA van elk monster werd geïsoleerd en PCR werd uitgevoerd om de promoter segmenten met een HIF-1α bindingsplaats amplificeren.}

1,8 Luciferasebepalingen

De cellen gekweekt tot 70% confluentie en vervolgens werden getransfecteerd in triplo met pGL3-miR-27a-luc, pcDNA-HIF-1α of pGL3-Basic, samen met pRL-TK. Na 48 uur transfectie werden de cellen verzameld en de luciferaseactiviteit werd gemeten met de Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI) volgens het protocol van de fabrikant. De luciferase activiteiten van pRL-TK werden diende als interne controle.

1.9 Statistische analyse

De resultaten zijn weergegeven als de gemiddelden ± S.D. ANOVA en Dunnett's test werd uitgevoerd met behulp van SPSS 11.5 software.

Resultaten

1 HIF-1α en miR27a zijn verschillend tot expressie tussen de maag para-carcinoom weefsel en GC weefsel

De expressie van HIF-1α GC weefsel tegen gastrische para-carcinoomweefsel werd bepaald via qRT-PCR en Western blot, en de gevoeligheid van L-OHP cellen werd bepaald via de MTT-bepaling. HIF-1α (Figuur 1A, 1B en 1C, qPCR en Western blot) en miR27a (figuur 1D, qPCR resultaten) waren opgereguleerd in GC weefsel vergeleken met gastrische para-carcinoom weefsel. De MTT-test toonde aan dat de cel overleving was groter in GC weefsel dan in de maag para-carcinoomweefsel bij L-OHP de eencellige suspensies weefsel (figuur 1E, histogram resultaten) toegevoegd.

2 HIF -1α en miR27a zijn verschillend tot expressie tussen een maagslijmvlies epitheliale cellijn en een GC cellijn

de expressie van HIF-1α was de hoogste in OCUM-2MD3 /L-OHP en OCUM-2MD3 cellen, sequentieel, en de laagste in GES-1 cellen (figuur 2A, 2B en 2C, qPCR en Western blot). Bovendien is de expressie van miR27a getoonde dezelfde trend, waarbij OCUM-2MD3 /L-OHP cellen getoonde hoogste expressie, gevolgd door OCUM-2MD3 cellen en GSE-1 cellen getoonde laagste expressie van miR-27a (figuur 2D, qPCR resultaten). De MTT-test bleek dat wanneer L-OHP de drie cellijnen werd toegevoegd, OCUM-2MD3 /L-OHP cellen vertoonden de hoogste celoverlevingssnelheid, gevolgd door OCUM-2MD3 cellen en dat GSE-1 cellen vertoonden de laagste celoverleving rate (figuur 2E, histogram resultaten).

3 HIF-1α-siRNA onderdrukt de uitdrukking van miR27a en de drug weerstand van OCUM-2MD3 /L-OHP cellen

Western blot analyse toonde aan dat het mRNA en eiwitniveaus van HIF-1α daalde in verschillende mate in OCUM-2MD3 /L-OHP cellen die met drie paar HIF-1α-siRNA, terwijl HIF-1α expressie veranderde niet in de cellen getransfecteerd met controle-siRNA. HIF-1α expressie bleek zeer sterk dalen, met ongeveer 90%, met behulp HIF-1α-siRNA-2 (Figuur 3A). Zoals getoond in figuur 3B, HIF-1α expressie daalde in deze cellen op een dosis-afhankelijke wijze, waarbij HIF-1α expressie daalde met meer dan 95% in cellen getransfecteerd met 80 nM HIF-1α-siRNA-2, wanneer HIF- 1α-siRNA 2 werd verder getransfecteerd in een dosis van 20 nM, 40 nM of 80 nM. Voorts werd de maximale remmende effect waargenomen 48 uur na transfectie (Figuur 3C).

miR27a expressie was significant verlaagd na transfectie van de OCUM-2 MD3 /L-OHP cellen met HIF-1α-siRNA-2 (figuur 3D). De MTT-test gaf aan dat de cel overleving significant af na behandeling van HIF-1α-siRNA-2 getransfecteerde OCUM-2 MD3 /L-OHP cellen met L-OHP vergelijking met niet-getransfecteerde cellen (figuur 3E).

4 Effecten van miR27a op de MDR van OCUM-2MD3 /L-OHP cellen

de expressie van miR27a werd up-gereguleerd in OCUM-2MD3 /L-OHP cellen wanneer de miR27a mimic was co- getransfecteerd in deze resistente GC cellen die getransfecteerd waren met HIF-1α-siRNA (figuur 4A). Echter geen significant verschil in de expressie van HIF-1α werd gedetecteerd in OCUM-2MD3 /L-OHP cellen na transfectie (Figuur 4B en 4C, qPCR en Western blot).

De MTT-bepaling toonde dat het overleven snelheid van OCUM-2MD3 /L-OHP cellen werd duidelijk toegenomen na transfectie met de miR27a mimische (figuur 4D, histogram resultaten).

5 HIF-1α induceert de transcriptie van miR27a in OCUM-2MD3 cellen

de expressie van HIF-1α was significant verhoogd in OCUM 2MD3-cellen die met het eukaryote expressieplasmide pcDNA-HIF-1α gedurende 48 uur (figuur 5A). Bovendien miR27a expressie was duidelijk up-gereguleerd (figuur 5B). Dus, deze resultaten suggereren dat HIF-1α is een kritieke factor die de transcriptie van miR27a beïnvloedt. Daarom hebben we een luciferase reportergen plasmide dat een 2 kb sequentie stroomopwaarts van het promotorgebied van miR27a, die gecotransfecteerd met pcDNA-HIF-1α in de cellen was. DLA gegevens toonden aan dat HIF-1α versterkte de promotoractiviteit van miR27a na gelijktijdige transfectie (figuur 5C). ChIP analyse verder bevestigd dat HIF-1α direct gebonden aan het promotorgebied van miR27a (figuur 5D). De resultaten gaven aan dat HIF-1α de transcriptie van miR27a in OCUM 2MD3-cellen bevorderen door direct te binden aan de promoter regio miR27a.

6 Remming van HIF-1α behulp siRNA onderdrukt de expressie van geneesmiddelresistentie-gerelateerde genen

Zoals getoond in figuur 6, de remming van HIF-1a dramatisch onderdrukt de expressie van MDR1 /P-gp, LRP en Bcl-2 in OCUM-2MD3 /L-OHP cellen, maar veranderde niet significant de expressie van de GST-π of TS. (Figuur 6).

7 Remming van miR27a vermindert van resistentie-gerelateerde genexpressie in OCUM-2MD3 /L-OHP cellen

miR27a werd onderdrukt in resistente GC OCUM-2MD3 /L-OHP cellen die met de anti-miR27a-sequentie (figuur 7A). Voorts na deze transfectie, de expressie van MDR1 /P-gp, LRP en Bcl-2 nam significant af, terwijl er geen significant verschil in de expressie van GST-π of TS (figuur 7B, 7C en 7D, qPCR en Western gedetecteerd vlek). (Fig 7)

Discussie

Hoewel de wereldwijde incidentie van GC lijkt te zijn afgenomen in de afgelopen jaren een hoge incidentie van GC aanhoudt, de gezondheid van mensen in Azië [22] ernstig in gevaar te brengen . De MDR GC cellen bijdraagt ​​aan de slechte prognose van GC, waarbij zuurstoftekort speelt een cruciale rol. In de huidige studie, hebben we de stabiele OCUM-2MD3 /L-OHP cellijn die resistent is tegen L-OHP. Onze gegevens blijkt dat GC weefsels en cellijnen vertonen sterker geneesmiddelresistentie dan normaal maagepitheel weefsels en cellijnen. We vonden ook dat drug-resistente cellen ontwikkelen veel sterker MDR. Onze resultaten toonden verhoogde expressie van HIF-1α in GC weefsels en cellijnen, en de hoogste expressie van HIF-1α werd gedetecteerd in een resistente cellijn. Daarom stellen we dat HIF-1α bijdraagt ​​aan de ontwikkeling van MDR GC cellen.

De HIF-1α gen codeert voor een eiwit dat bestaat uit 826 aminozuren met een molecuulgewicht van 120 kDa [23]. Vele studies hebben bevestigd dat verhoogde expressie van HIF-1α sterk geassocieerd met het ontstaan ​​en de ontwikkeling van tumoren [24-28]. Andere studies hebben gesuggereerd dat overexpressie van HIF-1α verhoogt de drug-resistente eigenschappen van verschillende tumorcellen [29-32]. Bovendien, onze studie aangetoond dat GC weefsels en cellijnen vertonen grotere resistentie tegen chemotherapeutische geneesmiddelen dan maag para-carcinoom weefsels en maagslijmvlies cellijnen. Detecteerden we ook de meest potente drug-resistentie in cellen GC. De mechanismen die HIF-1α regelt MDR hebben nog niet duidelijk in GC cellen. Daarom hebben we verder onderzocht de effecten van HIF-1α de MDR eigenschappen van cellen via GC gen interferentie en kloneringstechnieken. RNA interferentie (RNAi) heeft voordelen specificiteit, efficiëntie en duurzaamheid getoond voor de regulering van doelwitgenexpressie [33]. Onze gegevens geven aan dat remming van HIF-1α aanzienlijk verminderd geneesmiddelenresistentie in OCUM-2MD3 /L-OHP cellen. Bovendien hebben we aangetoond dat geneesmiddelresistentie dramatisch was verhoogd pcDNA-HIF-1α, dat werd gebruikt om HIF-1α overexpressie werd getransfecteerd in niet-resistente cellijnen GC. Onze resultaten gaven aan dat HIF-1α een essentiële rol in de ontwikkeling van MDR GC speelt.

Recente studies hebben aangetoond dat MDR nauw verwant met miRNAs in tumoren [34-36]. Hu heeft gemeld dat het inactiveren van miR-27a de MDR eigenschappen van GC cellen [18] kunnen omkeren. Bovendien, het is gemeld dat miR-21, miR-27a, miR-210 en miR-181b waren up-gereguleerd via de HIF route in de zuurstofarme omgeving op basis van een gen-chip test [19]. Volgens onze resultaten werd HIF-1α positief geassocieerd met de expressie van miR-27a in GC weefsels en cellijnen, en remming van HIF-1α daalde miR-27a. Daarentegen overexpressie van HIF-1α induceerde de expressie van miR-27a. Deze resultaten gaven aan dat HIF-1α de expressie van miR-27a. Bovendien zijn onze studie toonde aan dat miR-27a bootst gered van de drug-resistentie eigenschappen van HIF-1α knockdown cellen. Belangrijker, HIF-1α direct bindt aan en bevordert miR27a transcriptie geven dat HIF-1α regelt de MDR GC via miR-27a.

Wij karakteriseerden de expressie van genen die nauw verbonden zijn met MDR, waaronder MDR1 /P-gp, GST-π, LRP, Bcl-2 en TS, voor en na de modulatie van HIF-1α expressie in GC cellen om het mechanisme waarmee de HIF-1α-miR-27a pad regelt de MDR GC helderen . We hebben aangetoond dat remming van HIF-1α expressie verminderde de expressie van MDR1 /P-gp, LRP en Bcl-2. De expressieniveaus van deze genen waren significant verhoogd wanneer de cellen werden getransfecteerd met de miR-27a bootsen, terwijl de expressieniveaus van GST-π en TS werd niet significant gewijzigd. Volgens deze bevinding, over-expressie van HIF-1 a krachtig opgereguleerd expressie van MDR1 /P-gp, LRP en Bcl-2 in de GC-OCUM 2MD3 cellijn. Daarom is onze gegevens tonen aan dat het HIF-1α-miR-27a route bemiddelt MDR woningen in GC door het induceren van MDR1 /P-gp, LRP en Bcl-2 expressie.

Onze studies tonen aan dat HIF-1α en miR -27a zijn up-gereguleerd in GC weefsels en cellijnen. HIF-1α werkt als een stroomopwaartse regulator van miR-27a. HIF-1α-miR-27a signalering verbetert de eigenschappen van MDR door het induceren van de expressie van MDR1 /P-gp, LRP en Bcl-2 in GC. Deze resultaten suggereren dat HIF-1α-miR-27a route een cruciale rol bij de initiatie van MDR in menselijke GC, welke als een nieuw therapeutisch doelwit kunnen dienen voor MDR GC speelt.

Ondersteunende informatie
S1 File. Gegevens van MTT en Western Hotel doi:. 10.1371 /journal.pone.0132746.s001
(ZIP)

• PLoS ONE: resistent zijn tegen meedere Related Lang niet-coderende RNA Expressie Profiel Analyse van maagkanker
• PLoS ONE: Regelgeving B cel functie wordt onderdrukt door roken en obesitas in H. pylori-geïnfecteerde personen en is gecorreleerd met een verhoogd risico op maagkanker