PLoS ONE: Een Compenserende rol van NF-KB p53 in reactie op 5-FU-gebaseerde chemotherapie voor maagkanker cellijnen

Abstract

Ondanks de opmerkelijke verbetering van postoperatieve 5-FU-gebaseerde adjuvante chemotherapie, de terugval van maagkanker patiënten die curatieve resectie gevolgd door de adjuvante chemotherapie ondergaan blijft aanzienlijk. Daarom is het belangrijk om voorspelling markers voor chemotherapeutische werkzaamheid van 5-FU. Recent toonden we NF-kB als kandidaat terugval voorspelling biomarker bij maagkanker. Om de biologische betekenis van NF-KB in het kader van 5-FU gebaseerde chemotherapie evalueren, analyseerden wij de NF-KB-afhankelijke biologische reactie van 5-FU behandeling bij maagkanker cellijnen. Zeven genen geïnduceerd door 5-FU behandeling in een NF-KB-afhankelijke wijze werden geïdentificeerd, waarvan vijf bekende p53 doelen. Knockdown van RELA
, waarbij de p65 subeenheid van NF-KB codeert, verminderd zowel p53 en p53 eiwitniveaus doelwit. Daarentegen werd NF-KB onverlet TP53
knockdown. We hebben ook aangetoond dat cellijnen dragende Pro /Pro homozygotie in codon72 van p53 exon4, wat belangrijk is voor NF-KB binding aan p53, zijn beter bestand tegen 5-FU dan Arg /Arg homozygotie. Wij concluderen dat NF-KB speelt een belangrijke rol in de respons op 5-FU behandeling bij maagkanker cellijnen, met een mogelijke compensatie functie van p53. Deze resultaten suggereren dat NF-KB is een mogelijke 5-FU-chemosensitivity voorspelling marker die kunnen weerspiegelen 5-FU geïnduceerde stressrespons routes, waaronder p53

Citation:. Endo F, Nishizuka SS, Kume K, Ishida K, Katagiri H, Ishida K, et al. (2014) een compenserende rol van NF-KB p53 in reactie op 5-FU-gebaseerde chemotherapie voor maagkanker cellijnen. PLoS ONE 9 (2): e90155. doi: 10.1371 /journal.pone.0090155

Editor: Thomas G. Hofmann, de Duitse Cancer Research Center, Duitsland

Ontvangen: 17 oktober 2013; Aanvaard: 28 januari 2014; Gepubliceerd: 27 februari 2014

Copyright: © 2014 Endo et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd gesteund door MIAST (Medische Innovatie door Advanced Wetenschap en Technologie) project van Grant-in-Aid for Strategic Medical Science Research Center van het ministerie van Onderwijs, Cultuur, Wetenschap en Technologie van Japan, 2010-2014 (SSN, K.Ku. GW); en Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek (C) (11863286) (S.S.N.), en (12.877.914) (K.Ko.). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

de meeste maagkanker ter wereld is gediagnosticeerd in Azië [1], waarbij de standaard behandeling van gevorderde maagkanker blijft chirurgie en chemotherapie. Recent ontwikkelde adjuvante chemotherapeutische behandelingen na curatieve gastrectomie voor gevorderde maagkanker hebben opmerkelijke vooruitgang geboekt op het gebied van het beheersen van terugval en ziektevrije overleving, met name in de Japanse bevolking [2], [3]. Echter 30-40% van de patiënten nog steeds ervaren recidief ondanks chemotherapie na curatieve gastrectomie [3], wat suggereert dat patiënten selectie op moleculaire informatie potentieel zeer effectief voor het verhogen van chemotherapie veroorzaakte niet-recidief overlevingskansen zijn.

om te selecteren op maagkanker patiënten die kunnen profiteren van chemotherapie, is het belangrijk om individuele gevoeligheden begrijpen voordat chemotherapie [4]. Postoperatieve adjuvante chemotherapie van maagkanker biedt de mogelijkheid om patiënt-afgeleide tumors testen voordat ze chemotherapie. In een poging om potentiële biomarkers in deze instelling op eiwitniveau, we eerder gemeld een screening panel cellijn systeem met kwantitatieve eiwitexpressie profielen met omgekeerde fase Protein Arrays (RPPAs) [5], [6] in combinatie met een cel- gebaseerde groei assay systeem dat gebaseerd is op het concept van NCI-60 cellijn screening panel [7], [8]. Kandidaat biomarkers werden geïsoleerd op basis van correlatiecoëfficiënten van eiwitexpressie en drugs gevoeligheid matrix en vervolgens verder gevalideerd met behulp van chirurgisch verwijderd specimens [9]. Op basis van deze aanpak identificeerden we twee biomarkers op eiwitniveau, zoals NF-KB en JNK, waarvan de spiegels had goede correlatie met chemotherapeutische respons. De hogere expressie van NF-kB leek te correleren met een slechtere prognose, terwijl JNK toonde een negatieve correlatie. Deze merkers werden gevalideerd op moleculair niveau met behulp van gastrointestinale kanker cellijnen. Er is aangetoond dat siRNA-gemedieerde knockdown van p65 vooral ten koste 5-FU gevoeligheid onder momenteel gebruikte chemotherapeutica; maar dit is niet het geval voor JNK knockdown [9]. We concluderen dat de NF-KB speelt een dominante rol in 5-FU behandeling en JNK kan een indicator van chronische ontsteking van de slijmvliezen gastrische achtergrond [10] zijn. In het verlengde van deze validatie studie hebben we getracht deze eiwitten functioneel te verkennen en te verduidelijken de rol van NF-KB als een stress-induceerbare transcriptiefactor gedurende 5-FU behandeling. We evalueerden de rol van p53 na 5-FU-gemedieerde transactivatie van NF-KB [10], [11], omdat het bekend is dat p53 wordt geactiveerd in reactie op deze genotoxisch [12]. In deze studie rapporteren we een mogelijke compenserende rol van NF-KB voor p53 door middel van analyse van een p53-NF-KB binding polymorfe site, codon 72 van p53. Tezamen suggereren deze bevindingen dat NF-KB /p53-codon72 een robuuste biomarker voor 5-FU gevoeligheid kan zijn.

Materialen en Werkwijzen

Cellijnen

Negen menselijke maag kankercellijnen, waaronder Kato-III, KE39, MKN74, MKN7, NUGC4, GSS, GCIY en MKN45 werden verkregen van de RIKEN Cell Bank Bioresource Center. IWT-1 was een de novo
cellijn die in ons laboratorium vastgesteld op basis van een Japanse mannelijke maagkanker patiënt die peritonitis carcinomatosa hadden een recidief. Het gebruik van IWT-1 cellijn is goedgekeurd door de Iwate Medical University Institutional Review Board (H25-116 en HG H25-15) en de familie van de donor patiënt die ten tijde van de oprichting van de cellijn was overleden met een schriftelijke geïnformeerde toestemming met betrekking tot het nemen van de monsters en het maken van de cellijn. Cellen werden gekweekt tot 70-80% confluentie in RPMI-1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C in aanwezigheid van 5% CO _2.

Bereiding van cellysaat

De cellen werden door centrifugeren geoogst en de celpellets werden gelyseerd middels Roze buffer die 9 M ureum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA), 4% 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1 -propanesul-fonate (CHAPS, Calbiochem, Merck Millipore, Darmstadt, Duitsland), 2% pH 8,0-10,5 pharma-Lyte (GE Healthcare Japan, Tokyo, Japan), en 65 mM DTT (GE Healthcare Japan, Tokyo, Japan) als eerder beschreven [5], [13].

Western Blot

SDS-PAGE werd uitgevoerd onder toepassing NuPAGE 4-12% Bis-TrisGel elektroforese (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), XCell Sure Lock Mini-cellen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), en adapter PAC HC (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). De opgeloste eiwitten op de gel werden overgebracht op een nitrocellulosemembraan met behulp iBlot Dry Blotting System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). De verkregen membranen werden geblokkeerd met 5% iBlot (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) en 0,1% Tween-20 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) in TBS (TBST) gedurende 1 uur. Membranen werden vervolgens geïncubeerd met de aangegeven primaire antilichamen, waaronder pan-actine, p53 (Thermo Scientific, Kalamazoo, MI, USA); p21, TIGAR en PUMAα /β (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA); en NF-KB, α-tubuline en PCNA (Cell Signaling Technology Japan, Tokyo, Japan). Vervolgens werden de membranen tweemaal 5 minuten met TBST, geïncubeerd met een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam gedurende 1 uur gewassen en vervolgens gedurende 5 minuten in TBST tweemaal gewassen. Chemiluminescentiedetectie reagentia werden geïncubeerd met membranen voor 1-5 minuten en daarna werden beelden verkregen middels Image Quant LAS500 (GE Healthcare Japan, Tokyo, Japan). Om eiwit inductie evalueren met 5-FU werden western blots gekwantificeerd met behulp van ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).

Immunocytochemie

De cellen werden gekweekt tot 70-80 % confluentie in RPMI-1640 aangevuld met 10% FBS in 4-kamer polystyreen verblijf weefselkweek behandelde objectglaasjes en vervolgens behandeld met 5-FU, zoals aangegeven in elk experiment. Nadat de cellen werden blootgesteld aan 50 uM 5-FU gedurende 4 uur om een ​​vroege transcriptionele respons zien, werden ze gefixeerd in 4% paraformaldehyde, gepermeabiliseerd met behulp 0,2% Triton X-100 in PBS en gekleurd met DAPI (0,6 uM DAPI, 50 gl RNase en 5 ml PBS) bij kamertemperatuur gedurende 12 min. Cellen werden vervolgens geïncubeerd met de volgende primaire antilichamen: anti-NF-KB p65, fosfo-NF-KB p65 (Ser536) en fosfo-p53 (Ser15) (Cell Signaling Technology Japan, Tokyo, Japan) en p53 (Thermo Scientific , Kalamazoo, MI, USA). Tenslotte werden de cellen geïncubeerd met ofwel Alexa Fluor488- of 568-geconjugeerd secundair antilichaam (Life Technologies Japan, Tokyo, Japan). Een BX43 fluorescentiemicroscoop (Olympus, Tokyo, Japan) werd gebruikt voor het verwerven.

Genexpressie

MKN45 cellen werden geoogst na behandeling met of zonder 50 pM 5-FU gedurende 4 h . RNA werd vervolgens geëxtraheerd uit de geoogste cellen en genexpressie profilering werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant (of Afdrukken G3 Human GE8 × 60 K, Agilent Technologies Japan, Tokyo, Japan). Ruwe data werden voor het eerst genormaliseerd door deling van elke probe signaal door de 75 ^{e percentiel van het hele signaal. Elke microarray experiment werd in tweevoud resulteerde in twee controlegroepen en twee 5-FU behandeling microarray datasets. Genen die differentieel tot expressie als reactie op 5-FU identificeren werd elk besturingsdata-set afzonderlijk vergeleken elke 5-FU behandeling set (4 vergelijkingen). Differentieel tot expressie gebrachte genen waren die een verandering in expressie >had; 2 maal in elke vergelijking. We identificeerden de laatste set van 10 differentieel tot expressie van genen op basis van hun frequentie in de 4 vergelijkingen [14]. Om de reproduceerbaarheid van deze veranderingen expressie te bevestigen, kwantitatieve real-time RT-PCR van 5-FU behandelde monsters bij 0, 4, 8, 12 en 24 uur uitgevoerd voor elk gen. Primersequenties worden in tabel S1. Genen geïnduceerd door 5-FU, analyse van promoter bindingsplaatsen werd uitgevoerd met JASPAR algoritme (JASPAR, http://jaspar.genereg.net/). Een 1000 bp promotor sequentie specifiek onderscheidenlijke genen verkregen uit transcriptionele regulerende element Database (http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/tred.cgi?process=home). Bindende plaatsen werden voorspeld door het scannen van promoter sequenties met de consensus sequenties van NF-KB en p53 met 70% van het profiel score drempel.}

RELA en TP53 Gene Knockdown

De cellen werden gekweekt tot 70-80 % confluentie in RPMI-1640 aangevuld met 10% FBS in 6-well celkweekplaten en vervolgens behandeld met NF-kB p65 of p53 siRNA (Cell Signaling Technology Japan, Tokyo, Japan) gedurende 48 h. Kort samengevat, werd uitgevoerd onder toepassing knockdown Trans IT-TKO (Mirus Bio Corporation, Madison, WI, USA) bij een concentratie van 3% gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Geschikte concentraties van siRNA's voor elke cellijn werd gemengd met de Trans IT-oplossingen TKO gevolgd door 20 minuten incubatie bij kamertemperatuur. De siRNA concentraties waren als volgt: 100 nM siRNA voor p65 MKN45 en MKN74 cellen, en 150 nM voor GSS en Kato III-cellen; en 100 nM siRNA voor p53 MKN45 en GSS cellen, en 50 nM voor MKN74 cellen. Na 48 uur werden cellen geoogst en eiwitniveaus werden door Western blot. Twee siRNA constructen die verschillende sequenties op hetzelfde doelgen werd voor elk gen knockdown specificiteit te bevestigen. Celcyclusverdeling werd berekend volgens de Tali Image-based Cytometer (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Om het maximale effect van siRNA op de 5-FU respons zien, werd het middel 48 uur toegevoegd siRNA werd getransfecteerd, en de respectieve celcyclus werd gemeten na 24 uur incubatie met 5-FU. Alle experimenten werden minstens driemaal herhaald.

TP53 Status en Codon72 Variant

DNA werd geëxtraheerd uit maagkanker cellijnen gebruikt QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen Japan, Tokyo, Japan). PCR-amplificatie voor de p53
exon4 codon72 variant (Tabel S1) en de p53
exon5-9 mutatie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [15], [16]. Elk PCR-product werd bepaald met behulp van de ABI PRISM 3030xl genetische analysator (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) volgens het protocol van de fabrikant. Sequencing resultaten werden geanalyseerd onder toepassing FinchTV (PerkinElmer Japan, Tokyo, Japan) en MEGA 5,1 Beta 3 [17].

Groei Onderdrukking Assay

Tienduizend cellen per putje werden geënt in een 96 putjes microplaat. Vierentwintig uur later werden de cellen behandeld met 5-FU gedurende 24 uur. Na 5-FU behandeling, werd de fractie van levende cellen gemeten met de Cell Counting kit-8 (DOJINDO Molecular Technologies, Kumamoto, Japan) en een TriStar LB 941 microplaat lezer (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Duitsland). Vijftig procent groeiremming concentratie (GI _{50) werd berekend met Prism software (Graph Pad Software, La Jolla, CA, USA). De GI 50-waarden werden gebruikt om correlaties tussen 5-FU werkzaamheid en eiwit niveaus op basis van de Pearson's product-correlatiecoëfficiënt bepalen ( r
).}

Resultaten

Fluorouracil induceert NF-KB

Als typische NF-KB gedrag in respons op 5-FU behandeling bevestigen we volgde de subcellulaire lokalisatie van NF-KB in de MKN45 (p53 wild type), MKN74 (p53 mutant ), GSS (p53 mutant) en Kato-III (p53 homozygoot geschrapt) cellijnen. Western blot analyse met nucleaire en cytoplasmatische fracties toonde aan dat 5-FU geïnduceerde NF-KB in beide compartimenten MKN45 maar werd niet waargenomen in p53 mutante cellijnen (Fig. 1A-D). We onderzochten ook het effect van 5-FU op NF-KB lokalisatie in de cellen door immunocytochemie (Fig. 1E-H). NF-KB gelokaliseerd in het cytoplasma in onbehandelde MKN45, terwijl 5-FU behandeling een toename van NF-kB nucleaire lokalisatie (figuur 1E.) Veroorzaakt; echter werd geen stijging in de p53 mutante cellijnen (Fig. 1F-H). We observeerden ook een drastische toename van gefosforyleerde NF-kB (p65 Ser536) in de kern van MKN45 behandeld met 5-FU, wijst NF-KB werd transactivated door 5-FU (fig. 1E). Constitutieve nucleaire lokalisatie en af ​​en toe een fosforylering van p53 werd waargenomen in MKN74 maar leek niet te worden veroorzaakt door 5-FU (afb. 1G). Nucleaire lokalisatie van p53 werd geïnduceerd door 5-FU in GSS, maar het geactiveerde signaal was zwak (Fig. 1H).

p53 doelstellingen worden geïnduceerd op 5-FU behandeling

Omdat NF-KB een transcriptiefactor (TF), de nucleaire lokalisatie na 5-FU behandeling suggereert sterk transactivatie. We identificeerden boven 7 transcripten onder ruim 60.000 die werden geïnduceerd na 4 uur van 5-FU behandeling MKN45 gebruik genexpressieprofielen (tabel 1). Interessant is dat vijf van de 7 transcripten, namelijk BBC3
(die p53 codeert up-gereguleerd modulator van apoptose, PUMA), BTG2, C12orf5
(die waarschijnlijk fructose-2,6-bisfosfatase codeert TIGAR), CDKN1A en GPR87
, zijn bekend p53 targets [18] - [22]. De aanwezigheid van promoter bindingsplaatsen werden voorspeld door het scannen van promotersequenties met de consensussequenties van NF-KB p53 en gebruik JASPAR algoritme (tabel 1) [23].

We vonden dat p53 niveaus geïnduceerd in de kern vergelijkbaar die van NF-kB als reactie op 5-FU behandeling (fig. 1E). Behandeling van 5-FU verhoogde ook de niveaus van p53 fosforylering op Ser15, wijst erop transactivatie (fig. 1E, ref. [24]). In feite is de meerderheid van alle p53 geïnduceerd door 5-FU leek te worden gefosforyleerd. We zagen ook een tijdsafhankelijke inductie van genen, met inbegrip van C12orf5 (TIGAR)
, BBC3 (PUMA)
, CDKN1A (p21)
en BTG2
door 5-FU middels RT-PCR (fig. 1I). Samengenomen suggereren deze resultaten dat de cellulaire respons op 5-FU behandeling zowel NF-KB p53 en voor transcriptionele activatie in dit verband in MKN45 kan omvatten.

RELA Knockdown heeft een groter effect op p53 doeleiwitten dan TP53 Gene Knockdown

om het regulerende effect van NF-KB en p53 in respons op 5-FU behandeling te evalueren, analyseerden we de eiwitniveaus van p65, p53, en p53 bekende doelen, p21, TIGAR en PUMA, door western blotting volgende RELA Kopen en TP53
knock-down in MKN45, MKN74, GSS, en Kato-III. RELA
knock-down veroorzaakt een duidelijke afname in p53 niveaus in alle cellijnen. Zoals verwacht, de niveaus van p21, TIGAR en POEMA werden afgenomen (Fig. 2A). Omgekeerd, terwijl de TP53
knock-down verlaagde p53 niveaus, het heeft geen invloed op p65 niveaus. Zoals verwacht, waren de niveaus van p53 doeleiwitten daalde met TP53
knock-down; Echter, deze daling was minder dan de daling veroorzaakt door RELA
knock-down (Fig 2B.). In de celcyclus analyse de MKN74, GSS en Kato-III cellijnen vertoonden een toename in de S of G2-fase deel dat MKN45 vertoonde een toename van de G1 fractie na blootstelling 24 uur tot 5-FU in de p65 en p53 knockdown vergelijkbaar met de overeenkomstige versleutelt (fig. 2C). Deze resultaten kunnen de robuustheid van de cellulaire stressrespons machinerie die de celcyclus verdeling behoudt ondanks de knockdown van p65 en p53 geven.

TP53 Codon72 Pro Variant lage eigen 5-FU gevoeligheid en hoge NF-KB Levels

Gene knockdown experimentele resultaten gaven aan dat de interactie tussen NF-kB en p53 eiwitten van belang in het kader van 5-FU behandeling kan zijn. Om de mogelijkheid te onderzoeken dat de TP53
codon72 variant kan cellulaire reacties beïnvloeden 5-FU behandeling, we sequentie TP53
codon72 evenals mutaties in het DNA bindende domein coderende gebieden (dat wil zeggen, exons 5-8) van 9 maagkanker cellijnen (Tabel 2). De status van de codon72 variatie en TP53
mutatie niet duidelijk verenigingen heeft laten zien.

Vervolgens onderzochten we de associatie tussen 5-FU gevoeligheid en TP53
staat (Fig. 3A ) alsook de endogene niveaus van NF-KB en p53 (Fig. 3B). GSS, GCIY en MKN45 lijnen, die de Pro homozygote variant bezitten, vertoonden een lage gevoeligheid voor 5-FU, terwijl de KE39, MKN74, MKN7, NUGC4 en IWT1 lijnen bezit Arg allel vertoonde een relatief hoge gevoeligheid. Kato-III, die een grote TP53
deletie [25], was het meest gevoelig voor 5-FU. NF-KB eiwitniveaus werden gecorreleerd met name 5-FU gevoeligheid ( r
= 0,68; p
= 0,04; fig. 3C); echter, was er geen duidelijke correlatie tussen p53 niveaus en 5-FU gevoeligheid ( r
= -0,04; p
= 0,95; fig. 3D). Deze resultaten suggereren dat Pro homozygotie wordt geassocieerd met 5-FU weerstand, terwijl p53 noch verandering noch endogene p53 niveaus direct de 5-FU gevoeligheid beïnvloedt.

Discussie

We hebben eerder geïdentificeerd NF-KB als een mogelijke marker voor voorspelling postoperatieve 5-FU-gebaseerde chemische gevoeligheid voor gevorderde maagkanker [9]. NF-kB is een induceerbaar transcriptiefactor bestaat uit p65 (RelA), c-Rel, Rel-B, p50 /NF-κB1 en p52 /NF-κB2 [26], en speelt een centrale rol bij immuunresponsen en inflammatoire cytokine verordening [27] - [29]. Chang et al eerder aangetoond dat de NF-KB-geïnduceerde omhoog of omlaag regulatie van differentieel tot expressie gebrachte genen in 5-FU geïnduceerde intestinale mucositis door het induceren van pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-6, TNF-α en IL-1β [10]. Deze 5-FU-geïnduceerde inflammatoire responsen zijn als deel van stress vermijden processen die leiden tot desensibilisatie van 5-FU werkzaamheid bij maagslijmvlies [30] zijn. Hoewel er is gesuggereerd dat activatie van NF-KB is niet direct gekoppeld aan tumorontwikkeling en progressie [31], is NF-KB beschouwd een belangrijke biomarker of therapeutisch target [32] zijn. De directe bewijs van verminderde chemoresistance tot 5-FU door siRNA voor RELA
samen met de hoge discriminerende kracht van NF-KB nucleaire kleuring in therapeutische resultaten van chirurgisch verwijderd weefsel voor ons aanleiding om verdere validatie van NF-KB uit te voeren biologisch standpunt.

De transcriptionele profilering resultaten bleek dat verschillende p53 downstream genen werden opwaarts gereguleerd in respons op 5-FU, waarbij transactivatie van NF-KB ook plaatsvond. Deze twee belangrijke transcriptiefactoren eerder is aangetoond dat co-gereguleerd in reactie op genotoxische middelen [33] - [35] en TNF-α [36], [37]. Bovendien is voorgesteld dat gelijktijdige activering van p53 en NF-KB in tumoren behandeld met genotoxische middelen kan leiden tot therapeutisch falen door NF-KB gemedieerde overleving signalering [38].

Individuele knockdown van deze transcriptiefactoren geopenbaard genen stroomafwaarts van p53 werden beïnvloed door p65 knock-down, terwijl het effect werd beperkt door p53 knockdown. Eerdere rapporten hebben een coöperatieve relatie tussen p53 en NF-KB in het kader van autofagie, apoptose gesuggereerd en S-fase controle activatie [34], [39] - [41]. Onze resultaten ook aan dat NF-KB kan compenseren voor de transcriptionele activiteit van p53 bij de intacte functie verloren als reactie op 5-FU behandeling. In feite, de meeste maagkanker dragen mutaties in het p53 DNA-bindende domein, waardoor haar transcriptioneel inactief [42]. Een recente studie van Frank et al
. gemeld dat codon72 polymorfisme van TP53
hoofdzaak het vermogen van p53 samenwerken met NF-KB-gen voor transactivatie, vooral bij de inductie van apoptose door middel van caspase 4/11 [40] beïnvloedt. Samen met de huidige bevinding dat sommige transcriptionele activiteit van p53 vereisen NF-KB in reactie op 5-FU, p53 codon 72 polymorfisme voor zijn NF-KB binding mogelijk meer invloed dan mutatiestatus van TP53 golfreizen of eiwit expressie status van p53

de impact van de codon72 polymorfisme op spontane risico op kanker is al eerder onderzocht, maar niet definitief vastgesteld als gevolg van beperkte menselijke bevolking en diermodellen [40], [43] -. [45]. Echter de codon72 polymorfisme een rol spelen bij het handhaven gevestigd kankercellen dan triggering cellulaire maligne transformatie. In feite hebben eerdere studies dat de Pro /Pro allel is geassocieerd met resistentie tegen chemotherapie en slechte prognose in de mondholte [46] en colorectale [47], borst [48] en maag [49] kankers en neuroblastomen [ ,,,0],43]. Een reeks In vitro studies
ook ondersteunen deze hypothese te tonen dat de Arg allel een krachtigere apoptose inducerend dan Pro allel [40], [50], [51]. Apoptose is één van de belangrijkste mechanismen geïnduceerd door 5-FU en derhalve is het redelijk te veronderstellen dat de werkzaamheid van 5-FU gebaseerde chemotherapie wordt geassocieerd met specifieke polymorfismen p53 [49]. Onze in vitro
bevindingen ondersteunen deze epidemiologische en experimentele gegevens en suggereren een mogelijk mechanisme voor de 5-FU-gemedieerde p53-NF-KB interactie op de p53-codon72 bindingsplaats.

Zoals verwacht onze studie toonde aan dat cellijnen met Pro allel waren resistent tegen 5-FU dan die met de Arg allel. De groei onderdrukking profiel van 9 maagkanker cellijnen toonden een goede correlatie met NF-KB eiwitniveaus. Deze resultaten suggereren dat de Arg /Arg genotype een sterkere inductie van apoptose dan de Pro /Pro genotype in aanwezigheid van 5-FU. Van de cellijnen (alle verkregen van Japanse patiënten met maagkanker), de verhouding van Arg /Arg Arg /Pro: Pro /Pro was 04:01:03, terwijl dat bij gezonde Japanse patiënten 4.5:4.4:1 [52] werd . Dit kan een selectie proces dat plaatsvindt tijdens de ontwikkeling van kanker en de inrichting als een cellijn weerspiegelen. Vorige meta-analyses in kankerrisico en p53 codon72 polymorfismen suggereren dat de Pro /Pro genotype heeft een hoger risico op kanker (lager voor de Arg /Arg genotype) in Aziatische bevolkingsgroepen [45], [53]. De betekenis van "kankerrisico" kanker maligniteit of behandelingsrespons nog worden opgehelderd, omdat het in het algemeen moeilijk om een ​​klinische studie gedomineerd door genetische polymorfismen te voeren en de werkelijke genetische effecten van de behandeling te beoordelen. Tot op heden zijn de meeste gevallen beschreven van een associatie tussen p53 codon72 polymorfisme en chemotherapeutische reacties hebben aangetoond dat de Arg /Arg genotype een gunstige respons in een breed scala van kanker behandeld met conventionele genotoxische middelen [49], [54], [55] . Wij stellen een mogelijk mechanisme voor respons op 5-FU via NF-KB en p53 proteïne binding geassocieerd met p53 polymorfisme, en dus een combinatorische diagnose van NF-KB eiwitexpressie en codon72 kan een nuttige indicator voor postoperatieve adjuvante chemotherapie. Afgezien van enkele grootschalige datasets [52], [56], de omvang van de demografische en etnische verdelingen van het polymorfisme onduidelijk. Accumuleren gegevens over etnische verschillen het polymorfisme kan verschillen kankerrisico of chemotherapeutische responspercentage patiëntenpopulatie leggen.

Samenvattend onze bevindingen aan dat NF-KB reguleert p53 transcriptionele activiteit in respons op 5-FU, die kan samenhangen met een polymorfe plaats van p53 codon72. Verdere klinische en epidemiologische studies moet de bruikbaarheid van bijkomende pathologische /fokwaardeschatting van NF-KB /p53-codon72 in chirurgisch verwijderde maagkanker specimens geëvalueerd, zodat de effectiviteit van postoperatieve 5-FU-gebaseerde adjuvante chemotherapie voorspellen.

Ondersteunende informatie
Tabel S1.
primersequenties
doi:. 10.1371 /journal.pone.0090155.s001
(DOCX)

• PLoS ONE: Verandering van lichaamsgewicht en macrofaag remmende cytokine-1 tijdens chemotherapie in gevorderde maagkanker: wat is hun Klinische betekenis
• PLoS ONE: de interactie-effecten van pri-laat-7a-1 rs10739971 met PGC en ERCC6 polymorfismen bij maagkanker en Atrofische Gastritis