MicroRNAs (miRNAs) spelen een cruciale rol bij maagkanker progressie en metastase. Deze studie onderzocht de rol van miRNA-135a in het begin van maagkanker (EGC) inclusief lymfeklieren (LN) metastase. We onderzochten de correlatie tussen miRNA-135a expressie en klinische resultaten in 59 patiënten die een operatie ondergingen voor EGC. Gebruik maagkanker cellijnen, voerden we functionele en doelwitgen analyses. miRNA-135a expressie werd down-gereguleerd in 33,9% van de patiënten. Deze patiënten vertoonden een aanzienlijk verder gevorderd stadium (TNM stage≥IB, 35,0% vs. 12,8%, p = 0,045) en hogere snelheid van LN metastase (30,0% vs. 5,1%, p = 0,014) dan mensen met een up-regulatie van miRNA-135a expressie. In een multivariate analyse, down-regulatie van miRNA-135a is een onafhankelijke risicofactor voor LN metastase (gecorrigeerde odds ratio, 8,04; 95% betrouwbaarheidsinterval, 1,08-59,81; p = 0,042). Functionele analyses met behulp van maagkanker cellijnen bleek dat miRNA-135a onderdrukt levensvatbaarheid van de cellen, epitheliale-mesenchymale transitie, cel invasie, en migratie. Rock1 was een doelwit van miRNA-135a en de uitdrukking was omgekeerd gecorreleerd met die van miRNA-135a. Rock1 expressie was significant verhoogd bij patiënten met EGC LN metastase dan bij mensen zonder LN metastase. Onze resultaten bevestigen de tumor-onderdrukkende rol van miRNA-135a, en tonen haar rol in LN metastase in EGC. miRNA-135a en zijn doelwit gen Rock1 Visum:. Shin JY, Kim YI, Cho SJ, Lee MK, Kook MC, Lee JH, et al. (2014) MicroRNA 135a onderdrukt lymfekliermetastasen door middel van down-verordening van Rock1 in Vroege maagkanker. PLoS ONE 9 (1): e85205. doi: 10.1371 /journal.pone.0085205 Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan Ontvangen: 28 oktober 2013; Aanvaard: 23 november 2013; Gepubliceerd: 21 januari 2014 Copyright: © 2014 Shin et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd Financiering:. Deze studie werd gefinancierd door subsidie 1.110.532-3 van het National Cancer Center, Korea. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript Competing belangen:. HA is een PLoS ONE redactie bestuurslid en deze niet naleven van de auteurs te veranderen om alle PLoS ONE beleid op het delen van gegevens en materialen. Introductie Maagkanker is nog steeds de tweede meest voorkomende oorzaak van kankersterfte in de wereld, ondanks de dalende incidentie en sterfte in de ontwikkelde landen [1 ]. In gebieden, met inbegrip van Korea en Japan, waar de screening op maagkanker op grote schaal wordt uitgevoerd, vroege opsporing is vaak mogelijk. Omdat een verhoogde graad van vroege opsporing van maagkanker kan leiden tot een verbeterde prognose, hebben belangen in het verbeteren van patiënten 'kwaliteit van leven en gebruik te maken van minimaal invasieve behandelingen verhoogd. Bij patiënten met maagkanker, lymfeknoop (LN) metastase is een van de meest belangrijke prognostische factoren, en de incidentie van de LN metastase in vroege maagkanker (EGC) varieert van 5 tot 20% [2] - [4]. Gastrectomie met LN dissectie wordt beschouwd als standaardbehandeling voor maagkanker; Echter, 80 tot 95% van de patiënten met EGC geen LN dissectie vereist indien de maagkanker volledig uitgesneden minder invasieve behandelingen zoals endoscopische resectie [5] - [7] of minimaal invasieve chirurgie ( bijv Verschillende studies hebben gemeld dat de diepte van de invasie, grootte van de tumor, en lymfatische invasie zijn LN geassocieerd met metastase in EGC [4], [11]. De meeste van deze factoren bepaald na laatste pathologisch onderzoek van gereseceerd weefsel, wat niet nuttig voor het bepalen behandelingsstrategie. MicroRNAs (miRNAs) zijn kleine niet-coderende RNA's. Studies hebben aangetoond dat veranderingen in de expressie van miRNAs bij aan de pathogenese van kanker waaronder die van gastrointestinale [12] -. [15] miRNAs is ook nuttig gebleken bij het differentiëren kanker en normaal weefsel zijn [ ,,,0],16], [17]. Bovendien worden miRNAs differentieel tot expressie gebracht in elk stadium van maagkanker carcinogenese [18]. miRNA-27 [19] en de ZEB1 gereguleerde miRNA-familie 200 [20] hebben aangetoond dat gerelateerd levensfase epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) bij maagkanker. Daarom kan miRNAs worden geassocieerd met het proces van LN metastase in EGC. Onder miRNAs is miRNA-135a aangetoond dat het een tumor onderdrukkende miRNA, en de expressie down-gereguleerd in verschillende kankers waaronder niercelcarcinoom [21] en lymfoom [22]. Op zijn beurt, overexpressie of herstel van miRNA-135a bevordert apoptose en onderdrukt de proliferatie van tumorcellen door de doelwitgenen c-Myc [21] en JAK2 [22], respectievelijk. In een In vitro Het doel van dit onderzoek was om de correlatie tussen miRNA-135a expressie en klinische resultaten in EGC patiënten, waaronder LN metastase te onderzoeken. Materialen en methoden Human weefselmonsters en klinische gegevens Fifty-negen volwassen patiënten met EGC bij het National Cancer Center, Korea, van januari 2011 tot april 2013 werden prospectief opgenomen in deze studie. Deze patiënten werden behandeld met een open of laparoscopisch geassisteerde gastrectomie met D1 + of meer LN dissectie. De omvang van LN dissectie volgde de aanbevelingen van de Japanse Gastric Cancer Association [24]. De fase na de operatie werd geëvalueerd op basis van de 7 e editie van de Amerikaanse Joint Committee on Cancer TNM-classificatie [25]. Menselijke weefsels zowel maagkanker en gekoppeld normale weefsels van elke patiënt werden onmiddellijk ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C. Uit het overzicht van de medische grafieken, clinicopathologic kenmerken zoals leeftijd, geslacht, Helicobacter pylori De humaan normaal de maag epitheel cellijn HFE145 [26], [27] was een geschenk van Dr Hassan Ashktorab en Duane T. Smoot (Howard University, Washington, USA) en commercieel beschikbare maagkanker cellijnen AGS, YCC2, MKN28, KATOIII, SNU1 , SNU5, SNU16, SNU216, SNU601, SNU638, SNU668 en SNU719 werden verkregen uit de Korea Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea). Alle cellijnen werden in RPMI 1640 medium dat 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibiotica (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Onder de maagkanker cellijnen werden MKN28 en SNU668 cellijnen geselecteerd omdat ze slechts zelden miRNA-135a en YCC en KATOIII cellijnen werden gekozen omdat zij een grote basislijn expressie van miRNA-135a (Figuur 1A). Transfecties met miRNA-135a bootst (Mirvana ™ miRNA nabootst, Ambion, Austin, TX, USA), een miRNA-135a-remmer (Mirvana ™ miRNA-remmer, Ambion, Austin, TX, USA), en Rock1 siRNA (5'-UGAUGCAAAGAUUGUACUC- 3 "; UGBioneer, Seoul, Korea) in SNU668, YCC2, MKN28 en KATOIII cellijnen werden uitgevoerd met behulp van Lipofectamine RNAiMAX en Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) volgens de instructies van de fabrikant. MKN28, SNU668, YCC2 en KATOIII cellijnen werden geoogst twee dagen na transfectie en verschillende analyses werden uitgevoerd. Totaal RNA werd geïsoleerd uit cellijnen 13 en 59 maagkanker patiënten weefsels, respectievelijk met TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) volgens het protocol van de fabrikant. De TaqMan universeel PCR Master Mix reagentia kit (Applied Biosystems, Tokyo, Japan) werd gebruikt. Amplificatie en detectie werden uitgevoerd met een 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Tokyo, Japan) met 40 cycli van denaturatie bij 95 ° C (15 seconden) en annealing /extensie bij 60 ° C (60 seconden). Dit werd voorafgegaan door reverse transcriptie bij 50 ° C gedurende 30 minuten denaturatie bij 95 ° C gedurende 10 minuten. Om volwassen miRNAs kwantificeren, werden TaqMan MicroRNA Assays kits (Applied Biosystems, Tokyo, Japan) gebruikt voor de detectie van miRNA-135a en een controle miRNA (RNU6B). Protein was geëxtraheerd uit 13 cellijnen en 59 weefselmonsters EGC patiënten met RIPA buffer (Biosesang, Seoul, Korea) een cocktail van proteaseremmers (Sigma, St. Louis, MO, USA) volgens het protocol van de fabrikant. Daarna werd Western blotting uitgevoerd met behulp van anti-Rock1 en anti-β-actine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) antilichamen. Signalen werden gedetecteerd met een ECL kit prime (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) volgens instructies van de fabrikant. celproliferatie werd gemeten met behulp van een MTT assay. Cellen werden uitgeplaat in 96-putjes (3 x 10 3 cellen per putje) en getransfecteerd met miRNA-135a bootst na twee dagen incubatie. Vervolgens werd 200 ul MTT (0,5 mg /ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) werden toegevoegd aan elk putje. Na vier uur extra incubatie werden MTT oplossingen weggegooid, 200 pl DMSO (Amresco, Solon, OH, USA) werd aan elk putje toegevoegd en de plaat werd voorzichtig geschud. Absorptie werd gemeten op een ELISA-lezer (Moecular Devices, Sunnyvale CA, USA) bij een test golflengte van 570 nm. De cellen werden uitgezet in 60π cultuur platen en getransfecteerd met miRNA -135a nabootst of een miRNA bootst negatieve controle (Mimics-NC). Deze cellen werden geoogst door trypsinisatie en in 70% ethanol gefixeerd gedurende ten minste twee uur bij -20 ° C. Celpellets werden gewassen met koude fosfaat gebufferde zoutoplossing en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in PI /RNase Staining Buffer (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Na het kleuren werden de monsters geanalyseerd met een FACScan stromingscytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) en 10.000 gebeurtenissen per monster werden verzameld. Gegevens van flowcytometrie geanalyseerd middels Cell Quest software (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). De cellen werden getransfecteerd met miRNA-135a bootst , miRNA-135a-remmers, Rock1 siRNA en Rock1 siRNA negatieve controle (scRNA) voor één dag en vervolgens overgebracht naar de bovenste kamer van de transwell plaat bekleed met 0,5 mg /ml collageen type I (BD Bioscience, Bedford, MA, Verenigde Staten) en een 1:15 verdunning van Matrigel (BD Bioscience, Bedford, MA, USA). RPMI 1640 met 10% FBS en 1% antibiotica (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) werd aan de onderste kamer toegevoegd en de plaat werd incubatie gedurende 20 uur. Migreren en binnendringende cellen werden gekwantificeerd met behulp van hematoxyline en eosine kleuring. Het wild type 3 'UTR van Rock1 bevatten bindingsplaatsen voor miRNA-135a werd versterkt met behulp van gDNA van SNU668 cellen als een matrijs. De gecorreleerde mutant constructen werden gemaakt door het muteren van het zaad regio's van de miRNA-135 binding sites. Zowel wildtype en mutante 3 'UTR gekloneerd stroomafwaarts van het luciferasegen in een pGL3 controlevector. De constructen werden geverifieerd door sequencing. Luciferase assays werden uitgevoerd in SNU668 en YCC2 cellen. SNU668 en YCC2 cellen werden getransfecteerd met elk van de plasmiden (lege vector [MOCK] Rock1 3 'UTR wild type [WT] en Rock1 3' UTR mutant [MUT], een miRNA-135a bindingsplaats) met miRNA- bootst 135a, 135a miRNA-remmers en negatieve controle RNA in 24-well platen. Twee dagen na transfectie werden de cellen geoogst en gelyseerd. Luciferase-assays werden uitgevoerd op lysaten met behulp van een luciferase assay kit (Promega, Madison, WI, USA). Luciferase activiteit werd genormaliseerd aan P-galactosidase. Immunohistochemische (IHC) kleuring werd uitgevoerd voor representatieve 20 gevallen van Rock1 lage en hoge expressie groepen. Antigeenterugtrekking werd gedaan warmtebehandeling gedurende 30 min bij pH 8,0 Tris-EDTA buffer (CC1, Ventana Medical System, Tucson, AZ, USA) bij 95 ° C. Weefselobjectglaasjes werden geïncubeerd bij 42 ° C gedurende 30 min met anti-Rock1 mAb (ab134181, kloon EPR638Y, konijn monoklonale, 1:5,000; Abcam, Cambridge, MA, USA). Negatieve controles werden op identieke wijze gebruikt met geïmmuniseerde konijnen IgG. De resultaten werden geïnterpreteerd door een ervaren patholoog (MC Kook). Schaal gegevens worden gegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Chi-kwadraat of exacte toets van Fisher en de Mann-Whitney U-test werden gebruikt om categorische variabelen en continue variabelen te vergelijken, respectievelijk. De Pearson correlatiecoëfficiënt werd gebruikt voor het vergelijken van de genexpressie patroon tussen miRNA-135a en Rock1. Een multivariate logistisch regressiemodel werd gebruikt voor onafhankelijke factoren die samenhangen met LN metastase bepalen. Covariaten dat belangrijke waren met behulp van chi-kwadraat of exacte toets van Fisher ( P Restaurant < 0,05) werden in de logistische regressie model ingevoerd. Alle gegevens werden geanalyseerd met behulp van STATA 12.1 (Stata Corp, College Station, TX, USA). Een P miRNA-135a expressie niveaus worden geassocieerd met de progressie en LN metastase in EGC Een eerdere studie toonde aan dat miRNA-135a expressie wordt down-gereguleerd bij maagkanker cellijnen [23]. Via qRT-PCR vonden we ook dat miRNA-135a expressie wordt downgereguleerd in verschillende maagkanker cellijnen vergeleken met die in een normale gastrische epitheel cellijn (Figuur 1A). De correlatie tussen miRNA-135a expressie en klinische resultaten bij maagkanker is niet onderzocht. Daarom meten we de miRNA-135a expressie niveaus in het primair maagkanker en de bijbehorende niveaus in normale weefsels van 59 patiënten met EGC. Down- en up-regulatie van genen in tumorweefsels opzichte van normale weefsels werden gedefinieerd als de verhouding van tumor tot normaal weefsel genexpressie niveaus < 1,0 en >. 1,0 respectievelijk daarentegen het resultaat van in vitro Om verder het verband tussen miRNA-135a en klinische resultaten, voerden we functionele assays voor levensvatbaarheid van de cel, celcyclus, EMT, migratie en invasie bij maagkanker cellijnen. Overexpressie van miRNA-135a door miRNA-135a bootst aanzienlijk onderdrukt levensvatbaarheid van de cellen (Figuur 2A) en verhoogde de subdiploid fractie van SNU668 cellen, een cellijn die zelden tot uitdrukking miRNA-135a (Figuur 2B), wat suggereert dat de toegenomen apoptose van maagkanker cellen. Echter, onderdrukking van miRNA-135a door miRNA-135a remmers veroorzaakte noch een toename van cellevensvatbaarheid noch subdiploid fractie afname YCC2 cellen, een cellijn die grote miRNA-135a (figuur 2A en 2B) uitdrukt. We onderzochten ook de associatie tussen miRNA-135a expressie en EMT bij maagkanker cellen, omdat miRNA-135a down-regulering is een onafhankelijke risicofactor voor LN metastase in EGC patiënten (tabel 1). Verhoogde expressie van miRNA-135a was geassocieerd met een onderdrukking van EMT en vertoonden een toename in de expressie van E-cadherine en de onderdrukking van zowel N-cadherine en slak in SNU688 cellen. In tegenstelling tot remming van miRNA-135a expressie resulteerde in activering van EMT met inbegrip van de onderdrukking van de E-cadherine expressie en de up-regulatie van zowel N-cadherine en Slug expressie in YCC2 cellen (figuur 2C). Bij de beoordeling van functionele gevolgen, overexpressie van miRNA-135a door miRNA-135a bootst aanzienlijk onderdrukt de migratie en invasie mogelijkheden van SNU668 maagkanker cellen (figuur 2D). Omgekeerd blokkade van miRNA-135a door miRNA-135a-remmers aanzienlijk toegenomen migratie en invasie van YCC2 maagkanker cellen (figuur 2E). Over het algemeen, onze resultaten suggereerden dat miRNA-135a is een tumor onderdrukkende regulator voor de maag proliferatie van kanker en metastase. Om te verhelderen de mechanismen die ten grondslag liggen aan de effecten van miRNA-135a op klinische uitkomsten, zochten we vermeende targets met behulp van de TargetScan 6.2 database. Van 718 geconserveerd doelen, we geselecteerde doelen met de hoogste score waarvan down-regulatie kan leiden tot verhoogde proliferatie van kankercellen, migratie en invasie. We vonden dat Rock1 een doelgen van miRNA-135a kan zijn omdat remming of onderdrukking van Rock1 gemeld apoptose bevorderen en migratie, invasie en proliferatie van kankercellen inbegrip van maagkanker [28] onderdrukken - [30]. TargetScan analyse bleek dat de 3'UTR sequentie van Rock1 één mogelijke bindingsplaats voor miRNA-135a (figuur 3A). Om te bevestigen of Rock1 is een doelwit van miRNA-135a, werd een luciferase-test uitgevoerd. De luciferase 3'UTR constructen werkwijzen sectie beschreven werden tezamen getransfecteerd in SNU688 cellen met miRNA-135a en bootst in YCC2 cellen met miRNA-135a remmers. We hebben ook gebouwd Rock1 3'UTR MUT door puntmutatie C → G in de mogelijke bindingsplaats (figuur 3A). De relatieve luciferaseactiviteit van de Rock1 3'UTR WT was significant verhoogd in de aanwezigheid van miRNA-remmers 135a (Figuur 3B). Daarentegen werd deze activiteit significant af in aanwezigheid van miRNA-135a bootst (Figuur 3C). In maagkanker cellijnen, miRNA-135a en Rock1 toonde een tegengestelde expressiepatroon. Western blot analyse toonde dat Rock1 expressie neerwaarts gereguleerd in de aanwezigheid van miRNA-135a nabootsers en opwaarts gereguleerd in de aanwezigheid van miRNA-remmers 135a (Figuur 3D en 3E). Samengenomen geven deze resultaten aan dat miRNA-135a onderdrukt Rock1 expressie door direct gericht zijn 3'UTR. Expressie van Rock1 is omgekeerd gecorreleerd met die van miRNA-135a bij patiënten met EGC Analyse van 59 patiënten met EGC toonde aan dat expressie van Rock1 hadden een significant negatieve correlatie met die van miRNA-135a (r = -0,697, p < 0,001; Figuur 4A). Bovendien, patiënten met een up-regulatie van miRNA-135a expressie hadden significant lagere niveaus van Rock1 eiwitexpressie dan die met down-regulatie van miRNA-135a (gemiddelde tumor normaal ratio, 0,81 versus 1,55, p < 0,001; Figuur 4B) . Rock1 wordt geassocieerd met LN metastase in EGC en is betrokken bij maagkanker cel migratie en invasie onderdrukt door miRNA-135a Om de associatie tussen Rock1 expressie en klinische resultaten in EGC verder te evalueren, analyseerden we de patronen van Rock1 expressie met betrekking tot de status van LN metastase omvatten patiënten. Patiënten met LN metastase hadden een significant hogere expressie van Rock1 eiwit dan die zonder LN metastase (gemiddelde tumor normale verhouding 1,86 vs. 0,93, p = 0,007; Fig 5A). Bovendien niveaus van Rock1 IHC kleuring waren vergelijkbaar met die van Rock1 expressie in Western blot analyse ( ie tot slot, om te onderzoeken of de door de miRNA-135a verleend onderdrukt migratie en invasie vaardigheden up-regulatie waargenomen bij maagkanker cellijnen waren het resultaat van Rock1 up-regulering, voerden we de migratie en invasie assays gebruikt maagkanker cellijnen getransfecteerd met specifieke Rock1 siRNA. Rock1 siRNA onderdrukt trekkende en invasieve activiteiten in SNU668 cellen (figuur 5D). In YCC2 cellen gecotransfecteerd met miRNA-135a remmers en Rock1 siRNA (Figuur 5E), migratie en invasie assays toonden dat remming van Rock1 door siRNA aanzienlijk verzwakt het versterkende trekkende en invasieve effecten van miRNA-135a neerwaartse regulatie van miRNA-135a remmers (Figuur 5F). Tezamen suggereren deze resultaten dat Rock1 is gekoppeld LN metastase in EGC patiënten, en dat dit resulteert uit verhoogde Rock1 expressie in de context van miRNA-135a neerwaartse regulering. Daarom kan Rock1 worden betrokken bij miRNA-135a-onderdrukt maagkanker metastase. In de huidige studie, vonden we dat miRNA-135a had tumor onderdrukkende rol bij maagkanker. Bij patiënten met EGC, down-regulatie van miRNA-135a is een onafhankelijke risicofactor voor LN metastase. In maagkanker cellen, up-gereguleerd miRNA-135a onderdrukt maag carcinogenese door het onderdrukken van celproliferatie, EMT, en metastase. Verder hebben we ook identificeerde een nieuwe doelgen van miRNA-135a, rock1, die gepaard ging met LN metastase bij maagkanker. Bij patiënten met EGC, evaluatie van LN metastase vóór behandeling is een belangrijke stap in het bepalen van de behandeling strategieën. Minder invasieve behandelingen zoals endoscopische resectie [5] - [7] of sentinel LN navigatie chirurgie [9], [10] kan mogelijk EGC patiënten zonder LN metastase. Deze behandeling benaderingen zijn patiënten de kwaliteit van het leven in verband verbeterd om late complicaties in verband met standaard chirurgische behandelingen, zoals dumping syndroom, gewichtsverlies, en reflux gerelateerde symptomen [31]. Daarom zijn specifieker en gevoeliger biomarkers nodig om de status van LN metastase bij patiënten met EGC voorspellen. In deze studie miRNA-135a neerwaartse regulatie een onafhankelijke factor LN metastase en voorspellingswaarde van miRNA-135a expressie status was relatief hoog met een sensitiviteit 75% en een specificiteit 73%. Hoewel verdere validatie studies nodig zijn, deze resultaten toonden aan dat het meten van miRNA-135a levels voorafgaand aan het bepalen van het behandelplan voor EGC patiënten een nuttige test voor het voorspellen van LN-status zou kunnen zijn. Interessant, miRNA-135a is gemeld tumor onderdrukkende en oncogene zijn. Overexpressie van miRNA-135a is geassocieerd met onderdrukking van de tumor proliferatie en groei van niercelcarcinoom [21] en met verhoogde apoptose en betere ziektevrije overleving in lymfoom [22]. Daarentegen werd miRNA-135a betrokken bij colorectale kanker progressie [32] en in toenemende migratie en invasie [33] borstcel. In de onderhavige studie werd miRNA-135a aangetoond dat een tumor onderdrukkende miRNA, dat in overeenstemming met het resultaat van een eerdere studie [23] zijn. Speciaal de hogere expressie van miRNA-135a onderdrukte verschillende stappen van maagkanker waaronder proliferatie, migratie en invasie. Verder hebben we ook gevonden dat miRNA-135a zou kunnen onderdrukken EMT, die heeft gemeld te worden geassocieerd met de opening van het proces meerdere stappen van carcinogenese en promotie van metastase [34], [35]. Voorafgaand aan dit onderzoek, is de koppeling tussen miRNA-135a en EMT niet onderzocht, hoewel eerdere studies hebben aangetoond dat miRNAs zoals miRNA-27 [19], het miRNA-200 familie [20], miRNA-7 [36] en miRNA-1228 [37] onderdrukken EMT door hun eigen target genen bij maagkanker. Bij elkaar genomen, miRNA-135a is een tumor onderdrukkend miRNA bij maagkanker. Een eerdere studie analyseert 353 menselijke maagkanker weefsels toonde aan dat de expressie patronen van miRNAs zijn divers en dat sommige miRNAs werden geassocieerd met de progressie en de prognose in de maag kanker [14]. In de studie werd miRNA-135a geclassificeerd als een oncogeen miRNA in maagkanker gebaseerd op de resultaten van DNA microarray analyses. In een recent [23] en ons onderzoek miRNA-135a fungeerde als een tumor suppressor ondanks het hoge percentage patiënten met miRNA-135a opwaartse regulatie. Hoewel veel patiënten (66%) hadden up-regulatie van miRNA-135a vergelijkbaar met dat van een eerdere studie [14], deze patiënten vertoonden een significant minder ver gevorderd zijn en een lager LN metastase. Bovendien, extra In vitro Rock1 is een lid van de Rho-geassocieerde serine /threonine kinase familie, die functioneert als een centrale regulator van actine cytoskelet organisatie en dynamica [23], [38]. Rock1 heeft een divers scala aan functies in het ontstaan van tumoren, waaronder migratie, invasie en metastase [28]. Rock1 is een doelwit van verschillende miRNAs in diverse vormen van kanker, waaronder miRNA-584 in niercelcarcinoom [39], miRNA-335 in neuroblastoom [40], en miRNA-146a bij prostaatkanker [41]. Bij maagkanker is Rock1 positief gecorreleerd met LN metastase en TNM [42], en is betrokken bij miRNA-148a-geïnduceerde onderdrukking van maagkanker celmigratie en invasie [30]. Verder Rock1 inhibitor bevorderd apoptose bij maagkanker cellen [29]. In de huidige studie, vonden we dat Rock1 is een doelwit van miRNA-135a bij maagkanker en de uitdrukking is positief geassocieerd met LN metastase in EGC patiënten. In vitro Concluderend hebben we miRNA-135a geïdentificeerd als een prognostische biomarker voor LN metastase bij patiënten met EGC en aangetoond dat miRNA-135a onderdrukt maag carcinogenese ( ie
kan zijn nieuwe therapeutische en prognostische doelen voor EGC
, eenvoudige wigresectie of sentinel LN navigatie chirurgie) [8] - [10]. Hoewel studies van biologische prognostische en voorspellende markers voor LN metastase in EGC zijn uitgevoerd, geen voorspellende instrumenten bestaan voor nodale metastase van EGC eigenlijk.
studie, miRNA-135a onderdrukt trekkende en invasieve activiteiten van maagkanker cellen [23]. Echter, de tumor onderdrukkende rol van miRNA-135a bij maagkanker is onduidelijk.
status tumor kenmerken, het podium, en de status van LN metastase werden verkregen en geanalyseerd. Informed schriftelijke toestemming werd verkregen van alle patiënten en de studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van het National Cancer Center, Korea (NCCNCS-11-445).
Cel cultuur en transfectie
RNA-extractie en kwantificering miRNAs
Western blotanalyse
celproliferatie assays
Cell cycle analysis
Trans-filter migratie en invasie assays
De luciferase reporter plasmide constructies
Luciferase assay
Immunohistochemische kleuring
Statistische analyse
waarde van minder dan 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
experiment, slechts 20 (33,9%) van de 59 patiënten met EGC vertoonden down-regulatie van miRNA-135a expressie. Echter, deze patiënten vertoonden significant verder gevorderd (TNM stage≥IB, 35,0% vs. 12,8%, p = 0,045; ruwe odds ratio [OR], 2,11; 95% betrouwbaarheidsinterval [BI], 1,08-4,10) en een hoger percentage van LN metastase (30,0% vs. 5,1%, p = 0,014; ruwe OR 2,73; 95% BI 1,50-4,98) dan die met up-regulatie van miRNA-135a expressie (tabel S1). Sensitiviteit en specificiteit van miRNA-135a expressie status voorspellen LN metastase waren 75,0% en 72,5%, respectievelijk. Bovendien patiënten met gevorderd stadium (figuur 1B) of LN metastase (figuur 1C) een significant lagere verhouding van tumor normale miRNA-135a expressieniveaus dan die met stadium IA of zonder LN metastase. Een multivariate logistische regressie-analyse toonde ook aan dat miRNA-135a downregulatie was onafhankelijk geassocieerd met LN metastase (aangepaste OR, 8,04; 95% CI, 1,08-59,81; p = 0,042; Tabel 1). Tezamen zijn deze bevindingen suggereren dat down-regulatie van miRNA-135a expressie kan worden geassocieerd met maagkanker progressie inclusief LN metastase.
miRNA-135a onderdrukt maagkanker levensvatbaarheid van de cellen, EMT, migratie en invasie
Rock1 is een doelwit-gen van miRNA-135a bij maagkanker
, patiënten zonder LN metastasen hadden weak IHC kleurpatronen [5B] maar die met LN metastase had sterke positieve kleuring IHC [Figuur 5C]).
Discussie
studies toonden ook aan dat een hogere expressie van miRNA-135a werd geassocieerd met onderdrukking van de maag carcinogenese. Deze resultaten suggereren dat expressiepatronen van miRNAs anders klinische resultaten kunnen zijn, en derhalve de exacte rol van specifieke miRNAs bevestigen verdere studies nodig.
experimenten toonden ook aan dat Rock1 wordt betrokken bij maagkanker celmotiliteit en invasie. Deze resultaten suggereren dat Rock1 een nieuwe therapeutische target met de mogelijkheid om maagkanker metastase remmen mogelijk.
, proliferatie, EMT en uitzaaiingen bij maagkanker cellijnen) door zich te richten Rock1. Hoewel deze bevindingen gevalideerd in andere onafhankelijke groepen patiënten nodig hebben, ze suggereren dat miRNA-135a en de target-gen Rock1 een nieuwe biomarker en therapeutisch doel voor maagkanker met LN metastase kan zijn.
Ondersteunende informatie
Table S1 .
Clinicopathologische kenmerken van patiënten met vroege maagkanker volgens miRNA-135a expressie status
doi:. 10.1371 /journal.pone.0085205.s001
(DOC)
Onderzoekers gebruiken faagtherapie om alcoholische leverziekte met succes te behandelen
Risico op tandvleesaandoeningen en slokdarm- en maagkanker
Mannen die twee keer per week yoghurt eten, hebben minder kans op darmkanker
Studie suggereert verband tussen gebruik van probiotica en "hersennevel"
Koffie helpt bij het ontwikkelen van gezonde darmmicroben en bevordert de stoelgang
Plantaardig dieet kan je reumatoïde artritis genezen
Onderzoekers manipuleren bacteriesoorten in de darm met behulp van voeding
Wetenschappers van de Stanford University School of Medicine hebben aangetoond dat door het manipuleren van het dieet in een muismodel, het is mogelijk om de enting van een specifieke bacteriestam te
Onderzoek toont aan dat probiotica angst en depressie kunnen helpen bestrijden
Eerder onderzoek heeft psychische problemen en ontwikkelingsstoornissen gekoppeld aan de darmgezondheid. Nutsvoorzieningen, een team van Britse wetenschappers heeft aangetoond dat voedingsmiddelen die
Wetenschappers veranderen bloed van type A in universeel type O,
mogelijk verdubbeling van de bloedtransfusievoorraden Onderzoekers van de University of British Columbia hebben een mogelijke manier gevonden om type A-bloed om te zetten in universeel type O-bloed.