PLoS ONE: E-cadherine destabilisatie Accounts voor de pathogeniciteit van missense mutaties in erfelijke Diffuse Gastric Cancer

Abstract

E-cadherine is van cruciaal belang voor het behoud van het weefsel architectuur vanwege zijn rol in de cel-cel adhesie. E-cadherine mutaties in de genetische oorzaak van erfelijke diffuse maagkanker (HDGC) en missense mutaties vormen een klinische last, vanwege de onzekerheid van hun pathogene rol. In vitro en in vivo meeste mutaties leiden tot verlies van functie, hoewel de oorzakelijke factor onbekend is voor de meerderheid. Onze hypothese was dat destabilisatie zou kunnen zijn voor de pathogeniciteit van E-cadherine missense mutaties in HDGC, en getest onze hypothese met behulp van in silico en in vitro gereedschappen. FoldX algoritme werd gebruikt om het effect van elke mutatie in E-cadherine native-state stabiliteit te berekenen, en de analyse werd aangevuld met evolutionaire behoud, door SIFT. Interessant HDGC patiënten harboring kiemlijn E-cadherine destabilisatie mutanten vormen een jongere leeftijd bij diagnose of dood, wat suggereert dat het verlies van natieve toestand stabiliteit van E-cadherine rekeningen voor het ziektefenotype. Om de biologische relevantie van E-cadherine destabilisatie in HDGC ontrafelen, onderzochten we een groep van onlangs geïdentificeerde HDGC-geassocieerde mutaties (E185V, S232C en L583R), waarvan wordt voorspeld L583R destabiliserend zijn. We tonen aan dat deze mutatie niet functioneel in vitro vertoont kortere halfwaardetijd en kan niet rijpen, door vroegtijdige proteasoom-afhankelijke degradatie, een fenotype teruggedraaid door stabilisatie van de kunstmatige mutatie L583I (structureel getolereerd). Hierin beschrijven we E-cadherine structuurmodellen geschikt om het effect van de meerderheid van kankergeassocieerde missense mutaties te voorspellen en laten we zien dat E-cadherine destabilisatie leidt tot verlies van functie in vitro en in vivo verhoogde pathogeniciteit.

Citation: Simões Correia-J, Figueiredo J, Lopes R, Stricher F, Oliveira C, Serrano L, et al. (2012) E-cadherine destabilisatie Accounts voor de pathogeniciteit van missense mutaties in erfelijke Diffuse maagkanker. PLoS ONE 7 (3): e33783. doi: 10.1371 /journal.pone.0033783

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Ontvangen: 9 november 2011; Aanvaard: 17 februari 2012; Gepubliceerd: 21 maart 2012

Copyright: © 2012 Simões-Correia et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door Fundação para a Ciência e Tecnologia, Portugal (PTDC /SAU-OBD /64319/2006, PTDC /SAU-OBD /104017/2008, SFRH /BPD /48765/2008), EMBO (korte termijn beurs asTF 60- 2009) en de EU-subsidie ​​Prospects (HEALTH-F4-2008-201648). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

E-cadherine is een cel-celadhesie glycoproteïne bestaat uit vijf extracellulaire cadherine-achtige herhalingen, een transmembraan gebied en een sterk geconserveerd cytoplasmatische staart [1], [2]. E-cadherine wordt voornamelijk tot expressie in epitheelcellen en is de hoofdcomponent van contactplaatsen (AJ). Deze knooppunten cluster via homofiele interacties met de extracellulaire domeinen van calcium-afhankelijke E-cadherin moleculen op het oppervlak van homotypische buurcellen.

De rol van E-cadherine in tumorontwikkeling is goed beschreven, en de verlies van meningsuiting is een keurmerk in carcinomen [3]. Experimenteel bewijs ondersteunt een rol voor de E-cadherine complex zowel onderdrukken invasie en metastase vorming [4]. Verlies van E-cadherine-expressie wordt vaak geassocieerd met genetische gebeurtenissen zoals splitsingsplaats en truncatie mutaties veroorzaakt door inserties, deleties en nonsense mutaties, naast mutaties missense [5]. In sporadische diffuse maagkanker, worden veranderingen in het gen dat codeert E-cadherine (CDH1) bij voorkeur in exons 7-9 [5], terwijl in lobulaire borstkankers worden ze verspreid over het gen, zonder preferentiële hotspot [6]. Missense mutaties in deze twee soorten van sporadische kanker en in synoviale sarcomen [7].

familiale aggregatie diffuse maagkanker (DGC) vertegenwoordigt 10% van de gevallen van maagkanker (GC), en slechts 1-3% zijn erfelijk [8]. Uit deze familiale gevallen wordt Erfelijke Diffuse maagkanker (HDGC), gedefinieerd door strenge criteria die door de International Gastric Cancer Linkage Consortium (IGCLC) in 1999 werden gedefinieerd: (1) twee of meer gedocumenteerde gevallen van diffuse maagkanker in eerste /tweede graad familieleden, met ten minste één gediagnosticeerd vóór de leeftijd van 50; of (2) drie of meer gevallen van gedocumenteerde diffuse maagkanker in eerste /tweede graad, ongeacht de leeftijd. Early Onset Diffuse maagkanker (EODGC) wordt beschouwd als een geïsoleerd individu is gediagnosticeerd met DGC met minder dan 45 jaar. CDH1 kiemlijn mutaties zijn gevonden in 30% van de gevallen HDGC [9]. De associatie van CDH1 mutaties en familiale maagkanker werd eerst beschreven door Guilford e.a.
in 1998 [10] en sindsdien vele studies verschillende CDH1 mutaties in HDGC [11], [12], [13 ]. Van alle gemelde CDH1
kiembaanmutaties, 77,9% is onzin, splice-terrein en frameshift mutaties (voorspeld voortijdige beëindiging codons produceren) en 22,1% zijn missense mutaties [9]. Mutaties die PTC genereren doorgaans schadelijk, de patiënten als hoog risico dragers, en worden geadviseerd profylactische totale gastrectomie [14] hebben. De pathogeniciteit van missense mutaties is niet eenvoudig, en deze wijzigingen worden gewoonlijk aangeduid als Zonder Classificatie sequentievarianten (USVs) door het ontbreken van strenge criteria om hun effect te evalueren. Verschillende parameters zijn in aanmerking genomen voor de indeling van E-cadherine USVs in HDGC: 1) co-segregatie van de mutatie met DGC (binnen stambomen); 2) mutatie frequentie in de gezonde controle bevolking; 3) mutatie recidief (in onafhankelijke families). Segregatieanalyse vaak onmogelijk, met een klein aantal getroffen gevallen vindt moleculaire diagnose [15], en het ontbreken van klinische informatie is een beperkende stap bij de pathogene betekenis van deze mutaties afleiden. Om deze beperking hebben we eerder ontwikkelde omzeilen in vitro
functionele assays om de functionele gevolgen van de E-cadherine kiemlijn missense mutaties [16], [17] te evalueren. Dergelijke studies impliceren lab specifieke experimentele omstandigheden, namelijk celbiologie assays en zijn tijdrovend om te gebruiken in routine. In silico
voorspellingen zijn betrouwbare en snelle analyse die men kan gebruiken om de gevolgen van de puntmutaties te voorspellen, vooral als structurele informatie is beschikbaar [18], [19].

In dit werk, verkenden we het potentieel van de structuur op basis van in silico
voorspellingen om de impact van E-cadherine missense mutaties gevonden bij erfelijke en sporadische kanker te evalueren. Onze analyse is gebaseerd op de berekening van native-state stabiliteit veranderingen bij elke variant (AAG = Ag _{WT-Ag Mut), verkregen door het eiwit ontwerp FoldX algoritme [20], [21]. Interessant is dat de groep patiënten harboring destabiliserende mutaties (AAG > 0,8 kcal /mol) wordt gekenmerkt door een jongere leeftijd bij diagnose of dood door DGC suggereert dat het verlies van E-cadherine natieve toestand stabiliteit bijdraagt ​​aan het fenotype. Via een cellulair model, analyseerden we het fenotype van E-cadherine destabilisatie en gevonden dat wanneer een mutatie induceert verlaagde natieve toestand stabiliteit, E-cadherine voortijdig afgebroken door het proteasoom, vertoont kortere halfwaardetijd, wat resulteert in verlies van de kleefstof functie. Al met al, onze resultaten suggereren dat destabilisatie goed is voor de pathogeniciteit van E-cadherine missense mutaties gevonden in HDGC.}

Materialen en methoden

Het verzamelen van E-cadherine sequentievarianten en VOB

E-cadherine varianten geassocieerd HDGC of EODGC werden verzameld uit de literatuur en somatische varianten werden verzameld uit de catalogus van somatische mutaties in Cancer (COSMIC) gegevensbank (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/kosmische /). Drie nieuwe E-cadherine sequentievarianten waarin gemeld aan ons lab voor functionele analyse: E185V, S232C en L583R. Onlangs, L583R werd gemeld, met functionele data in verband [22].

-E-cadherine-gerelateerde VOB werden geïdentificeerd via de automatische zoekfunctie met Swiss Model Repository (http://swissmodel.expasy.org). Sequentie afstemming van de E-cadherine en elk van de sequenties die voor de verschillende modellen werd uitgevoerd met M-koffie [23], [24] (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/play?name=mcoffee ). Beelden werden bereid met PyMOL. Na het analyseren van sequentie en structurele homologie werden drie VOB geselecteerd om te gebruiken als modellen:. Xenopus C-cadherine ectodomein (VOB 1L3W), muis E-cadherine prodomein (VOB 1OP4) en de muis β-catenine interactie domein (VOB 1I7X)

FoldX berekeningen en SIFT analyse

Met behulp van FoldX commando (http://foldx.crg.es/) Buildmodel
bouwden we drie verschillende modellen (prodomein, extracellulaire en cytoplasmatische); de drie structuren werden gehumaniseerd door substitutie van alle verschillende aminozuur. De resulterende structuur werd geoptimaliseerd met behulp van het commando RepairPDB
en de energieën, waar geanalyseerd met Stabiliteit golfreizen of AnalyseComplex
opdrachten. De ziekte-geassocieerde mutaties werden gegenereerd met de Buildmodel
opdracht, elke mutatie herhaald in vijf runs. De energieën zijn een automatische output in FoldX, en de autochtone staat stabiliteit verandering, AAG, tussen WT en mutant (AAG = Ag _{WT-Ag Mut) wordt ook geproduceerd in een apart bestand, met de bijbehorende standaard afwijkingen en de energetische boetes voor elke mutatie. Alleen mutaties met AAG > 0,8 kcal /mol werden beschouwd als schadelijke}

We gebruikten SIFT (http://sift.jcvi.org/, sorteren intolerante Van Tolerant) voor het behoud van elk aminozuur substitutie te evalueren, zoals eerder. beschreven [25], met behulp van de Blink functie van GI:. 31073. Alleen mutaties met een score lager dan 0,05 werden beschouwd als intolerante te zijn

prop (http://www.cbs.dtu.dk/services /prop /) [26] werd gebruikt om te beoordelen of mutaties een effect op prodomein splitsing zou kunnen hebben.

Celkweek en transfecties

E-cadherine WT cDNA werd gekloond in pIRES2-EGFP vector volgens instructies (Clontech, Takara Bio) en mutaties E185V, S232C, L583R en L583I he-cadherine geïnduceerd door plaatsgerichte mutagenese vervaardigen eerder [27] beschreven. De lege vector (Mock) werd als controle

CHO (Chinese Hamster Ovarium) cellen (ATCC nummer: CCL-61). Alfa werden gekweekt in MEM-medium (Gibco, Invitrogen) aangevuld met 10% foetaal runderserum serum (FBS, Gibco, Invitrogen) en 1% penicilline-streptomycine (Gibco, Invitrogen). Cellen werden sporadisch geëvalueerd mycoplasma besmetting door imunofluorescence met DAPI. Cellen werden getransfecteerd met 1 ug van elk van de vectoren die coderen voor de verschillende vormen van E-cadherine (WT, E185V, S232C, L583R en L583I) met gebruik van Lipofectamine 2000 (Invitrogen), volgens de procedure vervaardiging. Voor een stabiele cellijn oprichting werden de cellen geselecteerd door antibioticaresistentie tot 5 ug /ml blasticidine (Gibco, Invitrogen). Alle cellijnen werden in een bevochtigde incubator met 5% CO _{2 bij 37 ° C}

Functionele testen

transiënt getransfecteerde CHO (Chinese Hamster Ovarium) cellen (ATCC nummer:. CCL -61) onderworpen aan citometry stromen via GFP fluorescentie meting, de transfectie-efficiëntie voor elk experiment evalueren. Voor de langzame aggregatietest, putjes van 96-well-platen werden bekleed met 50 pl agar-oplossing (100 mg Bacto-Agar in 15 ml steriel PBS). De cellen werden losgemaakt met trypsine en gesuspendeerd in kweekmedium. Een suspensie van 1 x 10 ^{5 cellen /ml werd bereid en 2 x 10 4 cellen werden in elk putje. De plaat werd geïncubeerd bij 37 ° C in een vochtige kamer met 5% CO _{2 gedurende 48 uur. Aggregatie werd geëvalueerd in een omgekeerde microscoop (4 x vergroting) en gefotografeerd met een digitale camera.}}

Western blotting

De cellysaten werden verkregen met Catenin lysisbuffer (1% Triton X-100, 1 % Nonidet P-40 in PBS), gesupplementeerd met protease inhibitor cocktail (Roche) en fosfatase-inhibitor cocktail (Sigma). Eiwit kwantificatie werd uitgevoerd door een gemodificeerde Bradford assay (Bio-Rad). Voor elk monster werd 25 ug eiwit werd geladen, gescheiden in 7,5% SDS-PAGE en elektroblotting overgebracht naar nitrocellulose membraan (GE Healthcare Life Sciences). Membranen werden geblokkeerd met 5% niet-vette droge melk en 0,5% Tween-20 in PBS. Immunoblotting werd uitgevoerd met antilichamen tegen E-cadherine (1:1000; BD Biosciences), actine (1:1000; Santa Cruz Biotechnology) en α-tubuline (1:10000; Sigma). Schaap anti-muis (GE Healthcare Life Sciences) en ezel anti-geit (Santa Cruz Biotechnology) werden toegepast als secundaire antilichamen, gevolgd door ECL-detectie (GE Healthcare Life Sciences). Immunoblots werden gekwantificeerd Quantity One software (Bio-Rad).

fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)

De cellen werden gekweekt tot een confluente monolaag losgemaakt met Versene (Gibco, Invitrogen) en opnieuw gesuspendeerd in ijskoud PBS met 0,05 mg /ml CaCh _{2. Een suspensie van 5 x 10 ^{5 cellen werd gedurende 5 minuten bij 1500 rpm 4 ° C en gewassen in PBS met 0,05 mg /ml CaCh 2 3% BSA. De cellen werden gedurende 60 minuten met een primair antilichaam tegen E-cadherine, HECD1 (Zymed Laboratories) en 1:100 verdunning. Cellen werden tweemaal gewassen en daarna geïncubeerd met gebiotinyleerd anti-muis (Dako) en 1:100 verdunning. Cellen werden tweemaal gewassen en vervolgens geïncubeerd met streptavidine-PE CY5 (BD Pharmingen) in 1:40 verdunning. Tenslotte werden de cellen gewassen, geresuspendeerd in 500 pl PBS, en 50.000 cellen werden geanalyseerd op een flowcytometer (Coulter Epics XL-MCL). Gegevens werden geanalyseerd met WinMDI software.}}

immunofluorescentiekleuring

Voor immunofluorescentie microscopie en cellen werden gezaaid op glazen dekglaasjes en gekweekt tot ongeveer 80% confluentie in ijskoude methanol gefixeerd gedurende 15 minuten, gewassen 2 keer met PBS en geïncubeerd met primair antilichaam, verdund in PBS 5% BSA, gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Gebruikte primaire antilichamen: muis monoklonaal anti-E-cadherine (BD Biosciences); konijn anti-calnexin (Stressgen). Secundaire antilichamen gebruikt: Alexa Fluor 488 anti-muis (1:500, Invitrogen); Alexa Fluor 594 anti-konijn (1:500; Invitrogen). De dekglaasjes werden gemonteerd op glasplaatjes, met behulp van Vectashield met DAPI nucleaire detectie (Vector Laboratories). Afbeelding acquisitie werd uitgevoerd op Carl Zeiss apotome Axiovert 200 M fluorescentiemicroscoop met behulp van 40 × doelstellingen. Beelden werden verworven met Axiocam HRm camera en verwerkt door software Axiovison versie 4,8.

Cell Behandelingen

Voor de eiwitsynthese remming cellen werden behandeld met 25 uM cycloheximide gedurende 8 uur en 16 uur, en de totale hoeveelheid E-cadherine werd geanalyseerd door WB zoals eerder beschreven. Voor het proteasoom inhibitie assay werden cellen uitgezaaid in 6 well platen, gekweekt tot ongeveer 80% confluentie, en gedurende 16 uur met 10 uM MG132 (Calbiochem). Cellysaten werden geanalyseerd door WB zoals eerder beschreven.

Resultaten

1. E-cadherine structurele modellen

Er zijn weinig humane E-cadherine (HE-cad) structuren beschikbaar zijn, en ze hebben alleen betrekking op kleine porties van het eiwit (Tabel S1). Gebruik automatisch zoeken van Swiss Model Repository, vonden we dat PDB 1L3W, geannoteerde de volledige lengte extracellulaire domein van Xenopus EP-cadherine (EP-cad), zeer homoloog hetzelfde domein van humane E-cadherine. We analyseerden sequentiehomologie met alignment met M-koffie, een multiple sequence alignment dat de uitgang van meerdere multiple sequence alignment pakketten combineert (PCMA, Poa, Mafft, Spier, T-koffie, ClustalW, ProbCons, DialignTX) [23], [24 ]. Figuur 1A toont de uitlijning van de twee extracellulaire domein sequenties. De rode bakstenen regio's vertegenwoordigen een perfecte overeenstemming tussen de gebruikte methoden, wat neerkomt op zeer vergelijkbare sequenties. Om het model structuur op te bouwen, we verwijderd regio's met geen enkele gelijkenis (Figuur 1A, sterren), en beperkt het model om regio's met een betrouwbare uitlijning (zwarte pijl, figuur 1A). De Xenopus structuur werd gehumaniseerd zoals beschreven in Materiaal en Methoden en Figuur 1B toont de structurele aanpassing van de HE-cad EC1 EC2-domeinen (VOB 2O72) en EC1 EC2-domeinen van de Xenopus afgeleide structurele model. Beide structuren zijn bijna gesuperponeerd, wat aangeeft dat de overeenstemming tussen de extracellulaire domeinen van humane E-cadherine en Xenopus EP-cadherine is niet alleen de sequentie maar ook op structureel niveau. Het model structuur van de menselijke E-cad vertoont compatibel energieën met de structuur van Xenopus, met een lichte daling van de vrije energie (Ag) verkregen voor het model (Ag _{echte = 559,99 kcal /mol en Ag model = 531,77 kcal /mol), wat aangeeft dat de humanisering niet extra botsingen teweegbrengt. Onlangs heeft een structuur van de muis extracellulaire domein werd vrijgegeven (VOB 3Q2V, Tabel S1), en we gebruikten ook deze structuur als een model, als een manier om de resultaten verkregen met het Xenopus model te verfijnen.}

We gevestigd twee modellen, die het prodomein (VOB 1OP4, uit muizen N-cadherine) en β-catenine cytoplasmatisch domein (VOB 1I7X, van muis E-cadherine), volgens dezelfde methode. Al met al, de drie modellen het grootste deel van de eiwitstructuur (figuur 1C): de prodomein model heeft betrekking op posities 28-117, de extracellulaire modellen positioneert 155-697 en de β-catenine cytoplasmatische domein omvat 782-838. Op het niveau van de juxtamembraan domein, wordt een structuur geannoteerd, omvattende het interagerende oppervlak tussen E-cadherine en p120 [28]. Deze structuur bevat een kleine, 18 aminozuren lang peptide (posities 756-773 die over He-cad), met een zeer lage structurele gehalte factoren die de betrouwbaarheid van de energieberekeningen verlagen zodat we afgedankte deze structuur van de analyse.

2. In silico
voorspelling van de gevolgen van kanker-geassocieerde E-cadherine USVs

-E-cadherine mutaties zijn niet alleen de genetische oorzaak van HDGC, maar ze zijn ook vaak gevonden in verschillende soorten van sporadische kankers. We analyseerden in silico of the impact van alle kanker-geassocieerde E-cadherine missense mutaties die lokaal te maken aan de door de structurele modellen regio's gegenereerd: 22 kiembaanmutaties gevonden in de instellingen van HDGC en EODGC, en 57 gevonden in sporadische kankers. Kiembaan-E-cadherine USVs werden verzameld uit de literatuur, en sommige zijn persoonlijke communicatie van ons lab. Sommige HDGC /EODGC mutaties onmogelijk te modelleren, vanwege het gebrek aan structurele informatie (bijvoorbeeld degene gelokaliseerd in het juxtamembraan gebied van E-cadherine) en werden niet opgenomen in deze analyse. Somatische mutaties werden vanuit het Cancer Genome Project database en bevatten mutaties in maag- en lobulaire borstkanker (de enige twee soorten kanker geassocieerd met HDGC), maar ook andere vormen van kanker zoals synoviaal sarcoom of galgang carcinoom (Tabel S2 ).

de structurele modellen eerder beschreven, gebruikten we FoldX om alle kanker geassocieerde USVs genereren en evalueerden hun natieve toestand stabiliteit, Ag (gewoonlijk aangeduid als totale energie voor de eenvoud) [20]. De energetische verschil tussen de WT verwijzing en de overeenkomstige mutant (AAG = Ag _{WT-Ag Mut) werd berekend voor de 22 HDGC /EODGC E-cadherine USVs gelokaliseerd in de onder het model structuren regio's, en de resultaten zijn weergegeven in tabel 1. Indien AAG negatief is, geeft een winst van natieve toestand stabiliteit in de mutante vorm; wanneer het positief is, betekent dit dat de mutant minder stabiel dan de WT referentie. Eerdere studies in andere eiwitten hebben aangetoond dat stabiliteitswijzigingen berekend FoldX algoritme dan 0,8 kcal /mol liggen de afwijking vertoonde van de software, en dus als niet-significant [21] is. Daarom hebben we alleen maar beschouwd mutaties destabiliserend zijn wanneer zij veranderingen energie van meer dan 0,8 kcal /mol induceren. In figuur 2A, mutaties boven de regeling zijn destabiliserende, terwijl de onderste die structureel worden getolereerd. Het is duidelijk dat het destabiliseren van mutaties spead langs het eiwit, zonder preferentiële domein beïnvloed.}

De prodomein van He-cad wordt afgesplitst tijdens de rijping, en als dit niet wordt bereikt, wordt E-cadherine lijm functie aangetast [ ,,,0],29], [30]. De mutaties gelokaliseerd op dit gebied, evalueerden we de impact van totale energie FoldX, de conservering met SIFT en geëvalueerd als de verstoring van het predomein klievingsplaats met Prop aan (zie Materialen en Werkwijzen). We vonden dat zowel erfelijke (G62V en T118R) en sporadische (P30T, G62D, H92Y, H121R en H123Y) mutaties gelokaliseerd in E-cadherine prodomein structureel worden getolereerd, zoals voorspeld door FoldX (Tabel S3). Toen we het effect gebaseerd op behoud het gebruik SIFT analyseren, vonden we ook dat geen van de mutaties schadelijk beschouwd, omdat hun mate van conservering laag (tabel S3). Deze resultaten geven aan dat de pathogeniciteit van E-cadherine USVs gelokaliseerd in het prodomein waarschijnlijk niet afhankelijk destabilisatie. We vonden ook geen effect op de splitsing van het propeptide, zoals voorspeld vlg (gegevens niet getoond). Daarom geloven wij dat de pathogeniciteit van E-cadherine mutaties in dit gebied kan ontstaan ​​door de aantasting van het couperen van eiwitten betrokken bij predomein verwerking, onvoorspelbaar in silico
.

Erfelijke E -cadherin USVs overspannen de volledige lengte van het extracellulaire domein, maar sporadische mutaties voornamelijk worden gevonden in EC2-EC3, zoals volgens de eerder beschreven hotspot in exons 7-9 [5]. Van de totale 18 kiemlijn HDGC /EODGC mutaties gelokaliseerd op dit gebied, vonden we dat 10 een aanzienlijke structurele gevolgen in het eiwit (Tabel 1). Ongeveer de helft van de sporadische mutaties ook destabiliseren (Tabel S3), onafhankelijk van de EC domein waar ze zijn gelokaliseerd, wat suggereert dat de natieve toestand destabilisatie kan eventueel bij een aanzienlijk deel van sporadische kankers waarbij E-cadherine verlies door puntmutatie.

Slechts drie mutaties zijn gelokaliseerd in de regio in kaart gebracht door het model van de cytoplasmatische β-catenine bindingsdomein (P799R, V832M, S838G): de eerste twee die in de HDGC /EODGC omgeving en de andere sporadisch gevonden in eierstokcarcinoom [31]. Voor deze mutaties analyseerden we de bindingsenergie tussen E-cadherine en β-catenine en vond dat geen van hen aanzienlijk verandert de bindingsaffiniteit van β-catenine, volgens FoldX voorspelling. Dit komt overeen met de in vitro
resultaten blijkt dat de erfelijke mutatie V832M efficiënt bindt β-catenine en de pathogeniciteit lijkt afhankelijk van het onvermogen van de E-cadherine /catenine complex β-α binden te catenine [32], [33].

We verzamelden alle voorspellingen en functionele in vitro
gegevens van HDGC /EODGC mutaties en de betrouwbaarheid van de gebruikte voorspellers (tabel 1) geanalyseerd. We ingedeeld de resultaten van de voorspellingen als: True Positief (TP), wanneer de mutatie wordt voorspeld als schadelijk in silico
(hetzij door FoldX of SIFT) en een tentoonstellingsruimte verlies van functie In vitro
; True Negatieve (TN), wanneer de mutatie wordt voorspeld als getolereerd in silico Kopen en is functioneel In vitro
; False Positive (FP), wanneer de mutatie wordt voorspeld als schadelijk in silico
maar is functioneel In vitro
; en False Negative (FN), wanneer de mutatie wordt voorspeld als getolereerd in silico
maar vertoont In vitro
verlies van functie. TP en TN positieve resultaten, wat betekent dat de voorspellende kunnen de mutatie effect functie detecteren; FP en FN vertegenwoordigen de mate van mislukking. We vonden dat beide algoritmen kunnen de functionele gevolgen van maximaal 70% van de kiemlijn HDGC /EODGC mutaties (11 van 16 mutaties) voorspellen met voorspellingen overlappende helft van de mutaties (Tabel 1, Figuur 2B).

we analyseerden de gegevens beschikbaar zijn voor de kiembaan HDGC /EODGC mutaties vervoerders en, hoewel de informatie beperkt is, vonden we dat de meest complete set van gegevens is de leeftijd van onset of overlijden geassocieerd met DGC. Wanneer we box-plot van deze gegevens, groeperen "destabiliserende" en "Non-destabiliseren" mutation carriers, zien we een duidelijk jongere leeftijd van begin van de ziekte (diagnose of overlijden) voor de eerste groep (Figuur 2D), wat suggereert dat native-state destabilisatie accounts voor de eerdere ontwikkeling van DGC.

3. Biologische betekenis van E-cadherine destabilisatie

De biologische betekenis van E-cadherine destabilisatie te bepalen, gebruikten we als modelsystemen drie nieuw geïdentificeerde E-cadherine kiemlijn missense mutaties gemeld aan ons laboratorium voor functionele karakterisering: E185V, S232C en L583R, de latere onlangs in de literatuur beschreven [22]. in silico analyse
eerder beschreven werd gedurende deze drie nieuwe mutaties en de resultaten zijn opgenomen in Tabel 1 (onder de donkere lijn). Mutaties E185V en S232C structureel verdragen en AAG = 0,29 kcal /mol en -0,9 kcal /mol respectievelijk (Tabel 1), onbeduidend over de impact structuur. Mutatie S232C bevordert een vermindering in energie, het stabiliseren van het eiwit, en dit is te wijten aan het verlies van de hoge energie van een Serine begraven OH-groep, die niet betrokken is bij een H-binding, en in het verblijf van de zijketen van cysteïne. L583R mutatie induceert destabilisatie, met AAG = 2,72 kcal /mol, als gevolg van de dramatische verandering van een hydrofoob naar hydrofiel aminozuur, dat resulteert in een Arginine niet mogelijk H-bindingen te vormen, geen nadeel begraven.

I n vitro
functionele testen werden uitgevoerd voor de bovengenoemde HDGC /EODGC mutaties, en we vonden een perfecte correlatie tussen de functionaliteit in vitro
en de aanwezigheid /afwezigheid van structurele impact: E185V en S232C behouden de kleefstof functie van E-cadherine, en kunnen vast cellulaire aggregaten, terwijl L583R vertoont een duidelijk patroon verspreid, lijkt Mock cellen (Figuur 3A), wat aangeeft dat E185V en S232C niet-pathogeen en L583R pathogeen.

Als we E-cadherine-expressie geanalyseerd in de verschillende cellijnen, vonden we dat de totale hoeveelheid mutant L583R kleiner is dan het WT expressie onder dezelfde omstandigheden, terwijl mutaties E185V en S232C behouden normale niveaus (Figuur 3B). Interessant is dat de band overeenkomend met L583R vastgehouden in de gel, wat aangeeft dat L583R niet goed kunnen rijpen (onrijpe vorm van E-cadherine is 130 kDa rijpe is 120 kDa) en flowcytometrie resultaten tonen dat het minder expressie in de plasmamembraan (Figuur 3C).

Wanneer proteïnematuratie mislukt, dit resulteert gewoonlijk in het endoplasmatisch reticulum (ER) het aanhouden van onvolwassen eiwit. Nagaan L583R inderdaad behouden als onvolwassen, analyseerden we als het in het ER wordt vastgehouden door co-immunofluorescentie met ER marker calnexin (figuur 4A) en dusdanig gedeeltelijk de L583R signaal wordt gesuperponeerd met het ER marker, aangeeft toegenomen ER retentie.

Om te begrijpen als destabilisatie kon worden gedetecteerd in vitro
, analyseerden we de stabiliteit van L583R in de cel, het evalueren van de omzet. We geblokkeerd eiwitsynthese met cycloheximide en vonden dat L583R snel wordt afgebroken, zoals geëvalueerd door de resterende expressie kort na 8 uur van eiwitsynthese remming, in tegenstelling tot WT en de mutanten die nog in hoge mate tot expressie gebracht in dezelfde toestand (figuur 4B) Dit geeft aan dat L583R instabiel in de cel. De aanwezigheid van onrijpe band in WT of mutant E-cadherine monsters (bovenste band, figuur 4B) loopt de overbelasting van eiwit dat bij transiënte transfectie.

Unstable of verkeerd gevouwen eiwitten zijn strak gereguleerd door proteïne kwaliteitscontrole mechanismen dat de cellen te beschermen door het richten van nieuw gesynthetiseerde ongevouwen eiwitten voor afbraak in het proteasoom [34]. Aan te pakken als dit het geval is voor L583R, remde we het proteasoom activiteit MG132 en merkte op dat, ondanks de verschillende aanvankelijke niveaus van E-cadherine, de expressie van mutant L583R is geheel gerestaureerd na behandeling (Figuur 4C), wat aangeeft dat het voortijdig afgebroken door het proteasoom na synthese, zoals eerder beschreven voor andere juxtamembranar HDGC-geassocieerde mutaties E cadherine [35]. Interessant is dat wanneer proteasoom afbraak wordt geremd, is er een ophoping van onrijpe E-cad in alle cellijnen, manifesteert het belang van het proteasoom in de regulatie van nieuw gesynthetiseerde E-cad, onafhankelijk worden niet gemuteerd of niet.

Om verder valideren in silico
voorspellingen, analyseerden we het fenotype van een mutatie teruggezet gedestabiliseerd door het induceren van een structureel getolereerde verandering op dezelfde plaats van de mutante vorm van E-cadherine. Gebruik FoldX berekenden we het effect van elke mogelijke verandering in positie 583 en vond dat de wijziging induceren minder destabilisatie was L583I (AAG = 0,56 kcal /mol, zoals voorspeld met behulp van het muismodel Tabel S3). Interessant is dat deze mutatie blijft de kleefstof functie van E-cadherine, waardoor compacte celaggregaten (figuur 4D) en wordt niet gedestabiliseerd in vitro
, vertonen cicloheximide weerstand vergelijkbaar met de WT vorm (Figuur 4E). Deze resultaten onderstrepen de betrouwbaarheid van de in silico
gebaseerde voorspellingen van E-cadherine stabiliteit en de duidelijke associatie van E-cadherine destabilisatie met een verlies van lijm-functie.

Discussie

E-cadherine veranderingen (mutaties, deleties en methylering) zijn de enige erkende genetische oorzaak van HDGC [36], [37], [38]. De meeste mutaties die in zijn HDGC van de nonsens soort, maar een belangrijk deel (20%) van de kiemlijn mutaties leiden tot enkele aminozuur substituties, waarvan de pathogeniteit goed geëvalueerd vaak onduidelijk [39], [40]. De belangrijkste informatie op het gebied van genetische counseling van kiembaan missense mutation carriers is familiaire klinische informatie (segregatie-analyse, meestal) maar deze informatie is vaak schaars met de grootte van de stamboom vaak te klein om segregatie studies mogelijk te maken, en de pathogeniciteit assessment doorgaans komt van celgebaseerde
in vitro functionele testen [15], [17], wat tijdrovend en technisch veeleisend zijn, en dus niet breed toepasbaar in routine moleculaire laboratoria. Bijgevolg is er behoefte aan nieuwe methoden om de pathogeniciteit van E-cadherine missense mutaties geassocieerd HDGC [40] bepalen.

• PLoS ONE: Integratie van DNA Copy Number Wijzigingen en Transcriptionele expressie analyse in Human MaagKanker
• PLoS ONE: Melk gefermenteerd door Propionibacterium freudenreichii apoptose van HGT-1 menselijke maagkanker Cellen