PLoS ONE: Overexpressie van Nucleaire apoptose-inducerende factor 1 Veranderde het proteomische profiel van de Cel Human maagkanker MKN45 en geïnduceerde celcyclus in G1 /S fase

Abstract

Nuclear apoptose-inducerende factor 1 (NAIF1) werd eerder gemeld om apoptose te induceren. Bovendien is de expressie van NAIF1 significant neerwaarts gereguleerd in menselijke maagkanker weefsels vergeleken met aangrenzende normale weefsels. Echter, het mechanisme waardoor de NAIF1 gen induceert apoptose niet volledig begrepen. Onze resultaten tonen dat NAIF1 minimaal tot expressie werd gebracht in alle geteste maagkanker cellijnen. Onze gegevens tonen ook aan dat NAIF1 gelokaliseerd in de kernen van cellen zoals gedetecteerd door het volgen van de groene fluorescentie van NAIF1-GFP-fusie-eiwit met fluorescerende confocale microscopie. Vervolgens werd een vergelijkende proteomische benadering van de differentiële expressie van eiwitten tussen maagkanker cellijnen MKN45 /NAIF1 identificeren (-) en MKN45 /NAIF1 (+). We vonden vijf eiwitten (proteasoom 26S subunit 2, proteasoom 26S subunit 13, NADH dehydrogenase Fe-S-eiwit 1, chaperonine met TCP1 subunit 3 en thioredoxinereductase 1), die up-gereguleerd en drie eiwitten (ribonucleaseremmer 1 waren, 14-3- 3-eiwit epsilon isovorm en apolipoproteïne AI bindend eiwit) die werden down-gereguleerd in de MKN45 cellen overexpressie NAIF1. We hebben ook ontdekt dat NAIF1 celcyclus in G1 /S-fase kan induceren door het veranderen van de expressie van celcyclus eiwitten cyclinD1, cdc2 en p21. Het differentieel tot expressie eiwitten hier geïdentificeerd zijn gerelateerd aan verschillende cellulaire programma's met betrekking tot celcyclus, apoptose, en signaaltransductie regelgeving en suggereren dat NAIF1 een tumor suppressor bij maagkanker kan zijn. Ons onderzoek levert het bewijs dat de rol van de manier waarop NAIF1 functies bij maagkanker belicht

Visum:. Yang M, Zhong J, Zhao M, Wang J, Gu Y, Yuan X, et al. (2014) Overexpressie van Nucleaire apoptose-inducerende factor 1 Veranderde het proteomische profiel van de Cel Human maagkanker MKN45 en geïnduceerde celcyclus in G1 /S fase. PLoS ONE 9 (6): e100216. doi: 10.1371 /journal.pone.0100216

Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ', Italië

Ontvangen: 27 oktober 2013; Geaccepteerd: 23 mei 2014; Gepubliceerd: 13 juni 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit onderzoek werd gesteund door de National Key Basic Research Program van China (2007CB914700). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is een van de meest voorkomende maligniteit in de wereld veroorzaakt ongeveer 8% en 10% van de jaarlijkse kankergevallen en sterfgevallen respectievelijk. Volgens de wereldwijde epidemie rapport van de World Health Organization, zijn bijna een miljoen maagkanker gevallen en 738.000 sterfgevallen geschat op zich hebben voorgedaan in 2008 [1], [2]. Veel pogingen zijn ondernomen in de klinische; De mortaliteit van patiënten met maagkanker is nog steeds zo hoog als 70% [2]. Een reden voor deze hoge mortaliteit die maagkankerpatienten vaak niet gediagnosticeerd tot het gevorderde stadium, die te laat om effectieve behandeling. Daarom is er een duidelijke behoefte om nieuwe biomerkers en effectieve strategieën voor vroegtijdige diagnose en behandeling van maagkanker voorbeeld.

Proteomics is gebruikt in vele onderzoeksgebieden, waaronder kankeronderzoek. Gemeenschappelijke monsters proteoomanalyse voor kankeronderzoek omvatten weefsel en bloed van kankerpatiënten, evenals kanker cellijnen met verschillende achtergronden en verschillende behandelingen [3] - [6]. Deze proteomische analyses werden gebruikt om het ontstaan ​​en de ontwikkeling van kanker te onderzoeken of te zoeken diagnostische biomarkers. De resultaten die we door middel van proteomics methoden verkregen zijn niet alleen te wijten aan de directe regulering van de transcriptie niveau, maar weerspiegelen ook post-translationele modificaties van eiwitten [3], [7]. Daarom kunnen we zowel de expressie en regulatie van eiwitten met proteomics analyses te analyseren. Ondanks tal van technieken in opkomst, heeft 2-dimensionale elektroforese in combinatie met massaspectrometrie de meest gebruikte methode voor het proteomics analyse gebleven.

Het menselijk gen dat codeert voor de nucleaire apoptose-inducerende factor 1 (NAIF1) bevindt zich op chromosoom 9q34.11 . NAIF1 codeert voor een eiwit met een Myb
-achtig domein aan het N-terminale gebied [8], [9]. Eerdere studies hebben aangetoond dat overexpressie van NAIF1 in menselijke kankercellijnen HeLa en MKN45 induceert apoptose [8], [10]. . Bovendien, Luo et al, vond dat NAIF1 aanzienlijk wordt uitgedrukt in normale maag weefsel, terwijl de expressie down-gereguleerd of verloren bij maagkanker weefsels ( P <
0,001). Bovendien was NAIF1 expressie hoger in goed gedifferentieerde ( P
= 0,004) dan in moderately- of slecht gedifferentieerde maagkanker [10]. De rol van NAIF1 het reguleren van de cellulaire eiwitexpressie profiel niet bekend.

In de onderhavige studie hebben we gebruik proteomics technologie op basis van 2-dimensionale elektroforese in combinatie met MALDI-TOF massaspectrometrie van eiwitten geassocieerd met de identiteit biologische functies van NAIF1. De eiwitexpressie profielen van de maagkanker cellijn, MKN45 dan niet NAIF1 overexpressie werden geanalyseerd en vergeleken met behulp van 24 cm pH 3-10 NL traject geïmmobiliseerde pH-gradiënt (IPG) strips. Om deze gegevens te valideren, gemeten we RNA expressie niveaus van alle de verschillend tot expressie gebrachte eiwitten en drie eiwitten werden verder geverifieerd door western blotting. Onze resultaten tonen aan dat NAIF1 induceert celcyclus in G1 /S-fase van de expressie niveaus van cyclinD1 cdc2 en p21 eiwit. De resultaten van onze studie kan leiden tot een beter begrip van hoe NAIF1 werkt bij het induceren van apoptose en ook kan licht werpen op de diagnose en therapie van maagkanker in de toekomst.

Materialen en Werkwijzen

celkweek en transfectie

Human maagkanker cellijnen MKN45, BGC823, AGS en SGC7901 werden verkregen van de Tumor Cell Bank Chinese Academisch van geneeskunde en in vloeibaar Dulbecco's minimaal essentieel medium (DMEM) aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 100 IE /ml penicilline, 100 ug /ml streptomycine bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO _{2 atmosfeer. DNA-transfectie werd uitgevoerd met de X-tremeGENE HP DNA transfectiereagens (Roche, Zwitserland) volgens de instructies van de fabrikant.}

Expressieplasmiden

De expressieplasmiden pEGFP-N1-NAIF1, die drukt een NAIF1-GFP-fusie-eiwit, en pEGFP-N1 die groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengt, werd vriendelijk verschaft door Dr. Qing Luo [10].

celcyclusverdeling analyse

Exponentieel groeiende cellen werden getransfecteerd met de vector pEGFP-N1 of pEGFP-N1-NAIF1 plasmide. Cellen werden geoogst op 24 uur of 48 uur na transfectie, en 1 x 10 ^{6 cellen werden tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 4% paraformaldehyde gedurende 1 uur gefixeerd bij 4 ° C gewassen. Na centrifugatie, de celpellets werden opnieuw gesuspendeerd in kleuroplossing (0,05 mg /ml propidiumjodide (PI), 0,2 mg /ml RNase en 0,1% Triton X-100) bij 4 ° C gedurende 15 minuten in het donker. Flow cytometrie analyse van GFP en PI werd uitgevoerd met een BD LSR II cell analyzer (BD, San Jose, CA, USA). PI-fluorescentie werd gemeten onder de GFP positieve celpopulatie en de verdelingen van de celcyclus werd geanalyseerd met ModFit LT3.2 software. Drie afzonderlijke monsters werden bereid en alle testen werden uitgevoerd in drievoud.}

Kwantificering van apoptose

Kwantificering van apoptose werd uitgevoerd met het PE Annexine V Apoptose Detectie Kit I (BD). In het kort werden BGC823 of MKN45 cellen getransfecteerd met de vector pEGFP-N1 of pEGFP-N1-NAIF1 plasmide. Na 24 uur of 48 uur na transfectie werden de cellen geoogst, gewassen met koude PBS tweemaal en vervolgens geresuspendeerd met bindingsbuffer (10 mM Hepes /NaOH (pH 7,4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCh _{2) . De opnieuw gesuspendeerde cellen werden geïncubeerd met Phycoerythrine (PE) geconjugeerd annexine V (AV) en 7-amino-actinomycine (7-AAD) en vervolgens gemeten met stroomcytometrie het BD- LSR II cell analyzer. Vier verschillende celpopulaties kan worden gedetecteerd in een dot-plot: levensvatbare cellen (AV ^{- /7-AAD -), vroege-fase-apoptotische cellen (AV + /7-AAD - ), late-fase apoptotische cellen (AV + /7-AAD +) en necrotische cellen (AV - /7-AAD +). Een minimum van 10.000 GFP positieve cellen werden geteld per monster en de gegevens werden gerapporteerd als het percentage apoptotische cellen (AV + /7-AAD - en AV + /7-AAD + ) onder totale cellen. Drie onafhankelijke monsterbereidingen werden gemaakt en alle assays werden in drievoud herhaald.}}

confocale scanning

Achtenveertig uur na transfectie werden de cellen driemaal met PBS gewassen en met 4% paraformaldehyde gedurende 15 vastgesteld min. op kamertemperatuur. Om de permeabiliteit van de celmembraan verbeteren, werden de cellen geïncubeerd met 0,5% Triton X-100, gevolgd door incubatie met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) om de kernen te kleuren. Cellulaire verdeling van NAIF1 werd geanalyseerd door het monitoren van de groene fluorescentie van de NAIF1-GFP-fusie-eiwit met een Leica Microsystems GmbH Heidelberg microscoop.

Protein voorbereiding van 2-DE

Voor elk monster 5 × 10 ^{6 cellen werden geoogst en gelyseerd in 1 ml lysis buffer (7 M ureum, 2 M thioureum, 2% CHAPS, 20 mM DL-dithiothreitol (DTT), 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 30 mM natriumfluoride en 0,25 mg /ml RNaseA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd, en vervolgens gecentrifugeerd bij 4 ° C gedurende 30 minuten. bij 12.000 rpm. Het supernatant werd overgebracht naar een nieuwe buis en geconcentreerd met 0,1 M NH _{4COOH. Lysisbuffer werd toegevoegd aan een eindvolume van 800 pl, en de eiwitconcentratie werd bepaald met een Bradford-assay (Tiangen, Beijing, China).}}

Tweedimensionale elektroforese

Tweedimensionale elektroforese werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [5]. In het kort, 1 mg eiwit werd verdund tot 450 ul met rehydratie buffer (7 M ureum, 2 M thioureum, 2% CHAPS en 20 mM DTT). IPG strips (IPG, 24 cm, pH 3-10, NL, GE Limit.) Werden gerehydrateerd met gerehydrateerd monsters gedurende 18 uur bij kamertemperatuur geroerd. De eiwitten werden onderworpen aan isoelektrisch focusseren met een Ettan IPGphorIII (GE, CT, USA) achtereenvolgens gedurende 1 uur bij 100 V, 1 uur bij 250 V, 1 uur bij 500 V, 1 uur bij 1000 v, 1 uur bij 3000 v, 1 h bij 5000 v, 2 uur bij 8000 v en 6 uur bij 8000 v in totaal 80 KVH krijgen. Na het iso-elektrisch focusseren, werden IPG strips geëquilibreerd met evenwichtsbuffer I (6 M ureum, 150 mM Tris-HCl (pH 8,8), 30% glycerol, 2% SDS, 1% DTT) gedurende 15 min. gevolgd door een tweede incubatie met een equilibreren buffer II (6 M ureum, 150 mM Tris-HCl (pH 8,8), 30% glycerol, 2% SDS, 2,5% joodacetamide) gedurende 15 min. De tweede dimensie van de SDS-PAGE werd uitgevoerd met 12,5% SDS-PAGE-gels met behulp van de Ettan DALT SIX verticale systemen (GE) uitgevoerd.

Gel kleuring en beeldanalyse

De SDS-PAGE gels werden vastgesteld bij de vaststelling-buffer (10% CH _{3COOH, 40% C 2 H 5Oh, en 50% DDH 2O) gedurende 30 min. De gels werden vervolgens in DDH 2O gewassen 10 min. 3 keer en gekleurd met Coomassie blue G-250.}

De gels werden gescand met een beeld scanner met behulp van MagicScan software naar de plek patronen te evalueren. ImageMaster platinum software (versie 5.0) werd gebruikt om de gel beelden te analyseren. De spots die zowel de controle gel en NAIF1 gel waargenomen werden geanalyseerd en de intensiteit van elke vlek werd gekwantificeerd door het berekenen van de spot volume na het normaliseren van de gel. Kwantitatieve analyse van gel beelden (drie herhalingen /monster) werden genomen en vlekken met statistisch significant verschil (t-test, * P Restaurant < 0,05). Werden uitgesneden en verteerd voor identificatie

Protein identificaties

differentieel tot expressie eiwit plekken werden geëxtraheerd en de-gekleurd in 50 mM NH _{4HCO 3 /acetonitril (50/50) en gedroogd door middel van vacuüm centrifugeren. De stukken gel werden vervolgens gedigereerd met 10 ng /ml trypsine (Promega, WI, USA) in 50 mM NH 4HCO 3-buffer bij 37 ° C overnacht. De trypsine vloeistof werd overgebracht naar een schone buis, verdund met 100 pl 60% acetonitril /0,1% trifluorazijnzuur en behandeld met ultrageluid gedurende 15 minuten, drie keer. Alle opgenomen vloeistof werd verzameld en vacuüm gedroogd en bewaard bij -80 ° C. De geëlueerde peptiden werden geanalyseerd met behulp van een Bruker UltraFlex MALDI-TOF /TOF uitgerust met de SCOUT bron van BGI-Beijing. De resultaten van massaspectrum werden afgezet tegen zoogdierlijke sequenties van de NCBInr (niet redundante) gegevensbestand voor peptide mass fingerprinting identificatie.}

RNA isolatie, RT en real-time PCR Q

Totaal RNA werd geëxtraheerd met behulp TRIzol reagens (Invitrogen) volgens het protocol van de fabrikant. cDNA werd gesynthetiseerd door reverse transcriptie met gebruikmaking van 1 ug totaal RNA met oligo (dT) _{18 primers en M-MuLV reverse transcriptase (TAKARA).}

Voor reverse transcriptie PCR primers voor NAIF1 en β-actine waren als volgt: NAIF1 sense, 5'AGCCACGGTCACCCTGACACA-3 ', en anti-sense, 5'CGTGTCTGCATGCTGGGCCAT-3'; P-actine sense, 5'GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 ', en anti-sense, 5'AGCGAGCATCCCCCAAAGTT. Alle primers werden ontworpen met behulp van NCBI blast en gekocht van Sangon, Beijing.

De kwantitatieve PCR werd uitgevoerd met de SYBR Green qPCR Kit (TAKARA, Japan) met een 20 pi reactie opgezet volgens de instructies van de fabrikant. Doelwit-genexpressie werd geanalyseerd met behulp van geschikte real-time qPCR primers (Tabel 1). β-actine werd gebruikt voor normalisatie. De real-time qPCR werd uitgevoerd op een ABI7300 cycler (ABI, MA, USA) onder de volgende omstandigheden: denaturatie gedurende 30 seconden bij 95 ° C, gevolgd door 40 cycli van denaturatie gedurende 5 s bij 95 ° C en extensie voor 31 s bij 60 ° C. Smeltcurve analyse werd uitgevoerd aan het einde de specificiteit van het verwachte PCR-product te valideren. Relatieve expressie werd berekend met de twee standaard curve werkwijzen. Drie onafhankelijke monsters werden bereid voor elke omstandigheid en elk experiment werd in triplo uitgevoerd.

Western Blotting

Western blotting werd uitgevoerd zoals eerder beschreven. In het kort werden 2 x 10 ^{6 cellen geoogst bij 500 met mediumstroom, gepelleteerd door centrifugatie gedurende 5 min g
en 3 keer gewassen met PBS. De cellen werden vervolgens gelyseerd met 100 ul lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,5% NP-40, 0,1% SDS en 50 ug /ml PMSF, met vers toegevoegde protease inhibitor cocktail) op ijs gedurende 30 min. Lysaten werden gecentrifugeerd bij 13.000 rpm gedurende 15 min. en de eiwitconcentratie werd gemeten met behulp van Bradford methode. Vijftig microgram eiwit werd gescheiden op 12% SDS-PAGE en overgebracht naar polyvinylideendifluoride membranen. De membranen werden geblokkeerd met 5% BSA in TBST gedurende een uur bij kamertemperatuur gevolgd door incubatie met primair antilichaam oplossingen volgens de instructies van de fabrikant (β-actine, 1:5000, Sigma, NAIF1, 1:1000, Santa Cruz; 14- 3-3 ε, 1:500, Santa Cruz, TCP1-γ, 1:1000, Abcam; TXNRD1, 1:1000, Abcam; CyclinD1, 1:1000, CST, cdc2, 1:500, CST, en p21, 1 :500, CST). De membranen werden 3 maal gewassen met TBST, gevolgd door incubatie met geschikte secundaire antilichamen gedurende twee uur bij kamertemperatuur. De signalen werden gedetecteerd met de ECL chemiluminescentiesysteem. β-actine werd gebruikt als controle.}

Statistische analyse

Alle statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Gegevens werden uitgedrukt als gemiddelden ± SD. t-test van de student werd gebruikt voor statistische vergelijking. Een bijbehorende waarde van de P <.
0,05 significant werd beschouwd

Resultaten

Getransfecteerde NAIF1 gelokaliseerd in de kern

Beide keren transcriptie PCR en western blotting experimenten aangetoond dat NAIF1 minimaal werd uitgedrukt in maagkanker cellijnen, MKN45, BGC823, AGS en SGC7901; dat NAIF1 werd gemakkelijk gedetecteerd toen het werd getransfecteerd in de cellen (Fig. 1A en B). We getransfecteerde een NAIF1 GFP-fusieconstruct in MKN45 en BGC823 cellen en GFP vector werd gebruikt als controle. Confocale microscopie toonde aan dat wanneer cellen werden getransfecteerd met de pEGFP-N1-NAIF1 construct, werd groene fluorescentie alleen in de kernen waargenomen; integendeel, werd de groene flurescent gedetecteerd gedurende de gehele cel wanneer getransfecteerd met het GFP-vector (Fig. 1C). Dezelfde resultaten werden ook waargenomen in andere cellijnen zoals BGC823 (figuur S1). Deze bevindingen bevestigden dat NAIF1 getransfecteerd eiwit is gelokaliseerd in de kern.

NAIF1 geïnduceerde celcyclus in G1 /S-fase

De celcyclus profiel van maagkanker cellen onder invloed van NAIF1 onderzocht volgende. GFP-positieve cellen werden geanalyseerd om de juiste bevolking te waarborgen werd gebruikt (figuur S2). Flow cytometrische analyse toonde aan dat NAIF1 induceerde een significante verandering in de verdeling van de celcyclus: een toename van de celpopulatie in de G0 /G1 fase en een afname in de S-fase werd waargenomen in overexpressie NAIF1 vergeleken met cellen getransfecteerd met de lege vector, zowel na transfectie 24 uur en 48 uur. Zoals te zien in figuur. 2A, stromingscytometrie bleek dat 24 uur na transfectie, ongeveer 54% van BGC823 cellen getransfecteerd met pEGFP-N1 vector waren in de G0 /G1 fase en 34% en 12% van cellen in de S-fase en G2 /M fase, respectievelijk . Anderzijds, in BGC823 cellen getransfecteerd met de pEGFP-N1-NAIF1 construct was er een duidelijke toename van het percentage cellen in G0 /G1 fase (74%), evenals een afname in het percentage cellen in S-fase (26%) en G2 /M fase (0%). Achtenveertig uur na transfectie, ongeveer 36% van de BGC823 controlecellen waren in G0 /G1 fase en 59% en 5% van de cellen in de S-fase en G2 /M-fase resp. In BGC823 cellen getransfecteerd met de pEGFP-N1-NAIF1 construct, ongeveer 55% van de cellen waren in G0 /G1 fase en 37% en 8% van de cellen in de S-fase en G2 /M-fase resp. In MKN45 cellen 24 uur na transfectie, ongeveer 56% van de cellen getransfecteerd met de vector pEGFP-N1 waren in G0 /G1 fase en 29% en 15% van cellen in de S-fase en G2 /M-fase resp. Ongeveer 76% van MKN45 cellen getransfecteerd met de pEGFP-N1-NAIF1 construct waren in G0 /G1 fase en het percentage cellen in S-fase en G2 /M-fase werd verlaagd tot 24% en 0% respectievelijk. Achtenveertig uur na transfectie, ongeveer 43% van de MKN45 controlecellen waren in G0 /G1 fase en 43% en 14% van cellen in de S-fase en G2 /M-fase resp. In MKN45 cellen getransfecteerd met de pEGFP-N1-NAIF1 construct, ongeveer 56% van de cellen waren in G0 /G1 fase en 28% en 16% van cellen in de S-fase en G2 /M fase, respectievelijk (Fig. 2B). Deze resultaten tonen duidelijk aan dat overexpressie van NAIF1 geïnduceerde celcyclus in G1 /S-fase van maagkanker cellen BGC823 en MKN45.

Om het mechanisme waarmee NAIF1 geïnduceerde celcyclus verduidelijken, onderzochten we de mogelijke rol van cyclinD1 p21 cdc2 en eiwitten die belangrijke regulering van de celcyclus in G1 /S-fase zijn. Achtenveertig uur na transfectie werden de expressieniveaus van cyclinD1 en cdc2 verminderd vergeleken met controle cellen, zowel in BGC823 en MKN45 cellen. Bovendien, de expressieniveaus van p21 werden verhoogd (Fig. 2C).

Vergelijkende proteoomanalyse van maagkanker cellijn MKN45 met of zonder extra expressie van eiwit NAIF1

De eiwitprofielen van MKN45 cellen die met de pEGFP-N1-NAIF1 constructen als de behandelde groep of de pEGFP-N1 vector als de controlegroep gemeten door 2-dE 48 uur na transfectie. In totaal werden meer dan 700 plekken opgelost, waarvan 11 eiwitten was > 1,5-voudige differentieel tot expressie zoals bepaald door analyse met ImageMaster versie 5.0. De differentieel tot expressie gebrachte eiwit spots werden uit de gel en 8 eiwitten werden geïdentificeerd door MALDI-TOF /TOF analyse. Vertegenwoordiger behandelde en controlegroep 2-DE-gel kaarten zijn weergegeven in figuur. 3A en het differentieel tot expressie gebrachte eiwit plekken zijn gemarkeerd. Megascoops- 2-DE gel foto's van elk van de differentieel tot expressie gebrachte eiwit spots zijn weergegeven in fig. 3B en 3C. Vijf van de eiwitten was opwaarts gereguleerd in de behandelde groep omvattende NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S eiwit 1 (NADUSF1), chaperonine met TCP1 subeenheid 3 (TCP1-γ), thioredoxine reductase 1 (TXNRD1), proteasoom 26S subunit 2 ( PSMC2) en proteasoom 26S subeenheid 13 (PSMD13). 3 eiwitten werden down-gereguleerd, waaronder ribonuclease inhibitor 1 (RNH1), 14-3-3 eiwit epsilon isovorm (14-3-3 ε) en apolipoproteïne A-I-bindend eiwit (APOAIBP). Tabel 2 geeft specifieke informatie over deze eiwitten en het niveau van differentiële expressie.

Validatie van differentieel geëxpresseerde eiwitten

Realtime qPCR en western blot werden uitgevoerd om de 2-DE verifiëren resultaten. Genexpressie niveaus van de geïdentificeerde eiwitten werden geanalyseerd door real-time qPCR en zijn in overeenstemming met de 2-DE resultaten, behalve voor een eiwit, 14-3-3ε (fig. 4A). Drie eiwitten werden geselecteerd op basis van hun grootte en mogelijke functies voor verdere analyse door Western blotting om de 2-DE resultaten te verifiëren. De resultaten tonen aan dat het eiwit expressieniveaus van TXNRD1 en TCP1-γ aanzienlijk de NAIF1 groep verhoogd vergeleken met de controlegroep ( P
< 0,05), terwijl het niveau van eiwitexpressie 14-3-3ε was aanzienlijk gedaald in de NAIF1 groep ( P <
0,05) (Figuur 4B.). Over het algemeen, de western blot resultaten zijn consistent met de 2-DE resulteert

Discussie

Verschillende studies zijn uitgevoerd om de NAIF1 gen te beschrijven.; Er is echter weinig bekend over de proteomische profiel NAIF1 tot overexpressie wordt gebracht. Het doel van deze studie was het opsporen en identificeren van eiwitten waarvan de expressie wordt gewijzigd MKN45 overexpressie NAIF1. Verder is bewijs geleverd hoe NAIF1 functies bij het induceren van apoptose van cellen en andere activiteiten verklaren. A 2-DE strategie werd in deze studie vanwege de gunstige methode en hoge efficiency. In totaal hebben we ontdekt en geïdentificeerd 5 eiwitten die werden opwaarts gereguleerd en 3 eiwitten die zijn downgereguleerd in MKN45 overexpressie NAIF1 vergeleken met de controlegroep. De geïdentificeerde eiwitten omvatten een aantal fysiologische activiteiten, zoals eiwitafbraak zeggenschap cel redox homeostase, celcyclus progressie cytoskelet verordening cellulaire stressrespons, apoptose en regulering van het metabolisme. De celcyclus profiel van maagkanker cellijnen BGC823 en MKN45 werd eveneens onderzocht en de resultaten toonden aan dat overexpressie van NAIF1 kan celcyclus induceren in G1 /S-fase via wijziging van de expressie van celcyclus eiwitten cyclinD1, cdc2 en p21 .

De resultaten van western blotting en reverse transcriptie PCR aangetoond dat NAIF1 minimaal werd uitgedrukt in maagkanker cellen. De hierin gepresenteerde gegevens zijn analoog aan conclusie Luo in weefsels [10]. Bovendien hebben we bevestigd dat NAIF1 is een nucleair eiwit in de maag kankercellijnen en MKN45 BGC823. Aangezien genomisch DNA bestaat voornamelijk in de kern, deze gegevens suggereren dat NAIF1 in de kern kan fungeren door interactie met genomisch DNA en nucleoproteïne om de expressie van genen en eiwitten volledig beïnvloeden. Daarom voerden we proteoomanalyse op het proteomische profiling van MKN45 overexpressie NAIF1 onderzoeken.

Abnormale regulatie van de celcyclus is een opvallend kenmerk van kankercellen [11]. Studies hebben aangetoond dat vele kleine moleculen celcyclus kan activeren en induceren celcyclus waardoor cellen gebreken te herstellen. Echter niet succesvol repairation leiden tot apoptose [12] - [15]. Onze resultaten tonen aan dat NAIF1 induceert celcyclus in G1 /S-fase. Overgang van G1 naar S-fase vereist de activering van de assemblage van cyclinD CDK4 /6 en cycline-cdc2 (ook bekend als Cdk1). Ondertussen, p21 remt de activiteit van cdc2 en bemiddelt assemblage en activering van cyclinD-cdk4 /6 in het cytoplasma, en remmen de activiteit in de nucleus [16]. In deze studie, western blotanalyse gedetecteerd dat eiwit expressieniveaus van cyclinD1 en cdc2 verminderden, terwijl het niveau van eiwitexpressie van p21 in cellen tot overexpressie NAIF1 verhoogd. Deze resultaten suggereren dat G1 /S celcyclus geïnduceerd door NAIF1 wordt gemedieerd door de p21 en cyclinD1 route. Bovendien hebben we aangetoond dat 48 uur na transfectie de populatie van apoptotische cellen ongeveer 10% verhoogd overexpressie NAIF1 als gevolg van de celcyclus (Fig S3).

26S proteasoom is een conservatieve organel in alle eukaryote cellen en is verantwoordelijk voor de intracellulaire eiwitafbraak [17]. Eiwitten die worden afgebroken door 26S proteasoom zijn betrokken bij een aantal biologische processen, waaronder apoptose, celcyclus en de groei en de expressie van vele genen die op hun beurt andere processen reguleren [18]. Verstoring van de eiwitafbraak evenwicht leidt tot het ontstaan ​​en de ontwikkeling van kanker. Aldus 26S proteasoom is een aantrekkelijk doelwit kankertherapie. Hier vonden we dat twee subeenheden van het 26S proteasoom, PSMC2 en PSMD13, waren beide up-gereguleerd in MKN45 cellen overexpressie NAIF1. PSMC2 en PSMD13 zijn subeenheden van het 19S proteasoom, dat de regulerende deeltje (RP) van het 26S proteasoom. PSMC2 een ATPase terwijl PSMD13 een non-ATPase. Sommige onderzoekers zijn van mening dat 26S proteasoom remming kan leiden tot apoptose van carcinoomcellen en proteasoom-remmers kunnen worden gebruikt voor de behandeling van kanker [19] - [21]. Echter, een studie van Tan et al.
Suggereert dat tumornecrosefactor (TNF) -α activeert het 26S proteasoom systeem up-reguleren van de expressie van het 26S proteasoom subunits [22]. TNF-α is een bekend cytokine dat apoptose in diverse kankercellen induceren, en nu wordt toegepast in de kliniek als regionale behandeling van lokaal geavanceerde weke delen sarcomen en melanomen metastase te voorkomen van de ledematen amputatie [23]. Zoals TNF-α, NAIF1 heeft ook de mogelijkheid om apoptose te induceren, hetgeen impliceert dat de 26S proteasoom betrokken kan zijn bij het apoptose proces geïnduceerd door NAIF1.

Onze gegevens tonen ook dat twee eiwitten, TXNRD1 en NDUFS1 zijn up-gereguleerd door NAIF1. TXNRD1 regelt de redox toestand van eiwit thiolen in zoogdiercellen, en functioneert in zowel bevordering en voorkoming van kanker in verschillende carcinomen [24] - [27]. Er zijn geen studies naar de rol van TXNRD1 bij maagkanker onderzoeken geweest. Naar onze mening kan TXNRD1 deelnemen aan de onderdrukking van maagkanker genesis of het up-regulatie van TXNRD1 kan een adaptief mechanisme in reactie op oxidatieve stress opgewekt door overexpressie van NAIF1 zijn. De NDUFS1 gen codeert voor een 75 kDa subeenheid Fe-S, die een van de zeven subeenheden van mitochondriale complex I [28]. Complex I is de grootste van de ademhalingsketen enzymen en tekortkomingen van complex I is de hoofdoorzaak van een reeks aangeboren mitochondriale ziekten, zoals het syndroom van Leigh [29]. Bovendien, de 75 kDa subeenheid van complex I is een caspase substraat dat betrokken is in het mitochondriale apoptose pathway. Caspase splitsing van NDUFS1 vereist voor verschillende mitochondriale veranderingen geassocieerd met apoptose, zoals ATP, ROS productie, en verlies van plasmamembraan integriteit etc. [30]. Aangezien NAIF1 induceert apoptose via mitochondriale pathway [8], veronderstellen we dat de opregulatie van NDUFS1 deel aan het proces apoptose geïnduceerd door NAIF1.

TCP1-γ is geïdentificeerd als een chaperonine in eukaryote cytosol. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat TCP1-γ significant wordt uitgedrukt in tumoren van hepatocellulair carcinoom vergelijking met gepaarde naburige niet-kwaadaardige tumor weefsels [31], [32]. Het verband tussen TCP1-γ en maagkanker is nog onbekend en verder onderzoek nodig is.

Anderzijds, identificeerden we drie eiwitten, 14-3-3ε, RNH1 en APOAIBP, dat was down- geregeld in MKN45 cellen overexpressie NAIF1. 14-3-3 is een eiwitfamilie bestaande uit multifunctionele eiwitten die binden met en de functies van een groot aantal cellulaire eiwitten. Verder zijn ze deel aan verschillende biologische processen, waaronder celcyclus regulatie, apoptose en celgroei [33]. Verschillende studies hebben gemeld dat 14-3-3ε expressie is verhoogd bij longkanker, hepatocelluar kanker, borstkanker en vulvaire plaveiselcelcarcinoom [34] - [37]. De enige uitzondering op deze verhoogde 14-3-3ε expressie bij maagkanker weefsels, waarbij de expressie verminderd wordt [38]. Bovendien hebben eerdere onderzoeken aangetoond dat opwaartse regulatie van 14-3-3ε Bad getriggerde apoptose in endotheelcellen [39] kunnen voorkomen, en niet-steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddelen kunnen colorectale kankercellen apoptose induceren door het onderdrukken 14-3- 3ε expressie [40]. Bovendien is een histopathologisch onderzoek meldde dat 114 hepatocellulaire carcinoom patiënten, verhoogde expressie van 14-3-3ε was significant geassocieerd met een hoog risico op metastase en verminderde overleving [35]. Cellulaire experimenten bevestigden dat 14-3-3ε expressie toegenomen induceert leverkanker celmigratie en bevordert epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) door het induceren van Zeb-1 en Slak expressie [41]. Tot slot 14-3-3ε is een opmerkelijk oncogen dat deelneemt aan de ontwikkeling van verschillende tumoren en speelt een belangrijke rol bij apoptose en metastase. Hier, vonden we dat 14-3-3ε is down-gereguleerd in MKN45 cellen overexpressie NAIF1, wat suggereert dat 14-3-3ε betrokken kan zijn bij het proces van apoptose geïnduceerd door NAIF1. Bovendien onze data betekent dat naast het induceren van apoptose en celcyclus kan NAIF1 een rol in celmigratie en metastase spelen. Onze resultaten tonen aan dat het eiwit expressieniveaus van 14-3-3ε waren verminderd, terwijl de RNA niveaus werden verhoogd. Deze resultaten tonen dat NAIF1 de expressie niveaus van 14-3-3ε posttranslationeel. Onze gegevens tonen de differentiële expressie van 14-3-3ε strijd met Leal [38], die kunnen worden veroorzaakt door het verschil tussen cellen en weefsels, of kan worden toegeschreven aan de bias in specimen selectie.

RNH1 is een cytosolisch eiwit dat RNases remt en vormt heterodimeren met hoge affiniteit met hen een controversiële rol spelen in angiogenese [42]. Er is een toename van onderzoeken naar de relatie tussen RNH1 en kanker onderzoeken geweest.

• PLoS ONE: epidermale groeifactor-achtige domein-bevattend eiwit 7 (EGFL7) Verbetert de EGF-receptor-AKT Signalering,-mesenchymale transitie en metastase van maagkanker Cells
• PLoS ONE: De NOD-like receptor Signalling Pathway in Helicobacter pylori infecties en hiermee samenhangende maagkanker: A Case-Control Study en Gene Expression Analyses