Stomach Health > Maag Gezondheid >  > Stomach Knowledges > onderzoeken

Palm vitamine E vermindert catecholamines, xanthine oxidase activiteit en maag laesies bij ratten blootgesteld aan water-onderdompeling terughoudendheid stress

Palm vitamine E vermindert catecholamines, xanthine oxidase activiteit en maag laesies bij ratten blootgesteld aan water-onderdompeling terughoudendheid spanning
De abstracte Achtergrond Inloggen Deze studie onderzocht de effecten van Palm vitamine E (PVE) en α-tocoferol (α-TF) aanvullingen op adrenaline, noradrenaline, xanthineoxydase plus dehydrogenase (XO + XD) activiteiten en de maag laesies bij ratten blootgesteld aan water-immersie terughoudendheid stress (Wirs).
Methods
Sixty mannelijke Sprague-Dawley
ratten (200-250 g) werden willekeurig verdeeld in drie even grote groepen. De controlegroep kreeg een normaal dieet, terwijl de behandelde groepen hetzelfde dieet met orale suppletie van PVE of α-TF ingekomen bij 60 mg /kg lichaamsgewicht. Na de behandelingsperiode van 28 dagen werd elke groep verder onderverdeeld in twee groepen met 10 ratten zonder ze bloot te benadrukken en de andere 10 ratten werden onderworpen aan Wirs gedurende 3,5 uur. Bloedmonsters werden genomen om de adrenaline en noradrenaline te meten. De ratten werden vervolgens gedood waarna de maag werd uitgesneden en geopend langs de grotere kromming en onderzocht op laesies en XO + XD activiteiten.
Resultaten
de ratten blootgesteld aan Wirs hadden lesies in de maag mucosa. Onze resultaten toonden dat voeding aanvullingen van PVE en α-TF konden gastrische lesies aanzienlijk in vergelijking met de controlegroep benadrukt verminderen. Wirs verhoogde plasma adrenaline en noradrenaline aanzienlijk. PVE en α-TF behandelingen verminderde deze parameters significant vergeleken met de beklemtoonde controle.
Conclusies
Aanvullingen met ofwel PVE of α-TF verminderen de vorming van gastrische lesies. Hun beschermende effect verband met hun vermogen om door stress veroorzaakte verhoging van adrenaline en noradrenaline niveaus remmen alsmede door verlaging van xanthine oxidase dehydrogenase en activiteiten. Achtergrond
Stress beïnvloedt psychologische en fysiologische balansen die kan leiden tot verschillende pathologische veranderingen . Een bekende pathologische stress geïnduceerde toestand is de vorming van gastrische lesies en studies hebben aangetoond dat de pathogenese multifactorieel. Het omvat factoren die de gastrische mucosale integriteit verstoren zoals veranderingen in maagzuur, slijm en bicarbonaat afscheiding, remming van gastrische mucosale prostaglandinesynthese [1], vermindering van maagslijmvlies bloedstroom [2, 3] en veranderingen in stresshormonen [ ,,,0],4-6] en gastrische motiliteit [7, 8]. Het is ook bekend dat een toename van catecholamine niveau tijdens stress veroorzaakt vasoconstrictie [6]. Deze veranderingen kunnen uiteindelijk leiden tot de vorming van gastrische lesies.
Recente studies hebben ook aangetoond de betrokkenheid van oxidatieve stress in de pathogenese van stress veroorzaakte maagzweren [9, 10]. Een bepaald type oxidatiemiddel letsel reoxygenatie schade na reperfusie van ischemische weefsels [11]. Xanthine oxidoreductase bestaat uit twee in elkaar om te vormen, die xanthine dehydrogenase en zuurstof-afhankelijke xanthine oxidase zijn. In sommige studies werd aangetoond dat allopurinol verminderde gastrointestinale schade bij ratten die werden blootgesteld aan xanthine /hypoxanthine + xanthine oxidase systeem [12, 13].
Geplaatste aantal eerdere literatuur met betrekking tot de rol en het vermogen van vitamine E geweest of derivaten stress en gastrische lesies verminderen. Onze eerdere studies hadden gevonden dat zowel tocoferol en tocotriënol had de mogelijkheid om de vorming van gastrische lesies geïnduceerd door stress in ratten [7, 14] te verminderen. Hoewel tocoferol goed bekend bij de meeste beschikbare en actieve vorm van vitamine E is onlangs de rol van tocotriënolen heeft opnieuw aandacht gekregen. Deze studie werd ontworpen om de effecten van palm vitamine E dat vooral uit tocotriënolen en α-tocoferol suppletie op catecholamines en gastrische xanthine oxidase activiteit, die betrokken zijn bij stress geïnduceerde gastrische lesies bij ratten te vergelijken.
Methods
Zestig mannelijke Sprague-Dawley
ratten (200-250 g) werden verdeeld in drie even grote groepen. De eerste en tweede groep kregen palm vitamine E (PVE) of α-tocoferol (α-TF) respectievelijk in een dosis van 60 mg /kg lichaamsgewicht oraal gedurende 28 dagen, terwijl de controlegroep olijfolie werd met behulp van een 4 inch, 18 G naald, als het voertuig. Palm vitamine E in deze studie bevatte een mengsel van 22% tocoferol en tocotriënolen 78% die werd verkregen uit Maleisië palmolie Board (MPOB). Het vitamine E dosis werd gekozen op basis van onze eerdere studie, die het vermogen van deze dosis tot maaglesies optreden [6] verminderen vertoonde. Eind behandelingsperiode werd bloed onttrokken en elke groep werd opgesplitst in twee andere groepen; één groep werd onderworpen aan Wirs gedurende 3,5 uur en de andere groep werd niet onderworpen aan stress (non-spanningsgroep). De ratten voedsel onthouden nacht voordat zij werden blootgesteld aan stress.
Stress werd uitgevoerd door het plaatsen van elke rat in een plastic restrainer individueel, waarna ze hals diep ondergedompeld in een beker bij kamertemperatuur (23 ° C) 3,5 uur. Deze procedure werd uitgevoerd volgens de werkwijze van Nishida et al. (1997) [15]. Na blootstelling aan spanning, werden de ratten geanesthetiseerd door het injecteren van beide ketamine (5 mg /100 g lichaamsgewicht) en xylazine (1 mg /100 g lichaamsgewicht) voor bloed catecholamine niveau bepalen ingetrokken. De ratten werden vervolgens gedood waarna de maag werd verwijderd. Het experimentele ontwerp werd goedgekeurd door Universiti Malaysia Kebangsaan Animal Ethics Committee (UKMAEC).
Beoordeling van maaglesies
Maaglaesies werden gemeten onder 3X vergroting met behulp van licht microscopie. Laesiegrootte in mm werd bepaald door elke laesie langs de grootste diameter. Elke vijf petechiale lesies gelijk aan 1 mm laesie. De totale lengte van elke groep ratten werden gemiddeld en uitgedrukt als de laesie index. Deze werkwijze is eerder beschreven door Wong et al. [16].
Gastric xanthine oxidase en xanthine dehydrogenase activiteiten
Weefselpreparatie voor het meten van xanthine oxidase en xanthine dehydrogenase werd uitgevoerd volgens een methode eerder beschreven door Qu et al. [17]. De meting van xanthine oxidase en xanthine dehydrogenase activiteiten volgde de werkwijze beschreven door Terao et al. [18].
Plasma adrenaline en noradrenaline
Plasma adrenaline (epinefrine) en noradrenaline (norepinefrine) niveau werden gemeten met behulp Enzyme Immuno Assay (EIA) kits van IBL-Hamburg, Duitsland (Catalogus nummer 40-371-25001) .
statistische analyse
statistische analyse met behulp van SPSS statistisch pakket versie 12 (SPSS Inc. USA) werd uitgevoerd. Normale verdeling van alle variabelen werd onderzocht door Kolmogorov-Smirnov-test. De resultaten werden uitgedrukt als gemiddelden ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Statistische significantie (P < 0,05). Werd bepaald door ANOVA, gevolgd door post-hoc-test Tukey's
Resultaten
Effecten van PVE en α-TF op maaglesies
Non-benadrukte ratten toonde geen focale laesies in de maagslijmvlies. Echter, maagslijmvlies lesies ontwikkeld in ratten blootgesteld aan water onderdompeling onderdrukte stress (Wirs) gedurende 3,5 uren. Het gebied van de betrokkenheid werd beperkt tot de glandulaire gedeelte van de maag. Bij ratten blootgesteld aan stress, voorbehandelingen met ofwel palm vitamine E (PVE) of α-tocoferol (α-TF) aanzienlijk verminderd aantal maaglesies, met 52% (p = 0,001) en 40% (p = 0,001) respectievelijk (Fig 1). Macroscopische waarneming vertoonden laesies, meestal 1-2 mm groot of petechiale bloeding (figuur 2). Figuur 1 Het maaglesies aantal (in mm) van ratten die werden voorbehandeld met palm vitamine E (PVE) of α-tocoferol (α-TF) gedurende 28 dagen blootgesteld aan water onderdompeling onderdrukte stress gedurende 3,5 uur. Staven stellen gemiddelde ± sem (n = 7). een; significant verschillend van de niet-benadrukte groep (CN + NS), b; significant verschillend van de controle benadrukt (CN + Wirs) (ANOVA gevolgd door Tukeys test, p < 0,05).
Figuur 2 Microscopische waarnemingen (3x) water-immersie onderdrukte stress (Wirs) geïnduceerde gastrische lesies. A: Gastric weefsel van normale rat (geen laesies). B: Gastric weefsel van een rat blootgesteld aan 3,5 h Wirs (maagzweer ontwikkeld zoals aangegeven door de pijl). C: Gastric weefsel van een rat blootgesteld aan 3,5 h Wirs plus palm vitamine E (PVE) (Ontwikkelde petichae bloeding zoals aangegeven door de pijlen). D: Gastric weefsel van een rat blootgesteld aan 3,5 h Wirs plus α-tocoferol (α-TF) (Ontwikkelde petichial bloeding zoals aangegeven door de pijlen)
Effecten van PVE en α-TF op noradrenaline
Figuur 3. blijkt dat de blootstelling aan Wirs gedurende 3,5 uur verhoogd plasma noradrenaline niveau aanzienlijk (ongeveer 92%; p = 0,001). De plasma noradrenaline niveaus van benadrukt PVE- (ongeveer 59%, P = 0,025) en α-TF-behandelde groepen (ongeveer 70%, P = 0,022) significant verlaagd vergeleken met de controlegroep benadrukt. Er werd echter geen significant verschil waargenomen in het plasma noradrenaline niveau tussen de beklemtoonde PVE en α-TF groepen. De blootstelling aan Wirs gedurende 3,5 uur verhoogd plasma noradrenaline niveau aanzienlijk PVE- (P = 0,001) en α-TF-behandelde groepen (p = 0,001) in vergelijking met hun niet-zelfdragende groepen. Geen significant verschil (P > 0,05) in de plasma noradrenaline niveau tussen de spanningsvrije groepen waargenomen. Figuur 3 Het plasma noradrenaline niveau in ratten die werden voorbehandeld met palm vitamine E (PVE) of α-tocoferol (α-TF) gedurende 28 dagen en blootgesteld aan water-onderdompeling terughoudendheid spanning gedurende 3,5 uur. Staven stellen gemiddelde ± sem (n = 7). een; significant verschillend van de niet-benadrukte groep (CN + NS), b; significant verschillend van de controle benadrukt (CN + Wirs) (ANOVA gevolgd door Tukeys test, p < 0,05).
Effecten van PVE en α-TF op adrenaline
uitgang weergegeven in Figuur 4 toont dat immobilisatie spanning toegenomen het adrenaline niveau dat aanzienlijk vergeleken met niet-benadrukte groep (ongeveer 89%, P = 0,003). Er was een significante daling van het niveau van adrenaline gewezen PVE- (ongeveer 18,7%, P = 0,002) en α-TF-behandelde groepen (ongeveer 20%; p = 0,001) in vergelijking met de controles benadrukt. Echter geen significant verschil in het niveau tussen adrenaline benadrukt PVE- en-α-TF behandelde groepen waargenomen. Bovendien, de blootstelling aan Wirs verhoogde plasma adrenaline niveau aanzienlijk PVE- en-α-TF behandelde groepen vergeleken met hun niet-zelfdragende groepen. Geen significant verschil in de adrenaline niveaus tussen de spanningsvrije groepen waargenomen. Figuur 4 Het plasma adrenaline niveau ratten die werden voorbehandeld met palm vitamine E (PVE) of α-tocoferol (α-TF) gedurende 28 dagen blootgesteld aan water onderdompeling onderdrukte stress gedurende 3,5 uur. Staven stellen gemiddelde ± sem (n = 7). een; significant verschillend van de niet-benadrukte groep (CN + NS), b; significant verschillend van de controle benadrukt (CN + Wirs) (ANOVA gevolgd door Tukeys test, p < 0,05).
Effecten van PVE en α-TF on (XO + XD) activiteit
Figuur 5 toont de activiteiten van xanthineoxydase plus xanthine dehydrogenase (XO + XD). Het water-onderdompeling onderdrukte stress (Wirs) sterk toegenomen activiteiten van XO + XD met 76% (P = 0,003) in vergelijking met de niet-zelfdragende control. De activiteiten van XO + XD van benadrukt PVE- en α-TF behandelde groepen waren significant verminderd in vergelijking met de controle benadrukt. Er was echter geen significant verschil in het optreden van XO + XD tussen de beklemtoonde PVE- en α-TF behandelde groepen. Bovendien werden geen significante verschillen in de activiteiten van XO + XD gezien in de PVE en α-TF benadrukte groep vergeleken met hun niet-zelfdragende groep. Figuur 5 De gastric xanthineoxydase + xanthine dehydrogenase (XO + XD) activiteit in de maag van ratten die werden voorbehandeld met palm vitamine E (PVE) of α-tocoferol (α-TF) gedurende 28 dagen en blootgesteld aan water-onderdompeling terughoudendheid spanning gedurende 3,5 uur. Staven stellen gemiddelde ± sem (n = 7). een; significant verschillend van de niet-benadrukte groep (CN + NS), b; significant verschillend van de controle benadrukt (CN + Wirs) (ANOVA gevolgd door Tukeys test, p < 0,05).
Discussie
De toename van de noradrenaline en adrenaline niveaus door stress zijn goed gedocumenteerd [19-21] . Deze studie toonde aan dat blootstelling aan water onderdompeling onderdrukte stress (Wirs) gedurende 3,5 uur was voldoende om het niveau van deze catecholamines aanzienlijk te verhogen; noradrenaline met 92% en adrenaline met 89%. Deze waarnemingen ondersteunen de hypothese dat bijnier catecholaminen een fysiologische rol spelen als reactie op stressvolle situaties. Hamada et al. bleek dat ratten blootgesteld aan spanning ontwikkeld maag laesies geassocieerd met een verminderde hersenen noradrenaline inhoud en verhoogde plasma catecholamines en corticosteron niveaus [22]. Ook hadden we eerder aangetoond dat ratten blootgesteld aan herhaalde onderdrukte stress een hoger niveau van plasma noradrenaline en corticosteron vergeleken met de niet-benadrukte ratten [6].
Tijdens stress, de onderliggende mechanismen zijn activatie van de hypothalamus hypofyse-bijnier as (HPA) en sympatho-bijnier-medullaire (SAM) systemen, waardoor de release van corticosteron samen met de release van noradrenaline en adrenaline [23]. Bovendien kan de verhoging van catecholamine niveau vrije radicalen [24], die cytotoxisch zijn en weefselschade bemiddelen door verwonden celmembranen en vrijgeven van intracellulaire componenten te genereren. Er wordt algemeen aanvaard dat de pathogenese van gastrische mucosale laesies omvat van zuurstof afgeleide vrije radicalen.
In het onderhavige onderzoek werden de noradrenaline en adrenaline niveaus van gestresst PVE en α-TF groepen significant in vergelijking met de controle benadrukt verminderd. Parallel aan zijn vermogen om noradrenaline blokkeren, vitamine E ook geblokkeerd vorming van gastrische lesies bij de ratten blootgesteld aan stress. Bovendien, de noradrenaline en adrenaline niveaus in de beklemtoonde PVE- en α-TF-behandelde groepen waren niet verschillend van hun respectievelijke niet-zelfdragende groepen. Dit suggereert dat vitamine E speelt een belangrijke rol bij het verminderen van de verhoogde catecholamine niveaus geïnduceerd door stress. We hebben eerder gemeld dat de verhoging van het niveau van noradrenaline werd geblokkeerd in ratten waaraan tocotriënolen suppletie maar niet bij ratten die α-TF [6]. Deze bevindingen suggereren dat tocotriënolen zijn krachtiger dan α-TF bij het blokkeren van de effecten van stress. We vonden echter geen significant verschil tussen de beklemtoonde PVE- en α-TF behandelde groepen. Beide behandelingen waren in staat om de effecten van stress verbeteren door de niveaus van noradrenaline en adrenaline. De verschillen waargenomen kan worden veroorzaakt door de verschillende stressmodellen gebruikt; acute versus herhaalde stress. In 2007, Campese en Shaohua bleek dat ratten gevoed met een vitamine-E-verrijkte dieet manifesteerde een significante vermindering van noradrenaline afscheiding van de achterste hypothalamus [25]. Vitamine-E-verrijkte dieet beperkten de vorming van reactieve zuurstofsoorten in de hersenen en dit was geassocieerd met een verminderde sympathische zenuwstelsel activiteit en de bloeddruk bij ratten met fenol-geïnduceerde nierschade.
Lipideperoxidatie gemedieerd door vrije radicalen wordt beschouwd als een primaire mechanisme van celmembraan vernietiging [26]. Maaglesies veroorzaakt door stress, alcohol, Helicobacter pylori infectie
en niet-steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddelen is aangetoond grotendeels te worden gemedieerd door het genereren van reactieve zuurstofspecies (ROS) die lijkt een belangrijke rol spelen bij de productie lipideperoxyden [3, 14, 27, 28]. De schade in maagslijmvlies door Wirs wordt toegeschreven aan een verminderde maag microcirculatie, waardoor ischemie gevolgd door reperfusie, een proces dat vrije radicalen genereert. De bevinding geeft aan dat reactieve zuurstofspecies en lipideperoxidatie zijn belangrijk bij de pathogenese van maagslijmvlies veroorzaakt door stress [10]. Deze bevinding is consistent met de hoogte van XO activiteit na stress, die ROS geproduceerd. Eerder onderzoek had aangegeven dat de blootstelling van ratten 3,5 uur Wirs geleid tot een verhoging van de xanthine omzetting in het niveau dat vergelijkbaar is met dat voor ischemie-reperfusie model van gastrische schade [2]. Xanthine oxidase activiteit een belangrijke bron van ROS zoals superoxide anion (O 2 · -) en waterstofperoxide (H 2O 2) in de pathogenese van de ziekte bij verschillende biologische systemen waaronder gastrointestinale darmkanaal [29-31]. De toename van ROS zou dan toe de maag lipideperoxidatie en daaropvolgende gastrische laesie ontwikkeling. Dit ondersteunt de hypothese dat stress geïnduceerde schade wordt gemedieerd door lipideperoxidatie.
In de onderhavige studie, PVE en α-TF was de toename van XO + XD activiteiten significant na Wirs voorkomen. Het kan zijn dat zowel PVE en α-TF verbeterde de maagslijmvlies bloedstroom die werd aangetast tijdens Wirs [2, 32]. Verbeterde maag doorbloeding zou de omzetting van XD op XO verder te onderdrukken. Raghuvanshi et al. toonde dat toediening van 400 mg vitamine E gedurende zes dagen met 80 mg ASA uitstekende antioxidantwerking geproduceerd zoals blijkt uit een verminderde bloedplaatjes xanthine oxidase activiteit [33].
Vitamine E is een vetoplosbare antioxidant en een goed eerste geaccepteerde lijn afweermechanisme tegen lipideperoxidatie. Het fungeert als een keten vrijkomen antioxidant voor lipide peroxidatie in celmembranen en als een binder van ROS zoals superoxide anion, waterstofperoxide en singlet zuurstof [34]. Yoshikawa c.s.. rapporteerde een daling maagslijmvlies vitamine E niveau en een toename maagslijmvlies lipideperoxidatie in ischemie-reperfusie geïnduceerde beschadiging van het maagslijmvlies en de ernst van het letsel werd versterkt door vitamine E-deficiënte ratten [35]. Naito et al. was binnen stikstofoxide uitgeputte ratten, vitamine E een belangrijke beschermende rol tegen ischemie-reperfusie geïnduceerde maagslijmvlies gespeeld, en suggereerde dat dit gastroprotectieve effect van vitamine E was niet alleen vanwege de antioxiderende werking maar ook de remmende werking op neutrofiele infiltratie in het maagslijmvlies [36]. Al-Tuwaijri en Al-Dhohyan gemeld dat een enkele orale toediening van pre-α-tocoferolacetaat aan ratten voorkomen ischemie-reperfusie-geïnduceerde maagslijmvlies [37].
Zoals eerder vermeld, kan stress maag bloedstroom en veroorzaken beïnvloeden ischemische-achtige omstandigheden. Deze omstandigheden kunnen leiden tot reperfusie-geïnduceerd letsel en tenslotte ontwikkeling van gastrische lesies. Tijdens ischemie-reperfusie werd lipideperoxidatie verhoogd door de productie van ROS; aanvullingen PVE en α-TF konden deze stijging verminderen. Geconcludeerd kan worden dat de PVE en α-TF hebben gastrobeschermende effecten tegen Wirs, eventueel via hun antioxiderende eigenschappen. Zoals getoond in deze studie, de dieren blootgesteld aan Wirs 3,5 uur ontwikkelde gastrische mucosale laesies, waardoor de reproduceerbaarheid van dit model voor de studie bevestigt. Aanvullingen van PVE en α-TF bij 60 mg /kg gedurende 28 dagen voorafgaand aan blootstelling aan spanning verminderde de maagslijmvlies. Echter geen verschil tussen deze twee middelen werd waargenomen, waaruit blijkt even effectief in het voorkomen van stress-geïnduceerde gastrische schade.
Evenzo heeft blootstelling aan Wirs aangetoond dat de incidentie van gastrische mucosale laesie verhogen en de toename verlaagd door toediening van verschillende antioxidantia [1, 38]. Een studie door Ohta et al. hadden aangetoond dat Wirs gedurende 6 uur gereduceerd maag α-tocopherol concentratie maar vóór toediening van ascorbinezuur deze vermindering gedeeltelijk teruggedraaid. In deze studie, kan het voorkomen van de schadelijke effecten van stress op het maagslijmvlies worden gemedieerd door de antioxidant activiteit bezit van PVE en α-TF, die de vorming van vrije radicalen direct of indirect te verminderen, wat leidt tot verzwakking van laesievorming .
De beschermende mechanisme van vitamine E en haar rol op de menselijke gezondheid is nog steeds niet goed begrepen. De antioxidant eigenschap van vitamine E, met name het effect op meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA) kan celmembraanintegriteit verbeteren. Er de mogelijkheid dat de gastrische weefsels worden resistenter voor de agressieve factoren zoals zuur en pepsine.
Conclusies
Onze gegevens suggereren dat het beschermende effect van vitamine E had met een verminderde xanthine oxidase dehydrogenase en activiteiten, waardoor een vermindering van de vorming van vrije radicalen. Er is ook een mogelijkheid dat het vermogen van zowel PVE en α-tocoferol in het blokkeren van de door stress veroorzaakte schade is veroorzaakt door zijn werking op een hoger niveau die blokkeert de toegenomen adrenaline en noradrenaline, bekende mediatoren van stress.
Notes
Ibrahim AbdelAziz Ibrahim, Yusof Kamisah en Nafeeza Mohd Ismail eveneens bijgedragen aan dit werk.
verklaringen
Dankwoord
De studie werd gefinancierd door een subsidie ​​van Maleisische ministerie van Wetenschap, Technologie en Innovatie (KIK Grant No . 06-02-02-10026 EAR). De auteurs willen bedanken Pn Azizah Othman en de heer Muhamad Arizi Aziz voor de technische ondersteuning.
Authors 'originele ingediende dossiers voor afbeeldingen
Hieronder staan ​​de links naar de auteurs oorspronkelijke ingediende dossiers voor afbeeldingen. 'Originele bestand voor figuur 1 12876_2011_737_MOESM2_ESM.pdf Authors' 12876_2011_737_MOESM1_ESM.pdf Auteurs originele bestand voor figuur 2 12876_2011_737_MOESM3_ESM.pdf Authors 'originele bestand voor figuur 3 12876_2011_737_MOESM4_ESM.pdf Authors' originele bestand voor figuur 4 originele bestand 12876_2011_737_MOESM5_ESM.pdf Authors 'voor figuur 5 tegenstrijdige belangen Ondernemingen De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen.

Other Languages