Metallothioneine 2A remt NF-KB-route activering en voorspelt klinische uitkomst gescheiden met TNM stadium bij maagkanker patiënten na radicale resection

metallothioneïne 2A remt NF-KB-route activering en voorspelt klinische uitkomst gescheiden met TNM stadium bij maagkanker patiënten na radicale resectie
Abstract achtergrond
Metallothioneine 2A (MT2A) als een stress-eiwit, speelt een beschermende rol in het maagslijmvlies barrière. Zijn rol in de ontwikkeling van maagkanker (GC) is onduidelijk. Het mechanisme van MT2A zal worden onderzocht in de maag het ontstaan ​​van tumoren.
Methods
MT2A expressie werd in 973 maag specimens gedetecteerd. De biologische functie werd bepaald door middel van een buitenbaarmoederlijke uitdrukken MT2A in vitro en in vivo

. De mogelijke effectoren van MT2A onderzocht NF-kB signaling. De eiwitniveaus van MT2A, IKB-α en p-IKB-α (ser32 /36) expressie werd geanalyseerd in een subset van 258 patiënten IHC kleuring. De prognostische effecten van MT2A, status van de IKB-α en TNM stadium werden geëvalueerd met behulp van de Kaplan-Meier-methode en vergeleken met behulp van de log-rank test.
Resultaten
Verminderde MT2A expressie werd gedetecteerd in cellijnen en primaire tumoren van GC. In klinische gegevens, verlies van MT2A (MT2A + in Normal (n = 171, 76,0%); Intestinale metaplasie (n = 118, 50,8%), GC (n = 684. 22,4%, P Restaurant < 0,001)) werd in verband gebracht met een slechte prognose (P Restaurant < 0,001), geavanceerde TNM stadium (P
= 0,05), en down-regulatie van IKB-α expressie (P Restaurant < 0,001). Bovendien MT2A was de onafhankelijke prognostische handtekening gescheiden van de status van de IKB-α en pathologische kenmerken. Bovendien MT2A remde celgroei met apoptose en G2 /M arrestatie, die negatief gereguleerd NF-kB route door up-regulatie van IKB-α en down-regulatie van p-IKB-α en cycline D1 expressie.
Conclusies
MT2A kan een tumor onderdrukkende activiteit te spelen door middel van het remmen van NF-KB signalering en kan een prognostische biomarker en potentieel doelwit voor individuele therapie van GC patiënten.
Sleutelwoorden
Metallothioneine 2A NF-KB signalering Maagkanker Prognose TNM stadium Achtergrond
Wat is nieuw
Overvloed van Metallothioneine 2A (MT2A) tentoonstellingen in het maagslijmvlies barrière, maar zijn rol in de progressie van maagkanker (GC) is nog onduidelijk. In deze analyse van 171 normale gastrische weefsels, intestinale metaplasie 118 en 684 primair maagkankers, verminderde MT2A was significant gecorreleerd met een slechte prognose. Remde de proliferatie van GC cellen door NF-kB signaling inactivatie. Deze resultaten geven aan dat MT2A een belangrijke prognostische merker en therapeutisch doel voor GC kan zijn.
Maagkanker (GC) is de meest gediagnosticeerde maligniteit en blijven een zware last van kanker in Azië, vooral in China [1, 2]. De meeste GC patiënten die een chirurgische ingreep zijn al in een vergevorderd stadium en de 5-jaars overleving is gevarieerd. Verscheidene histologische factoren gerapporteerd prognostische factoren van GC, zoals tumorgrootte, WHO classificatie tumor-knoop-metastase (TNM) stadiumsysteem en differentiatie kwaliteit zijn [3, 4]. Echter, prognose GC patiënten in dezelfde fase nog inconsistent [5]. Daarom is de identificatie van specifieke diagnostische merkers en therapeutische doelwit zou betrouwbare voorspelling effectieve verlenging van postoperatieve overleving en levenskwaliteit van patiënten [6].
Cellulaire stress is aangetoond dat het een rol speelt in de regulatie van moleculaire carcinogenese [7 toe, 8]. Metallothioneïnen (MT) als stresseiwitten met laag molecuulgewicht en rijke cysteine ​​de mogelijkheid van een hoge affiniteit voor metaalionen en ROS scavengers. MT2A als de belangrijkste isovorm van MT speelt een belangrijke rol in maagslijmvlies barrière in patiënten met gastro knaagdiermodellen [9, 10]. Pre-toediening van exogene MT2A of pre-inductie van endogeen MT2A kan maag en de lever tegen stress geïnduceerde schade en remmen de vorming van stress-geïnduceerde lipide peroxide, wat een beschermend effect van MT2A op stress geïnduceerde pathogenese en een potentieel therapeutisch doelwit aangevraagde vroegtijdig voorkomen [11] - [13]. Onlangs MT2A speelt een belangrijke rol bij het ontstaan ​​van tumoren en progressie van verschillende carcinomen waaronder GC [14]. De muizen verloren MT2A gen aanleg voor diethylnitrosamine geïnduceerde hepatocarcinogenesis door activering van NF-KB doelgenen, hetgeen aantoont dat MT2A beschermt muizen uit hepatocarcinogen-geïnduceerde leverschade en carcinogenese, het benadrukken van de mogelijke therapeutische toepassing tegen hepatocellulaire kanker [15]. Sommige studies gericht op de rol van MT2A bij de bescherming tegen H. pylori
geïnduceerde gastrische schade aan de hand MT-null muizen. Himeno, S. ontdekt dat activatie van NF-KB en de expressie van NF-kB gemedieerde chemokinen gastrische cellen aanmerkelijk hoger in MT2A-null muizen dan in wide-type muizen [9]. Deze data impliceren dat MT2A realiseert negatieve controle van de transcriptiefactor NF-KB-activiteit, maar de rol in maagkanker is nog onduidelijk [16] -. [18]
afwijkende activering van NF-KB wordt geassocieerd met mobiele ontsteking, maligniteit en tumorprogressie [7, 19]. De functionele activiteit van NF-kB wordt geremd door binding aan zijn inhibitor IKB-α. Activatie van NF-KB is het gevolg van proteasoom-gemedieerde afbraak van IKB-α door fosforylering van de remmer (p-IKB-α), hetgeen suggereert dat NF-kB route is een potentieel doelwit voor individuele therapie [20] - [23] .
Sommige aangegeven bewijs dat MT2A expressie verhoogd is van belang voor de progressie van kanker, en MT2A wordt aanvankelijk voorgesteld als een proto-oncogen in borst-, slokdarm, prostaat- en eierstokkanker, in verband met kanker en een slechte prognose [24] - [27 ]. Daarentegen wordt downgereguleerd in gastrointestinale tumoren en hepatocellulaire carcinomen, waarbij MT2A ofwel omgekeerd gecorreleerd of los van mortaliteit [28, 29]. De variatie van MT2A en de klinische evaluatie blijft tegenstrijdig GC [28, 30, 31]. Deze resultaten suggereren dat ontregeling van MT2A is betrokken bij tumor pathogenese, hoewel de precieze rol is nog onduidelijk GC.
Dus we ons op de co-expressie van MT2A en IKB-α gen gecorreleerd met klinische pathologische kenmerken en resultaten onthullen in een grote schaal van maag tumoren met follow-up data op lange termijn. Verder analyseerden we systematisch de rol van MT2A als een stress-eiwit en negatieve regulator in NF-KB-activering om de biologische rol en moleculair mechanisme te karakteriseren in vitro en in vivo

.
Methods
Patiëntenkenmerken
Gastric tumor monsters van 684 GC patiënten behandeld in Peking kanker ziekenhuis 1997-2007 werden beoordeeld. De patiënten die 513 mannen (75,0%) en 171 vrouwen (25,0%) met een gemiddelde leeftijd bij diagnose van 54 jaar (range, 19-81 jaar). De follow-up periode varieerde 1-127,2 maanden (mediaan 34,2 maanden). Alle patiënten ondergingen radicale resectie met curatieve intentie. Geen van de patiënten had neoadjuvante chemotherapie of bestraling kregen voorafgaande aan operatie. De inclusiecriteria van de patiënten: (a) een onderscheidend GC diagnose gebaseerd op de zesde editie van de tumor-knoop-metastase (TNM) classificatie van de International Union tegen GC, (b) een radicale resectie, (c) geschikt formaline gefixeerd, in paraffine ingebedde weefsels. Het totaal van 684 GC had de klinisch-pathologische gegevens (aangeduid als 'cohort'). Bovendien is een set van 258 in aanmerking komende monsters werden verzameld uit de cohort met 10-jaar follow-up data (aangeduid als "deel"). De klinische uitkomst van de patiënten werd opgenomen vanaf de datum van de operatie aan de datum van overlijden. Bovendien, 118 intestinale metaplasie (IM) en 171 normale gastrische weefsels werden verzameld van deze AV patiënten. Histologisch onderzoek werd uitgevoerd door drie senior pathologen. De demografische verdeling van het cohort en subgroep wordt in aanvullende tabel 1. Daarnaast 36 gekoppeld maag tumoren aangrenzend normaal weefsel werd gemalen tot een poeder onder vloeibare stikstof voor RT-PCR en real-time PCR van MT isovormen (Extra file1). tabel 1 logistische regressie-analyse van klinische en pathologische kenmerken en de prognose in GC
variates
No. van de gevallen (n = 258)
Survival tijd (maand)
P
-waarde
Sex
Man
186
66,4 ± 4,6
Female
72
54,1 ± 4,8
0,604
Leeftijd bij diagnose Restaurant < 60
173
65,0 ± 4,9
≥60
85
59,2 ± 5,6
0,867
TNM stadium
I
34
105,5 ± 7,7
I vs. IV Restaurant < 0.001
II
57
74,0 ± 5,9
II vs. IV Restaurant < 0.001
III
115
49,1 ± 3,4
III vs. IV
0.010
IV
52
35,8 ± 4,1
Tumor diepte
pT1
13
87,2 ± 9,9
pT1 vs. pT4
0.005
pT2
50
89,1 ± 9,1
pT2 vs. pT4 Restaurant < 0.001
pT3
157
49,1 ± 2,9
pT3 vs. pT4
0,159
pT4
38
40,1 ± 5,3
lymfklierstatus
pN0
78
89,8 ± 6,2
pN0 vs. pN3
0.001
pN1
115
50,5 ± 3,4
pN1 vs. pN3
0,212
pN2
49
46,6 ± 6,0
pN2 vs. pN3
0,326
pN3
16
47,5 ± 12,6
Distant metastase
pM0
232
67,5 ± 4,3
PM1
26
27,6 ± 5,8 Restaurant < 0.001
Mate van differentiatie
D1
54
76,0 ± 6,0
D0
204
59,8 ± 4,4
0,011
MT2A uitdrukking Restaurant < 0.001
laag
202
53,9 ± 3,4
hoge
56
86,9 ± 9,2
IKB-α expressie
laag
164
61,6 ± 4,9
hoge
94
64,9 ± 5,1
0,248
p-IKB-α expressie
laag
126
74,1 ± 5,3
hoge
132
47,7 ± 3,4
0.005
M0: geen metastasen op afstand; M1: metastasen op afstand;
D1: goed /matig gedifferentieerde GC; D0: slecht gedifferentieerde GC
Immunohistochemische analyse
IHC kleuring in weefselarray werd uitgevoerd met MT2A antilichamen. (1: 100 verdunning; 18-0133, Invitrogen, CA, VS), p-IKB-α antilichaam (1 : 200 verdunning; ab47752, Abcam, Cambridge, UK), IKB-α antilichaam (1: 300 verdunning; sc-371, Santa Cruz Biotechnology, CA). Voor elke biomarker, werden beelden visueel gescoord door drie pathologen die waren blind voor de klinische uitkomst. Verschillen werden opgelost door consensus. Scores werden toegekend als percentage positieve kleuring in elke cilinder. Het gemiddelde percentage van de twee kernen werd berekend op een tumor (Extra file1) vertegenwoordigen.
Cellijnen
Maagkanker cellijnen BGC823, MGC803, SGC7901 en PAMC82 werden opgericht in China en gekocht van de weefselbank van Shanghai (Shanghai, China). Vooral BGC823 cellen vertoonden hoge tumorigenecity. MKN45, AGS, N87, RF-1, RF-48, SNU-1, SNU-5 en SNU-16 cellijnen werden verkregen van ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, US). GES-1, een geïmmortaliseerde humane gastrische epitheel cellijn werd gegenereerd door SV40 virale transfectie in Peking kanker ziekenhuis en gekweekt in DMEM medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO 2 [32].
MTT en zachte agar assay
de cellen werden uitgezaaid in 96-putjes en MTT aan de cellen toegevoegd bij 1-5 dagen. MTT (5 ug /ml) werd na 4 uur incubatie, en dimethylsulfoxide (DMSO) werd toegevoegd aan het formazanproduct te solubiliseren. De absorptie bij 490 nm /570 nm werd bepaald met een microplaat lezer (Bio-rad680 ELISA). Cellen werden vervolgens gedurende 4 weken, gekleurd met vitale tetrazolium kleurstof INT (piodonitrotetrazolium, Invitrogen) om de aanwezigheid of afwezigheid van levensvatbare celkolonies documenteren. De zachte agar werd gefixeerd met 100 ul methanol-azijnzuur. (3: 1 vol /vol) en kolonies werden geteld
tumorigeniciteit assay
BGC823 cellen (5 x 10 5 cellen gesuspendeerd in 0,1 ml PBS) getransfecteerd met MT2A overexpressie vector of lege vector subcutaan geïnjecteerd in de dorsale flank van vijf 4-weken oude vrouwelijke Balb /C naakt muizen (MT2A-expressieklonen rechts en vectorcontrole klonen links. tumordiameter werd gemeten en gedocumenteerd elke 5 dagen tumorvolume werd berekend volgens de formule ab 2/2 (a > b)... aan het einde van 25 dagen, werden alle muizen opgeofferd en het tumorvolume werd gemeten Drie onafhankelijke experimenten uitgevoerd en de overeenkomstige resultaten gaf. de dieren werden in voorzieningen die door de vereniging voor de beoordeling en accreditatie van Laboratory Animal Care in overeenstemming met de huidige regelgeving en internationale normen goedgekeurd gehandhaafd.
Statistische analyse
χ
2 teststatistieken en Student's t
-test werden gebruikt om voorbehandeling kenmerken van de patiënt gevallen te vergelijken. De kanker-gerelateerde overleving werd geanalyseerd met behulp van de Kaplan-Meier-methode en vergeleken met behulp van log-rank test. De Spearman rank test en Fisher's exact test werden toegepast op klinisch-pathologische correlaties aan te tonen. Een Cox regressiemodel werd gebruikt met de bijbehorende 95% betrouwbaarheidsintervallen (CI's) en P
waarden. Alle statistische toetsen waren tweezijdig en P
waarden kleiner dan 0,05 werden als statistisch significant. De statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van het statistisch pakket SPSS (versie 16.0, SPSS Inc, Chicago, IL).
Studie goedkeuring
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Peking kanker ziekenhuis. Het gebruik van menselijke weefsels en klinische gegevens werden volgens de richtlijnen van het ziekenhuis en door de lokale ethische commissie goedgekeurd.
Resultaten
Verminderde MT2A meningsuiting is een moleculaire evenement in cellijnen en primaire tumoren van GC
Expression van MT2A werd geëvalueerd door RT-PCR en Western blot in een panel van GC cellijnen en GES1, die diende als "normale controle". Zoals getoond in figuur 1A, MT2A mRNA gevarieerd hoofdzaak met de hoogste niveaus in GES1. Gebrek of afname van MT2A expressie werd waargenomen in BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, SNU-1, SNU-5, SNU-16, RF-1, RF-48 en N87 cellen. Het eiwitgehalte van MT2A expressie werd verder gedetecteerd in de zes gemeenschappelijke gebruikte GC cellijnen (BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, N87, en MKN45) in vergelijking met GES1. Western blot analyse toonde aan dat, in de zes gebruikelijke GC cellijnen, de niveaus van expressie MT2A afwezig of laag in vergelijking met GES1, in overeenstemming met mRNA expressie hierboven gedetecteerd (Figuur 1B). Vooral BGC823, MGC803 en SGC7901 cellen met een gebrek aan MT2A expressie vertonen een hoge tumorigenecity in naakt muizen. Figuur 1 afwezig of verlaagde expressie van MT2A wordt gedetecteerd in cellijnen en primaire tumoren van GC. A, MT2A mRNA werd gemeten met RT-PCR in GC cellijnen en normale onsterfelijke cellijn-GES1. En semi-kwantitatieve analyses werden uitgevoerd met ImageTool 3,0 grijsschaal scansoftware (genormaliseerd voor ß-actine niveaus). Het experiment werd in drievoud uitgevoerd. B, werd MT2A eiwitgehalte bepaald door Western-blotanalyse in GC cellijnen en de normale onsterfelijke cellijn-GES1. De MT2A eiwitbanden werden gescand (genormaliseerd aan P-actine levels). C, de differentiële expressie van MT2A mRNA-transcript in 36 gekoppelde GC weefsels en aangrenzende normale weefsels. De MT2A mRNA banden werden gescand (genormaliseerd aan P-actine levels). D, MT2A eiwitniveaus werden gedetecteerd in de 36 gekoppelde GC weefsels door Western blotting. De MT2A eiwitbanden werden gescand (genormaliseerd aan P-actine levels). E, verminderde MT2A werd waargenomen tijdens de maag kwaadaardige transformatie. (A) intense kleuring van MT2A in normale weefsels, (b) gemiddeld kleuring van MT2A in IM weefsels, (c) zwakke kleuring van MT2A in matig gedifferentieerde primaire maagkanker en (d) negatieve expressie van MT2A in slecht gedifferentieerde GCs (oorspronkelijke vergroting × 400). (D) In ​​vergelijking met de normale en precancereuze letsels-IM monsters, verminderde MT2A was een gemeenschappelijke moleculaire gebeurtenis in de maag carcinogenese (P Restaurant < 0,001) F: Verschillende expressie van MT2A in GC, IM en normale weefsels door IHC kleuring. Negatief: score 0; Zwakke: score 1-4; Sterk: scoren 5-12. Voor meer informatie, zie het aanvullend file1.
36 primaire tumoren van GC met aangrenzende normale weefsels werden ook onderzocht in figuur 1C en D, de resultaten zijn afgeleid van GC cellijnen te bevestigen, daalde MT2A mRNA werd in GC getoond in vergelijking met die in geëvenaard normale controles (27/36, 75,0%, P Restaurant < 0,001, figuur 1C). Lage expressie van MT2A eiwit werd gedetecteerd in 29 van de 36 GC gevallen (80,6%) in vergelijking met de aangepaste normale weefsels (P Restaurant < 0,001, figuur 1D). Het mRNA niveau van MT2A was gecorreleerd aan het eiwit niveau gedetecteerd door Western blot (R = 0.510, P
= 0,009). Bij mensen worden de MT gecodeerd door een familie van genen bestaande uit 10 functionele isovormen MT en de gecodeerde eiwitten worden gewoonlijk onderverdeeld in vier groepen, MT1, MT2, MT3 en MT4 eiwitten. Aangezien de coderende gebieden van MT isovormen zijn sterk geconserveerd in transcript en eiwit niveaus, MT2A is zeer homoloog met MT1G, MT1E en MT1F (Extra file 1: Figuur S1B). Daarom moet experimenten Elk individu isovorm zorgvuldig worden uitgevoerd om te waarborgen dat de juiste isovorm wordt geanalyseerd. In deze studie differentiële expressie van MT1 transcripten waargenomen in GC cellijnen en primaire tumoren van GC met aangrenzende gezonde controles (n = 36) (aanvullende bestandsinformatie 1: Figuren S1A en S2). We geverifieerd werkelijke MT2A gen down-regulatie in GC aanzienlijk in vergelijking met aangrenzende normale weefsels (27/36, 75%, figuur 1C). Er was geen verschil van MT1E en MT1F en MT1G mRNA-transcripten in normale en tumormonsters evenals MT1B mRNA transcript was niet detecteerbaar in alle cellen en weefsels (Extra file 1: De cijfers S1A en S2). Belgique Om de kandidatuur van onderzoeken MT2A in de maag ontstaan ​​van tumoren, we in eerste instantie de status van MT2A expressie gekenmerkt 171 normale weefsels, 118 IM en GC 684 monsters door IHC kleuring. Het antilichaam voor MT2A (E9 18-0133, Invitrogen) is niet specifiek voor MT-2A alleen en kruisreageert met MT-1 enigszins, ook al wordt gekloneerd door de volledige lengte van MT2A. Aangezien er geen specifiek antilichaam tegen MT2A detecteren, zodat we gebruik maken van de gemeenschappelijke handelspolitiek antilichaam voor IHC kleuring die in de meeste gerelateerde studies werd gepubliceerd, wordt MT2A uitdrukking geclassificeerd als hoge en lage expressie in normale verschijning weefsels, IM, en primaire GC. Hoog MT2A expressie werd gedetecteerd in 153 van 684 (22,4%) GC gevallen en 60 van 118 (50,8%) IM gevallen en 130 van 171 (76,0%) normaal ontstaan ​​gevallen respectievelijk (Extra file1: Tabel S3 , P Restaurant < 0,001), het werd bestond met MT2A mRNA-transcripten en eiwit expressie door Western blot. De expressie van MT2A werd geclassificeerd als negatief, zwak en sterk gevallen in 13 (7,6%), 28 (16,4%) en 130 (76,0%) van de 171 normale weefsels, respectievelijk; In IM weefsels, 27 (22,9%), 31 (26,3%) en 60 (50,8%) van de 118 IM gevallen werden respectievelijk opgespoord; In GC samples, 494 (72,2%), 37 (5,4%) en 153 (22,4%) van de 684 GC gevallen werden respectievelijk gedetecteerd (Figuur 1F, Extra file1). Er was een geleidelijk verminderde expressie van MT2A eiwit in IM en GC (P Restaurant < 0,001, figuur 1E en F). Het is duidelijk dat MT2A mRNA sterk tot expressie werd gebracht in GES1 cellen en normale weefsels, maar was verlaagd of verloren GC meeste cellen en weefsels. Deze resultaten suggereren dat verminderde MT2A een moleculaire gebeurtenis in tumorigenese en progressie.
MT2A expressie is gecorreleerd met een slechte prognose bij GC
MT2A was vaak neerwaarts gereguleerd in GC. Om te onderzoeken of MT2A expressie was een prognostische factor in de menselijke GC, werd MT2A eiwitexpressie in de subset van IHC kleuring onderzocht. De individuele monsters werden gecategoriseerd als laag (MT2A-) of hoge expressie (MT2A +). MT2A- werd geassocieerd met een slechte algehele overleving (Figuur 2A, P Restaurant < 0,001). Univariate analyse gaf aan dat een aantal factoren, waaronder daalde MT2A expressie (P Restaurant < 0,001), TNM stadium (P Restaurant < 0,01), tumor diepte (P Restaurant < 0,05), lymfeklierstatus (P
< 0,05), metastasen op afstand (P Restaurant < 0,001) en de mate van differentiatie (P
= 0,011) werden gecorreleerd met een slechte overleving (tabel 1). Cox multivariate analyse toonde aan dat de totale overleving werd geassocieerd met MT2A expressie (MT2A + versus MT2A- hazard ratio [HR], 0,429; 95% CI, 0,187-0,683; P
= 0,002, tabel 2). We schatten de mogelijke klinische betekenis van MT2A door het correleren van de expressie patroon met de klinische parameters (Extra file1: Tabel S4). MT2A vertoonde een uitgebreide positieve correlatie met tumor differentiatie (P Restaurant < 0,001) en inverse correlatie met TNM stadium (P
= 0,05). Deze resultaten geven aan dat MT2A gecorreleerd met klinische pathologische kenmerken en overleving bij patiënten GC. Figuur 2 Analyse van de combinatie MT2A met TNM stadium om de klinische uitkomst te voorspellen in GC. Kaplan-Meier-analyse van de totale overleving MT2A expressie gebruikt volgens de TNM stadium. A, prognostische waarde van MT2A meningsuiting in GC patiënten was voordeel voor het voorspellen van de uitkomst van patiënten met lage expressie van MT2A werd geassocieerd met een slechte algehele overleving (P <
0,01); B, TNM etappe was voordeel voor de prognostische voorspelling in GC patiënten. C D, prognostische waarde van MT2A in TNM stadium I-II en fase III-IV (P
= 0,048, P <
0,001, respectievelijk); E F, prognostische waarde van MT2A meningsuiting in lymfklier metastase of niet (P Restaurant < 0,001, P
= 0,052, respectievelijk); G. prognostische waarde van MT2A meningsuiting in geen verre metastase subgroep (n = 232, P Restaurant < 0,001); H. prognostische waarde van MT2A in pT3-pT4 subgroep (P Restaurant < 0,001). Alle gegevens impliceren dat MT2A een effectieve prognostische handtekening zou kunnen zijn.
Tabel 2 Cox regressie-analyse van klinische en pathologische kenmerken en moleculaire handtekeningen in GC
Multivariate analyse
Covariate door eindpunt

Hazard ratio
95% CI
P-
waarde
Leeftijd ≥ 60 jaar
1.300
0,840-1,934
0,254
Sex
0,823
0,499-1,233
0,292
Differentiatie
0,753
0,509-1,778
0,875
Tumor invasieve diepte
1,914
1.389 tot 2,638
< 0.001
lymfeklierstatus
1.291
1,034-1,612
0,024
Distant metastase
2,595
1,332-5,056
0,005
MT2A
0,429
0,187-0,683
0.002
IKB-α
0,779
0,524-1,311
0,423
p-IKB-α
1.857
1,256-2,912
0,003
prognostische betekenis van MT2A gecombineerd met TNM etappe in GC patiënten Belgique Om MT2A meningsuiting verder te ontrafelen in prognostische betekenis, gecombineerd we MT2A expressie met de klinische en functies in GC. Het doel was om de prognose van patiënten met GC pathologische classificatie te evalueren en te onderzoeken of pathologische indeling moet verdere sub-geclassificeerd voor meer nauwkeurige voorspelling van het resultaat. Zoals getoond in aanvullende file1: Tabel S4, MT2A expressie in GC geassocieerd met TNM en tumordifferentiatie, impliceert dat MT2A een potentiële biomarker moleculaire pathologische classificatie voorspellen GC kan zijn. Zoals dichotomische covariaten zowel MT2A en TNM onafhankelijke voorspellers voor overleving (tabel 2, figuur 2A en B). Prognostische significantie van MT2A expressie werd verder geanalyseerd met GC patiënten volgens de pTNM classificatiesysteem. Er was een significant verschil in totale overleving tussen patiënten met MT2A expressie in zowel vroeg (I en II) en geavanceerde (III en IV) het podium groepen (P
= 0,048 en P Restaurant < 0,001, respectievelijk figuur 2C en D). Bovendien, de status MT2A expressie was ook effectief voor de prognose in hetzelfde stadium (P = 0,052
, figuur 2E; P Restaurant < 0,001, figuur 2F; P Restaurant < 0,001, figuur 2G en P
< 0,001, figuur 2H). Deze gegevens vertegenwoordigen dat MT2A is een moleculaire handtekening om de klinische uitkomst te voorspellen op basis van TNM stadium.
Restauratie van MT2A expressie resulteert in de groei onderdrukking van GC cellen in vitro en in vivo

Om het mechanisme te onthullen van MT2A in GC, we stabiel getransfecteerde MT2A overexpressie plasmide en lege vector in drie GC cellijnen (BGC823, SGC7901 en AGS). We hebben gekeken naar de groei, apoptose tarieven en celcyclus van deze cellijnen getransfecteerd met MT2A plasmide. Cel levensvatbaarheid werd gereduceerd in GC cellen opnieuw tot expressie MT2A met behulp van MTT-test (BGC823, P
= 0,0038, Figuur 3B, AGS, P
= 0,0007, Extra file1: Figuur S3A; SGC7901, p = 0,0004
, Extra file1: Figuur S3C). Om de functie van MT2A GC cellijnen verder te onderzoeken, analyseerden we het effect van MT2A expressie op celproliferatie en celcyclus door Annexine V /PI kleuring en flowcytometrie analyse. Meer apoptose werd gedetecteerd in deze AV cellen opnieuw tot expressie MT2A (P
< 0,01 respectievelijk figuur 3F; Aanvullende file1: Figuur S3A en C). Voorts werd G2 /M arrestatie waargenomen in GC cellen met behulp ectopische expressie van MT2A. De verhoudingen van de G2 /M fase MT2A groepen tweemaal hoger dan die in de vector groepen hebben (P
< 0,01 respectievelijk figuur 3E en bijkomende file1: Figuur S3B en D). Figuur 3 Ectopische expressie van GC MT2A remt celgroei in vitro en in vivo. MT2A remden celproliferatie en kolonievorming in humane cellen GC. A, Western blot van MT2A werd gedetecteerd in cellen die met BGC823 ectopische expressie van MT2A plasmide en lege vector. De MT2A eiwitbanden werden gescand (genormaliseerd voor ß-actine te controleren voor lading). B, Celproliferatie werd geanalyseerd met de MTT assay re expressie van MT2A BGC823 cellen of niet. De gegevens werden weergegeven als het gemiddelde ± .SD van drie onafhankelijke experimenten. C, groei van BGC823 cellen werd geanalyseerd in een halfvast medium zachte agar. De lege vector kolonies gevormd statistisch significant meer kolonies (gemiddelde = 426 grote kolonies per plaat 95% CI:. 387-472 kolonies) dan MT2A klonen (gemiddelde = 136 kolonies 95% CI:.. 100-164 kolonies De getallen geven het gemiddelde aantal kolonies van drie onafhankelijke experimenten ± SD Het relatieve aantal werd berekend in controle en BGC823-MT2A cellen en geanalyseerd met behulp van Student's t
-test (P
= 0,0038). D, MT2A geremde tumorigeniciteit van BGC823 cellen . in naakt muizen Het gemiddelde tumorvolume voor BGC823-MT2A 3 weken na de injectie was 112 mm3 (95% CI: 93-147 mm3), in vergelijking met 352 mm3 (95% CI: 298-423 mm3) voor BGC823-Vector. gegevens stellen het gemiddelde ± SD van tumorvolume verkregen uit elke groep. In elke groep werden tumorgrootten gemeten met een schuifmaat op de aangegeven tijdstippen. de gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD (t- Electronics Test detectie, P
= 0,0027) E, FACS analyse toonde dat MT2A overexpressie tot G2 /M arrestatie, en de verhouding van G2 /M-fase hoger dan in lege controle en oudercellen (P <
0,01). F, antitumoreffect van MT2A werd gedetecteerd door annexine V /PI kleuring FITC-assay. Percentage apoptotische cellen was 52,9% ± 5,4% in MT2A groep vergeleken met die in de ouder-cellen (8,3% ± 2,4% en cellen getransfecteerd met de lege vector (8,2% ± 3,7%, P
. ≪ 0,001)
Verder hebben we uitgeplaat BGC823 cellen onderdrukken MT2A of niet in zachte agar werd ectopische expressie van MT2A bevestigd door Western blot analyse eerst (Figuur 3A). Na 3 weken kweken MT2A expressie veroorzaakte een statistisch significante vermindering van kolonievorming (P
= 0,0053, figuur 3C). Bovendien was er een dramatische groeiremming van MT2A opnieuw tot expressie brengende cellen in vergelijking met de negatieve controle (p = 0,0027
figuur 3D) in xenograft modellen. Deze gegevens tonen aan dat MT2A kan een rol spelen bij het onderdrukken van de proliferatie van cellen in vitro GC Kopen en in vivo
.
MT2A onderdrukt NF-KB-activiteit met IKB-α opwaartse regulatie
Er werd gemeld dat het verlies van MT2A geïnduceerde NF-KB signaal activering in transgene muizen model (MT2A-knock-out) [15]. Maar de rol van MT2A als vriend of vijand NF-kB signaalroute nog controversieel [18, 33]. Om het mechanisme van MT2A GC gemedieerde celgroei onderdrukt in vivo Kopen en in vitro
interpreteren we geprobeerd om de mogelijke relatie tussen MT2A en NF-kB signaling pathway onderzoeken en het inwendige mechanisme nog onduidelijk GC . MT2A en de belangrijkste genen in NF-KB-signalering, zoals p65, IKB-α, p-IKB-α en stroomafwaartse effector van NF-kB signaling, cycline D1 werden gedetecteerd in deze studie (Extra file1). Ectopische expressie van MT2A geïnduceerde zowel mRNA en eiwit expressie van IKB-α in alle onderzochte GC cellijnen (BGC823, SGC7901 en AGS), werden IKB-α mRNA steady-state niveaus met 5,5-voudig in BGC823 cellen opnieuw tot expressie MT2A 48 h. In AGS en SGC7901 cellen zagen we een 7,2-voudige en 4,3-voudige inductie van IKB-α mRNA (Figuur 4A), de relatieve eiwitniveaus kwamen overeen met mRNA transcripten, en de p-IKB-α eiwit verminderd in de GC cellen getransfecteerd MT2A vector (Figuur 4B). Zoals getoond in Figuren 4C en D, knockdown van endogene MT2A in GES1 cellen leidde tot de downregulatie van IKB-α expressie en up-regulatie van p-IKB-α en cycline D1 expressie, wat suggereert een verband tussen MT2A activiteit en IKB -α expressie. Deze experimenten geven aan dat MT2A induceert IKB-α expressie in mRNA en eiwitniveaus. En MT2A-gemedieerde up-regulering van de IKB-α expressie werd verder bevestigd door immunofluorescentie (Figuur 5A, Extra file1). Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• Uitingen van COX-2 en VEGF-C bij maagkanker: correlatie met lymfangiogenese en prognostische implicaties
• Neerwaartse regulatie van de SPARC-expressie afneemt maagkanker cellulaire invasie en overleving