PLoS ONE: Funn av tumor markører for magekreft ved Proteomics

Abstract

Magekreft (GC) har en høy grad av sykelighet og dødelighet blant ulike kreftformer over hele verden. Utvikling av ikke-invasiv diagnostiske metoder eller teknologi for å spore forekomsten av GC haster, og søker pålitelige biomarkører er considered.This studie ment å direkte oppdage differensial biomarkører fra GC vev ved to-dimensjon-differensial gelelektroforese (2D-DIGE), og ytterligere validere protein uttrykk ved western blotting (WB) og immunhistokjemi (IHC) .Pairs av GC vev (mage kreft vev og de tilstøtende normalt vev) hentet fra kirurgi ble undersøkt for 2D-DIEG.Five proteiner wereconfirmed av WB og IHC, inkludert glukose -regulated protein 78 (GRP78), glutation s-transferase pi (GSTpi), apolipoprotein AI (ApoAI), alfa-1 antitrypsin (A1AT) og gastrokine-1 (GKN-1). Blant resultatene, GRP78, GSTpi og A1ATwere significantlyup-regulert og nedregulert i henholdsvis mage kreftpasienter. Videre ble GRP78 og ApoAI korrelert med A1AT for protein expressions.This studie foruts disse proteinene kan være kandidater av pålitelige biomarkører for magekreft

Citation. Wu JY, Cheng CC, Wang JY, Wu DC, Hsieh JS Lee SC, et al. (2014) Funn av tumor markører for Gastric Cancer av proteomikk. PLoS ONE 9 (1): e84158. doi: 10,1371 /journal.pone.0084158

Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA

mottatt: 19 august 2013; Godkjent: 12 november 2013; Publisert: 03.01.2014

Copyright: © 2014 Wu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd NSC96-3111-P-042A-004-Y, NSC100-2314-B-037-040, og ved National Science Council of Republikken Kina. Dette arbeidet ble også støttet av Kaohsiung Medical University Hospital (KMUH97-7R32, KMUH98-8R33). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Selv om theprevalence av magekreft er synkende og varierende geografisk, er det fortsatt en av de vanligste kreftformene i asiatiske land, og er den fjerde hyppigste forekommende kreft (9% av alle krefttilfeller) over hele verden. De alders standardisert forekomst (ASR) er større enn 20 per 100.000 i høyrisikoland som Kina, Japan og Korea [1], [2], [3]. Det er også den nest største årsaken til kreftdød i begge kjønn på verdensbasis (737,000 dødsfall, 9.7% av totalen). I Øst-Asia, har dødeligheten blitt estimert til ca 28,1 per 100 000 hos menn og 13,0 per 100 000 hos kvinner, whilein Nord-Amerika, de er omtrent 2,8 og 1,5 henholdsvis [4].

Fem års overlevelse har variert fra 90% til mindre enn 5 prosent, hovedsakelig avhengig av stadium av diagnosen [5], [6] .Hvis magekreft kan oppdages og behandles i tidlige stadier, rateis de fem-års overlevelse bedre enn 90%; Men det isno åpenbar eller spesifikke symptom på tidlig stadium mage cancer.Thus, tidlig detectionof magekreft becomesmore difficult.Although serum pepsinogen (PG) testssuch så lavt PGI konsentrasjon og /eller lav ratio PGI /II var tankevekkende screeningtester i høy- risiko land som Japan, weregood de indikatorer på atrofisk gastritt stedet for diagnostisk markersof magekreft [7] - [9] .Essentially, har endoskopi beenthe lovende verktøy med 2,7 til 4,6 ganger høyere treffprosent enn barium studier [10]. Men tidlig magekreft diagnose ved endoscopydependson faglig dyktighet.

Noen ikke-invasive biomarkører for diagnostisering eller oppfølging i mage og lever tumorshave blitt rapportert. For eksempel, alfaføtoprotein (AFP) er en av de klinisk anvendelige biomarkører for diagnostisering og oppfølging av leverkreft (HCC) .AFP ble hevet over 20 ng /ml i en studie i mer enn 70% av pasienter med HCC [11]. Ifølge konklusjonene fra Barcelona-2000 European Association for studier av leveren (EASL) konferanse, kan HCC bli diagnostisert uten biopsyin tilfeller der AFP er større enn 400 ng /ml med en knute større enn 2 cm, som viser tegn på arteriell hypervascularization i cirrhosepasienter [12] .Incolorectal karsinom (CRC), preoperative carcinoembryonic antigen (CEA) nivå er en svært viktig prognostisk kovariat og det er anbefalt av American Society of Clinical Oncology (ASCO) at det bør testes pre-operativt til gi prognostisk informasjon [13]. Serie økning av CEA indikerer høyere muligheten for tilbakefall av CRC. Men det er ingen pålitelig biomarkør for magekreft.

Derfor søker etter pålitelige biomarkører for magekreft er svært viktig for klinisk praksis. Denne studien forsøkte å finne pålitelige protein biomarkører fra matchet vev (svulst og nærliggende normalt vev) ved to-dimensjon-forskjell gelelektroforese (2D-DIGE), og identifisere proteiner ved matrise-assistert laser desorpsjon /ionisering-bildebehandling massespektrometri (MALDI -IMS).

Materialer og metoder

Vevsprøver

Vevsprøver ble oppnådd etter informere samtykke ble signert. Sammenkoblet samplesincluding svulsten og tilstøtende normale tissuesfrom pasienter ble hentet fra endoskopiske biopsier eller surgery.The tumor karakterer ble bestemt i henhold til den amerikanske Joint Commission on Cancer Staging (AJCCS) system av patologer henhold metylenblått staining.Clinical informasjon av pasientene ble spilt inn, blant annet alder, kjønn, tumortype, invasjon og overlevelse. I tillegg er CEA konsentrasjonen i serum ble også målt ved radioaktiv immunanalyse i rutinemessig medisinsk diagnosis.The individualsenrolled i denne studien har gitt skriftlig informert samtykke til å publisere disse case details.This Studien ble godkjent av Institutional Review Board of Kaohsiung Medical University Chung- Ho Memorial Hospital (KMUH-IRB-980382).

To dimensjonsforskjell gelelektroforese

En (tabell 1) par av vevsprøver washomogenized (PRO 200, Bertec, Taiwan) i moderat volum av lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, 8M urea, 4% (vekt /volum) 3 - [(3-Cholamidopropyl) dimetylammonio] -1-propansulfonat, og pH 8,5). Den enkelte 50 ug av prøven protein ble merket med 400 pmol av Cy3 Cy5 eller hver for seg i 30 minutter (Fig. 1B). I tillegg ble den sammenslåtte prøven blanding (100 ug) som er merket med 800 pmol av CY2 som indre standard på samme tid. Deretter merkingen reactionswere stoppet ved inkubering av 1 pl av 10 mM lysin-buffer i 30 minutter, deretter en-gangers volum av prøvebuffer (8 M urea, 20 mM ditiotreitol, 4% (vekt /volum) 3 - [(3- -Cholamidopropyl) dimetylammonio] -1-propansulfonat, 0,5% (v /v) IPG buffer og få bromfenolblått) ble added.The første separasjons, isoelektrisk fokusering, ble utført ved bruk av hetten blir lastet på gelen strimlene (7 cm, pI 4- 7) ved 20 ° C og tatt i henhold 15000voltage-timer (IPGphor system, GE Healthcare). Etter ekvilibrering med natriumdodecylsulfat, den andre separationwas utført using4-12% natriumdodecylsulfat-polyakrylamid gelelektroforese. Gelen bildene ble anskaffet (Typhoon TRIO Variable Mode Imager, GE Healthcare) med 488, 532 og 633 nm lasere med et utslipp filter på 520, 532 og 670 nm hhv. Alle bildene ble analysert med DeCyder 6.5 programvare (GE Healthcare) for å velge differensial proteiner som wereselected avhengig onthe plassering under en betydelig verdi på 0,05 i henhold til Student t
-test.

In-gel tryptisk fordøyelse

geler farget med Sybro Ruby (sigma) ble deretter avfarget med 10% metanol og 7% eddiksyre i deionisert vann i nøyaktig 30 min.The synlige flekker-geler i henhold til en UV-transilluminator (Spectroline) var brukes til å grave etter de interessante proteiner manuelt. Disse gel-partikler ble vasket i 100 pl av 25 mM ammoniumbikarbonat i 50% acetonitril i 15 min, og deretter vasket i 200 ul av 25 mM ammoniumbikarbonat i avionisert vann i 15 minutter to ganger, og deretter, nok acetonitril ble tilsatt for å krympe gelpartikler. Etter tørking ned, den enkelte gelen particleswereincubated med 3 ul av 20 ng /mL av trypsin i 25 mM ammoniumbikarbonat ved 4 ° C i 1 time og deretter 3 mL av 25 mM ammoniumbikarbonat ble tilsatt for å fordøye proteinene ved 56 ° C i 1 time. Etter at I-gel-fordøyelse, ble 2 pl 100% acetonitril med 1% trifluoreddiksyre tilsatt til løsningene og deretter prøver ble ultralydbehandlet i 10 minutter for å frigi peptider fra gelpartikler.

Massespektrometrisk analyse for protein identifikasjon

Hver proteinoppløsning spaltet med trypsin ble blandet 1:01 med 10 mg /mlof α-cyano-4-hydroxycinnamic syre oppløst i 50% acetonitril /0,1% trifluoreddiksyre, og flekket på AnchorChip MALDI target (Bruker Daltonics GmbH , Bremen, Tyskland) til den er tørr. Peptider ble analysert ved MALDI-TOF /TOF UltraflexIII (Bruker Daltonics) under 20 KV med positiv modell, og peak data ble overført til FlexAnalysis ™ 3.0-programvaren (Bruker Daltonics) for avansert beregning og kalibrering. MASCOT 2.2 (Matrix Science) ble brukt til å matche peptider med NCBI eller Swiss-Prot database for protein identifikasjon. Innstillingen var begrenset til menneskelig taksonomi parameters.Meanwhile ble carbamidomethyl cystein brukes som en fast modifikasjon, og oksidert metionin som en variabel modifikasjon. Sannsynligheten (P) var basert på mowse skår beregnet fra -10 x Log (P). Protein score høyere enn 56 var signifikant ( p
< 0,05). Videre er en av de viktigste toppene peptid som finnes på spektrum ble brukt til å bekrefte det samme resultat ved å identifisere den aminosyresekvens som er kalt peptidfragment fingerprinting metode.

Western blotting

Parene av vevsprøver ble homogenisert (Pro 200, Bertec) i lyseringsbuffer (10 mM natriumfosfat, 0,9% natriumklorid, 1% triton-X100, pH 7,4) og inkubert på risting ved 4 ° C i 1 time. Etter å bli kvitt de utfelte kuler ved høy hastighet sentrifugering (10000 rpm, 5 minutter), ble pipettert supernatantene tilsettes til prøvebuffer (10 mM natriumfosfat, 0,9% natriumklorid, 8 M urea, 30% glycerol, 2 % natriumdodecylsulfat, 0,1% β-merkaptoetanol og 0,1% bromfenolblått) ved 1: 1 forhold og kokt ved 100 ° C i 5 minutter for protein denature.Approximately 20 ug av hver prøve protein ble applisert på den individuelle rutenett av 4- 12% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE, Invitrogen). Den iblot tørrblotting systemet (Invitrogen) ble anvendt for transformering av proteinene til polyvinylidenfluorid (PVDF) membran basert på ion som strømmer sammen med en kobberelektrode. Etter bruk av 0,5% melk for å utslette den PVDF-membran i 30 minutter, ble theindividual primære antistoff (2 ug /ml) tilsatt for inkubering i 2 timer med risting. Den konsekvente sekundære antistoffer konjugert med pepperrot peroksidase (HRP) (2 ug /ml) ble inkubert i 1 time med risting fortløpende. Mellom inkubasjonssystemet prosesser, repeatedlywashings med PBS-buffer (10 mM natriumfosfat, pH 7,4 og 0,9% natriumklorid) weredone. ECL deteksjonssystem (Millipore) ble utført, og bildene ble kjøpt opp av Imaging System (Gel Doc XR System, Bio-Rad) avhengig av moderat utforske tid.

Immunohistochemistry

Immunohistochemistry var performedusing en standard peroksidase-basert fargemetoden. Vevsprøvene ble kuttet med en kryostat (HM525, uM) .fresh vevssnitt (10 um) på lysin-belagte objektglass ble driedon en ovn ved 37 ° C og fortløpende neddykket ved sekvensiell 75%, 95% og 100% etanol i 1 minutt for protein fiksering. I korthet ble endogen peroksidaseaktivitet stoppet med 3% hydrogenperoksid i 10 minutter. Antigenet episode ble eksponert ved å nedsenke vev glide i 10 mM citrat syre i kokende vann i 25 minutter. Påfølgende inkubasjon med de enkelte primær antibodyandthe HRP-konjugert sekundære antistoffer ble utført for individuell en time på risting. AEC-kit (Sigma) ble anvendt for å farge vev, og operasjonen følges den vedlagte bruksanvisningen. I korthet themixed oppløsning av 2,5 M acetatbuffer, AEC kromogen (3-amino-9ethylcarbazole) og 3% hydrogenperoksyd wasperformed umiddelbart etter hverandre og inkubert med vev slides.The bildefargeglass ble observert og anskaffet gjennom en mikroskopi (BX51, Olympus) .

Statistikk analyse

den statistikken programvaren SPSS ble utført for å beregne betydningen ifølge Student t
-test og korrelasjon mellom GRP78, GSTpi, A1AT, ApoAI og GKN- 1. Den significantdifference ( p
verdi) var akseptabelt som mindre enn 0,5.

Resultater

Biomarkører funn basert på 2D-DIGE

magekreft vev ble analysert av 2D-DIGE og sammenlignet med sammenkoblede normalt vev for å søke etter de antatte biomarkører for magekreft. Forskjeller proteinexpressions større enn 1,2 ganger var mulige kandidater. Gelen Bildet var presentasjon av proteiner sted som er merket med CY-fargestoffer (fig. 1). Femten proteiner kan bli identifisert, inkludert glukoseregulerte protein 78 (GRP78), varmesjokk beslektet 71 kDa protein (HSC70), protein disulfid-isomerase A3 (PDIA3), mitokondriell ATP-syntase-subenhet beta (ATPB), protein disulfid-isomerase-relaterte proteinet 5 (PDIRP5), gastricsin, glutation s-transferase pi (GSTpi), apolipoprotein AI (ApoAI), alfa-1 antitrypsin (A1AT) og gastrokine-en (GKN-1) .I tre dupliseres gjentar, var at identiske proteiner finnes på forskjellige steder av gel og utelukket under mistanke om post-translasjonell modifikasjon. Til slutt ble fem proteiner inkludert GRP78, GSTpi, apoAI- A1AT og GKN-en bekreftet og videre validert som mulige markører for magekreft. De detaljerte sammenligninger av stereopicture og forstørret gel imageswere vist i figur 2.

Western blotting og statistisk analyse

Twelvepairs av vev fra mage kreftpasienter ble brukt som validering gruppe. Fire pasienter var stadium I, 3 pasienter var stadium II, 2 pasienter var stadium III, og 3 pasienter var stadium IV. Den kliniske informasjonen ble oppført i tabell 1.Five av proteiner (GRP78, GSTpi, apoAI- A1AT og GKN-1) ble bekreftet ved Western blotting.Amongthe resultater, GRP78 og GSTpiwere significantlyup regulert mens A1AT var signifikant nedregulert i mage cancervev sammenlignet med normale vev (fig. 3) .For GSTpi, nineout av 12 pasienter (75%) var oppregulert protein uttrykk i tumortissues; på den annen side 10 av 12 pasienter (83%) har nedregulert A1AT protein expression.Regarding forholdet mellom protein uttrykk og kliniske faser, har GRP78 en tendens til å øke fra trinn I til trinn IValthough ingen statistisk signifikans ble funnet. Ekspresjonen av GSTpi og A1AT ble ikke korrelert med kliniske faser (figur 4)

Interessant, protein uttrykk for GRP78 i disse par av vev korresponderte med den av ApoAI (R '>. 2: -0,61, p
< 0,01) og A1AT (r ^{2: -0,49, p
< 0,05) (figur 5).. I mellomtiden ble protein ekspresjon av ApoAI korrelert med den i A1AT (R '> 2: 0,62, p
< 0.01, fig. 4). Resultatene indikerte at disse tre antatte biomarkører, GRP78, ApoAI og A1AT, var forbundet mellom hverandre i proteinekspresjon. I kontrast, GSTpi og GKN-1 så ut til å være uavhengig for proteinekspresjon.}

Immunhistokjemi

DespiteGRP78, GSTpi og A1AT være statisticallydifferent betydelig, den uttrykksmessige utviklingen av andre proteiner var den samme som den observasjon i 2D-DIGE eksperiment. Immunhistokjemi ble brukt til å validere de oppkjøpte resultatene fra western blotting eksperimentet. GRP78, GSTpi, ApoAI, GKN-1, og A1AT ble validert i magekreft vev og ikke-cancervev som vist i figur 6. Den protein uttrykk i par av vev var i overensstemmelse med den observasjon i western blotting. Spesielt de oppregulert proteiner, GRP78 og GSTpi, var spesielt plassert på mage adenokarcinomceller. På den annen side, nedregulert proteiner, inkludert ApoAI og A1AT var tilstede på de normale gastriske kjertler. En annen nedregulert protein, GKN-en, ble vist som det som ble vist på slimhinnene i mage vev.

Diskusjoner

Det er viktig å ha biomarkører for diagnostisering og oppfølging av mage cancer.However, carcinoembryonic antigen (CEA), karbohydrater antigen (CA19-9) og CA72-4 er ikke brukte i klinisk practices.The studien forsøkte å avsløre mulige biomarkører ved å sammenligne differensial proteiner mellom matchet kreft og normalt vev. etterpå ble disse antatte biomarkører undersøkt i valideringen group.Five antatte proteiner, inkludert GRP78, GSTpi, apoAI- A1AT og GKN-1, ble identifisert ved to-dimensiondifference gelelektroforese (2D-DIGE), andmatrix-assistert laser desorpsjon /ionization- bildebehandling massespektrometri (MALDI-IMS) og fatherlyvalidated i 12 kliniske patients.Among fem antatte proteiner, GRP78 og GSTpi var signifikant oppregulert og spesielt forbedret i kreftcellene ved western blotting og immunohistochemistry.In kontrast, A1AT wassignificantlydown regulert og hadde positive og negativ korrelasjon med uttrykk for ApoAI og GRP78.

Mange antatte biomarkører av magekreft er foreslått i tidligere studies.High nivåer av GSTpi i magen karsinom ble demonstrert [14] .Den uttrykk for GSTpi ble også korrelert med magekreft stagewhere forhøyet GSTpi werefound i 50% på trinn i eller II, og 80% ved trinn III eller IV magekreftpasienter [15] .En tidligere studie viste at GSTpi-positive pasienter hadde mindre femårige sykdomsfrie overlevelse (49,0%) sammenlignet med GSTpi-negative pasienter (75,0%), indikerte GSTpi var en markør av prognostisk betydning [16] .I denne studien, over-uttrykk for GSTpi i 75% av magekreftpasienter var også demonstrated.However, graden av over-ekspresjon av GSTpi ble ikke korrelert med kliniske faser (fig. 4).

Over-expressionof GRP78 protein ble også rapportert som en antatt biomarkør for gastrointestinal cancers.GRP78 over-uttrykk kan oppdages og relatert til scenen og prognose for esophageal adenokarsinom [17], og tykktarmskreft [ ,,,0],18]. Det er en av de cellulære stressrespons proteiner som spiller en viktig rolle i tumorbiologi, som regulering av apoptose og vedlikeholde det intracellulære kalsiumbalansen [19], [20]. Det ble også rapportert at over-uttrykk for GRP78 av immunhistokjemi i mage kreftprøver og metastatiske lymfeknuter ble omvendt korrelert med pasientens overlevelse [21]. Men de metoder som brukes i denne undersøkelsen var forskjellig fra Zhang rapport. Vi utforsket kandidat proteiner ved 2D-DIGE å skille differensial proteiner og MALDI-TOF /TOF å identifisere peptider i matchet kreft og normal tissues.In vår studie, overekspresjon av GRP78 ble økt og hadde en tendens til sammenheng med kliniske faser, selv om ingen statistisk signifikans på grunn av begrensningen av saksnummer.

Nedregulering gule~~POS=TRUNC av proteiner kan spille en viktig rolle i kreftutvikling. I denne studien, tre proteiner, apoAI, A1AT, og GKN-en, ble nedregulert i normal mage vev i forhold til magekreft tissues.The forholdet ApoAI og magekreft har ikke blitt rapportert. ApoAI er en av de viktigste protein bestanddelene av high-density lipoprotein kolesterol (HDL-C) og spiller en rolle i å opprettholde førsteklasses kolesteroltransport og atheroprotective virkning av HDL-C [22] .Apolipoproteins som ApoAI kan modulere lipopolysakkarid-inducedinflammatory respons i sepsis [23]. I den foreliggende undersøkelse, er det mulig at redusert ApoAI er en refleksjon av kronisk betennelse, som er en årsak til kreftutvikling. Videre studier er nødvendig for å demonstrere sammenhengen mellom nedgang på ApoAI og dys-regulering av betennelse.

Selv om økt A1AT i innledende stadier og sammenheng med utviklingen av magekreft stadier ble observert av Bernacka K. et al. [ ,,,0],24], kan begrensede data belyse økt A1AT som en svulst markør for magekreft. I stedet, redusert A1AT i magekreft ble funnet i vår studie. A1AT besitter anti-inflammatorisk aktivitet in vitro og bidrar til undertrykkelsen av proinflammatorisk cytokin-syntese, slik som interleukin-8, TNF-alfa, interleukin-1 beta [25]. Det har blitt rapportert at verts genetiske faktorer som påvirker interleukin-1-beta kan bestemme sykdom fenotype av H. pylori-infeksjon [26]. Det er mulig at redusert A1AT hemmer proinflammatoriske cytokiner undertrykkelse effekt. [25]. I vår studie sammenhengen mellom redusert A1AT og ApoA1 ble antatt en indikator på kronisk betennelse.

Gastrokine-en (GKN-1), som har noen mitogen effekt på tarm epitelceller (IEC-6), var nede -regulated i magekreft vev sammenlignet med matchet normal mageslimhinnen i vår studie. Gastrisk mucosa restaurering etter skade kan hindres dersom GKN-1 er nedregulert [27], [28] .Det har blitt rapportert at GKN1 er relatert til apoptotiske signaler som er viktige for vev reparasjon i løpet av neoplastisk transformasjon [29]. Dataene fra denne studien antyder også en redusert GKN-en kan bli funnet i mage kreft vev.

proteomikk-basert metode for å identifisere apoptose relaterte proteiner i magekreft ble tidligere rapportert av Bai Z. et al [ ,,,0],30] .Nevertheless, differensial uttrykk proteiner av denne studien var ikke identisk med Bai rapport tyder ENO1, GRP78, GRP94, PPIA, PRDX1 og PTEN som potensiell magekreft biomarkers.Regarding utvikling av magekreft, er det en komplisert prosess, og utstillinger interaksjoner mellom vert, miljø, og bakterier som Helicobacter pylori
.En enkelt faktor eller protein kan ikke være i stand til å forutsi forekomst og progresjon av magekreft. I den foreliggende undersøkelse, ble fem antatte proteiner funnet å bli uttrykt forskjellig i passet vev (tumor og tilstøtende normalt vev). To av dem (GRP78 og GSTpi) var oppregulert og de andre (apoAI- A1AT, og GKN-1) ble nedregulert. Videre studier vil være nødvendig å belyse theseproteins asbiomarkers for påvisning av magekreft.

• PLoS ONE: Ned Kjerne-Fucosylation Bidrar til malignitet i Gastric Cancer
• PLoS ONE: MYC Deregulering i Gastric Cancer and Its Clinicopathological implikasjoner