PLoS ONE: Regulering av RKIP Funksjon av Helicobacter pylori i Gastric Cancer

Abstract

Helicobacter pylori (H. pylori)
er en gram-negative, spiralformet bakterie som smitter mer enn halvparten av verdens befolkning, og er en viktig årsak til adenokarsinom i ventrikkel. Mekanismene som lenker H. pylori
smitte til magekreftutvikling er ikke godt forstått. I den foreliggende undersøkelse rapporterer vi at Raf-kinase inhibitor protein (RKIP) har en rolle i induksjon av apoptose ved H. pylori
i mage epitelceller. Western blot og luciferase transkripsjon reporter analyser viser at patogenitet øya H. pylori
fosforylerer hurtig RKIP, som deretter lokaliserer til kjernen hvor den aktiverer sin egen transkripsjon og induserer apoptose. Tvunget overekspresjon av RKIP forbedrer apoptose i H. pylori
-infected celler, mens RKIP RNA hemming undertrykker induksjon av apoptose av H. pylori
infeksjon. Mens indusere fosforylering av RKIP, H. pylori
rettet samtidig ikke-fosforylert RKIP for proteasome-mediert degradering. Økningen i RKIP transkripsjon og fosforylering blir opphevet ved mutere RKIP serin 153 til valin, viser at regulering av RKIP aktivitet ved H. pylori
er avhengig RKIP sin S153 rester. I tillegg H. pylori
infeksjon øker uttrykket av sneglen, en transkripsjons repressor av RKIP. Våre resultater tyder på at H. pylori
benytter en tumor suppressor protein, RKIP, for å fremme apoptose i magekreftceller

Citation. Moen EL, Wen S, Anwar T, Cross-Knorr S, Brilliant K, Birnbaum F et al . (2012) Regulering av RKIP Funksjon av Helicobacter pylori
i magekreft. PLoS ONE 7 (5): e37819. doi: 10,1371 /journal.pone.0037819

Redaktør: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), USA

mottatt: 30 desember 2011; Godkjent: 24 april 2012; Publisert: May 25, 2012 |

Copyright: © 2012 Moen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health i henhold Award Antall P20GM103421 (DC); den forrige delen av dette prosjektet ble støttet av National Center for Forskning Resources (NCRR) under P20 RR 017695 (DC), R01 CA111533 (SFM) og R21 CA133601 (JMS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den fjerde mest diagnostisert kreft i verden. I 2007, omtrent en million nye magekrefttilfeller fører til ca 800 000 dødsfall ble registrert, og er den nest vanligste årsaken til død av kreft [1]. Magekreft er i dag den syvende største årsaken til kreft dødsfall i USA, med om lag 21 500 nye tilfeller diagnostisert i 2011 (http://www.cancer.gov/cancertopics/types/stomach). Den gram-negative, spiralformet bakterie Helicobacter pylori (H. pylori)
smitter mer enn halvparten av verdens befolkning og har blitt identifisert som en viktig risikofaktor i magekreftutvikling [2]. Verdens helseorganisasjon og International Agency for Research on Cancer utpekt det som en klasse jeg karsinogen i 1994 [3]. Vår nåværende forståelse av H. pylori
indusert karsinogenese er at bakterien og den tilhørende kroniske inflammatoriske respons fremme gastrisk epitelisk celledød ved apoptose [4], med påfølgende hyper-proliferasjon [5], og fri-radikal produksjon [6] som alle bidrar til en langsom og progressiv sekvens av forandringer i den gastriske slimhinne som til slutt favoriserer progresjon mot kreft. Denne modellen er konsistent med rapporter om at pro-inflammatorisk cytokin genet polymorfismer som øker intensiteten av den inflammatoriske respons er relatert til økt magekreft [7].

H. pylori
følger nøye til mage epitelceller og kan indusere apoptose direkte [8]. CAG (cytotoksiske-forbundet genet) patogenitet øya (CAG PAI) av H. pylori
er et 40 kB segment av DNA som inneholder gener som koder for komponenter av et type IV bakterie sekresjon system [9]. Innenfor denne regionen er CagA
genet som koder CagA, en immunodominant protein av 121-145 kDa [9]. H. pylori
stammer med og uttrykker CAG PAI er oftere assosiert med magesår sykdom og magekreft i vestlige populasjoner enn stammer som ikke [9]. Ved dets injeksjon via type IV-sekresjon system i verts gastriske epitelceller, kan CagA senere bli fosforylert av Src-familie-tyrosin-kinaser ved sin C-terminale ende [10], som fører CagA til å binde og aktivere SHP2 og signal via ERK [11]. Viktigere er CagA også ansvarlig for aktivering av signal svinger og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) in vitro Hotell og in vivo product: [12], selv om dette ikke nødvendigvis være avhengig CagA fosforylering [11]

STAT proteiner er konstitutivt uttrykt i flere svulster, inkludert mage, bryst, hode og nakke, og prostata kreft [13] -. [16]. Ved fosforylering av tyrosin-705-rest og acetylering ved lysin 685, STAT3 dimerizes og går inn i kjernen hvor den fungerer til transkripsjonelt regulere en rekke gener [17], [18]. Konstitutiv aktivering av STAT3 protein har vist seg å forhindre apoptose og økt celleproliferasjon og metastase i en rekke kreftformer, inkludert magekreft [19], [20].

Et av kjennetegnene ved gastrisk tumorprogresjon er erverv av mer invasive og trekk fenotyper under epiteliale-mesenchymale overgang (EMT). Under EMT, mage-epitelceller gjennomgå fenotypiske forandringer kjennetegnet ved tap av celleadhesjonsmolekyler, særlig epiteliale cadherin (E-cadherin) [21]. Den transkripsjonsfaktor snegl, en sink-finger-protein, er blitt karakterisert tidligere som en viktig regulator av EMT på grunn av sin aktivering via nukleær faktor kappa Beta (NF-kB) [22] og etterfølgende undertrykkelse av E-cadherin i epitel-tumorceller [ ,,,0],23], [24]. I tillegg studerer ved hjelp av gain-of-funksjon og tap-av-funksjon tilnærminger har identifisert sneglen som en repressor av RKIP transkripsjon med metastatisk prostata kreft celler [25].

RKIP er medlem av fosfatidyletanolamin-bindende protein familie og en negativ regulator av ERK1 /2 (ekstracellulær Signal-regulert kinase) [26], NF-kB [27] og GRK (G protein-koblet reseptor kinase) [28] trasé. RKIP spiller således en viktig rolle i regulering av celleoverlevelse og apoptose, i tillegg til potensiering av virkningen av kjemoterapeutiske midler [29]. RKIP har også blitt identifisert som en metastase suppressor protein [30], og i adenokarsinom i ventrikkelen finnes det en positiv sammenheng mellom RKIP uttrykk og pasient overlevelse og en invers korrelasjon mellom uttrykk for RKIP og STAT3 [19]. RKIP ekspresjon og funksjon kan reguleres ved post-translasjonelle modifikasjoner. For eksempel, fosforylering av RKIP av proteinkinase C ved serin-153 hindrer RKIP evne til å binde til dets mål-molekyl, og dermed å inaktivere RKIP funksjon [31]. Videre kan RKIP undertrykkelse via promoter metylering overvinnes ved metylering og histondeacetylase hemmere [25].

På grunn av de viktige rollene RKIP, STAT3 og H. pylori
i patogenesen av magekreft, undersøkte vi om H. pylori
signaler gjennom RKIP. Våre studier tyder på at et komplekst samspill mellom H. pylori er cagPAI
, RKIP, STAT3, og virker slik at sneglen dysregulate gastrisk epitelial celle apoptose ved å modulere RKIP funksjon, en mekanisme som definerer en sentral rolle for RKIP i H. pylori
-associated magekreftutvikling.

Materialer og metoder

Reagenser

Alle reagenser og kjemikalier ble kjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri) med mindre annet er angitt. MG-132 ble innkjøpt fra Calbiochem (Gibbstown, NJ) ble oppløst i DMSO og anvendt i en konsentrasjon på 10 mM. Interleukin-6 (IL-6) ble kjøpt fra BD Biosciences (San Diego, California). Protein kvantifisering reagenser ble oppnådd fra Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA). Forbedrede Chemiluminescence reagenser og muse og kanin pepperrotperoksidase-konjugert for Western blot analyse var fra GE Healthcare (Piscataway, NJ). Den aktin-HRP, fosforylert-RKIP (pRKIP) og Stat3 antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biothechnology (Santa Cruz, California). Antistoffene til STAT3 pS727 og pY705 og PARP ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA) og antistoff mot RKIP fra Millipore, Billerica, MA. Antistoffet til sneglen ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, MA).

Cells og Plasmider

Den menneskelige magekreft cellelinje AGS (CRL-1739) ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manasas , VA). MKN28 celler ble donert av Dr. Richard Peek, Vanderbilt University, Nashville, TN og ble opprinnelig kjøpt fra Riken Cell Bank, Ibaraki, Japan. Plasmidene av pcDNA3, c-myc STAT3, CMV-HA-RKIP (HA-RKIP) og CMV-HA tom vektor (EV) er blitt beskrevet [18], [26]. Den RKIP S153V plasmid ble gitt av Dr. Marsha Rosner, University of Chicago, Chicago, IL.

H. pylori
Stammer og kultur betingelser

Wild typen H. pylori
stammer eller isogen H. pylori
mutanter ble ko-dyrket med AGS eller MKN gastriske cellelinjer som tidligere beskrevet [32] ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 100:1 i alle forsøk, med mindre annet er angitt.

Transfeksjon av AGS Cells

AGS celler ble transient transfektert med GenJet plasmid transfeksjon reagens (Signagen Laboratories, Gaithersburg, MD) i henhold til produsentens protokoll for en seks-brønns plate format. Total DNA-mengder på mellom 1 og 2 ug transfektert per prøve. Transfeksjon forhold ble vurdert og optimalisert ved analyse av celler transfektert med et grønt fluorescerende protein (GFP) -expressing RKIP plasmid. Transfeksjonseffektiviteter var konsekvent i området fra 75-85%.

Protein Extraction og Western blot-analyse

Totale celleekstrakter og subcellulære fraksjoner ble fremstilt og immunoblottet som tidligere beskrevet [29], [32 ]. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved hjelp av BCA Protein Assay (Thermo Scientific). Densitometry av Western blot ble utført i henhold til protokollen oppført på følgende nettsted. Http://lukemiller.org/journal/2007/

Realtime PCR

To mikrogram av RNA ble konvertert til cDNA ved hjelp RevertAid First-Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). Kvantitativ real-time PCR ble utført ved bruk av 2 × Qiagen QuantiFast SYBR Grønn I (Roche). De primere for sneglen var frem: AGCTCTCTGAGGCCAAGGATCT, omvendt: TGTGGCTTCGGATGTGCAT og beta-aktin: fremover: CTGGCACCACACCTTCTACAA, omvendt: CAGCCTGGATAGCAACGTACA. De følgende typiske profiltider som ble brukt var i 40 sykluser: et første trinn ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Den relative Ekspresjonsnivået ble beregnet ved bruk av 2-ΔΔCT metode som tidligere beskrevet [33].

STAT3 og RKIP luciferaserapportørplasmid Analyser

Celler (2 x 10 ^{5 celler /brønn i 6-brønners plater) ble transient transfektert med 0,1 ug (STAT3, RKIP) eller 0,05 ug (NF-kB) av en reporter plasmid inneholdende enten den STAT3 bindingen SIE-fragment av promoter-regionen til mus IRF1 genet (p2xSIE-Luc) eller den RKIP promoter-regionen pluss de angitte plasmidene som tidligere beskrevet [18]. Omtrent 24 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med den angitte medikament eller infisert med H. pylori
over natten eller venstre ubehandlet. Luciferaseaktiviteten i cytosoliske supernatanten ble evaluert ved bruk av luciferase reporter Assay (Promega) og målt ved anvendelse av et luminometer for å estimere transkripsjonen aktivitet [18].}

apoptose Assays

Apoptose ble kvantifisert i separate analyser ved strømningscytometri og DNA-fragmentering ELISA. For strømningscytometri var andelen av apoptotiske celler (sub-G _{O) ble bestemt ved strømningscytometrisk analyse av propidiumjodid farget celler [29]. Cytoplasmatiske histon-assosierte DNA-fragmentering ble målt med celledød Detection ELISA Plus kit (Roche, Indianapolis, IN) i henhold til produsentens instruksjoner.}

Cytoplasmatiske histon-assosierte DNA-fragmentering ble målt med celledød Detection ELISA Plus kit (Roche, Indianapolis, IN) i henhold til produsentens instruksjoner. Forsøkene ble gjentatt 3 ganger og utført i duplikat.

Lentivirus-mediert knockdown av RKIP

Lentivirus konstruerer.

pLKO.1 puro-motstand lentiviral konstruere RHS3979-97070798 og RHS3979-98492779 ble kjøpt fra Open Biosystems (Huntsville, AL). Konstruksjonene inneholdt puromycin en seleksjonsmarkør og ble dyrket i Luria-medium inneholdende ampicillin ved 37 ° C. Suppen ble sentrifugert ved 10000 x g
i 10 min. og supernatanten kastes. DNA fra pelletene ble renset ved anvendelse av QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit.

Lentivirus produksjon.

293T emballasje-celler ble sådd ut i lav-antibiotikum vekstmedium (DMEM, 10% varmeinaktivert FBS, 0,1 × Penicillin /Strepomycin /Glutamin). Celler ble inkubert i 24 timer (37 ° C, 5% CO _{2), eller inntil de var ca. ~70% sammenflytende. Mediene på 293T emballasje celler ble erstattet med høy vekstmedier som inneholder DMEM. En blanding av transfeksjons-plasmider ble fremstilt som følger: a. Innpakning plasmid (ΔVpr.89), konvolutt plasmid (VSV-G), hårnål-pLKO.1 og tom vektor}

Fugene transfeksjon-reagens ble fremstilt i DMEM ifølge til produsentens instruksjoner. Kort sagt ble de 3 plasmidene tilsatt dråpevis til Fugene og DMEM og blandet. Blandingen ble deretter inkubert i 20-30 min. ved romtemperatur. Transfeksjon blandingen ble deretter forsiktig tilsatt til pakkingscellene. Cellene ble inkubert i tilnærmet 18 timer. Transfeksjonsmetoden media ble deretter kastet påfølgende morgen, og erstattet med høy vekstmedier. Celler ble inkubert i 24 timer. Lentivirus som inneholder media ble høstet containingand ekstra høy vekstmedier til. Celler ble inkubert i 24 timer og mediene høstet. Typisk samlingen var for 2-3 tidspunkter. Alle virus avlinger ble slått sammen.

Lentivirus infeksjon av AGS celler.

AGS celler ble dyrket til ca 50% samløpet. De virale supernatantene ble tilsatt polybrene. Tolv timer etter infeksjon, ble det virale mediet kassert og erstattet med virale media og inkubert i ytterligere 12 timer. Mediene ble forkastet og erstattet med Hams F12 medium. Celler ble inkubert i 24 timer. Cellene ble delt opp i seleksjonsmedium innehold av puromycin og fikk inkubere i 24 timer.

statistiske metoder

Alle cellekultur Forsøkene ble gjentatt minst 3 ganger, med mindre annet er angitt, og paret t- tester ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans.

Resultater

H. pylori
Infeksjon Øker Fosforylering av RKIP

RKIP hemmer flere celleoverlevelses veier, inkludert de mediert gjennom NF-kB og Jak /STAT [22]. For å belyse effekten av H. pylori
infeksjon på RKIP i mage celler, ble AGS celler infisert med H. pylori Hotell og høstet 2 timer og 6 timer senere. Som vist på fig. 1A, ble nivåer av fosforylert RKIP (pRKIP) forhøyet etter 2 h (3,126 ganger) og 6 h (2,9-fold) etter H. pylori
infeksjon mens total RKIP protein uttrykk økt 1,4 ganger etter 2 timer og 1,75 ganger etter 6 timer på H. pylori
infeksjon. Lignende resultater ble også oppnådd med MKN magecancerceller (se figur S1).

H. pylori
indusert fosforylering av RKIP er PKC-avhengig

fosforylering av RKIP på serin 153 av protein kinase C (PKC) opphever dens evne til å binde til Raf og inhibere nedstrøms MAP kinase signalering [31]. Vi undersøkte om fosforylering av RKIP av H. pylori
var PKC avhengig. AGS celler ble infisert med H. pylori
i 6 timer, i nærvær eller fravær av 40 pM Bisindolylmaleimide (Bis, en PKC-inhibitor). Våre resultater tyder på at nivået av fosforylert RKIP ble hemmet 3,9-fold og RKIP 1,36 ganger etter H. pylori
infeksjon i nærvær av PKC-inhibitoren, noe som tyder på at fosforylering av RKIP H. pylori
innebærer, men kan ikke være helt avhengig av, den PKC-regulert vei (Fig. 1B).

IL-6 induserer fosforylering av RKIP og H. pylori-
aktiverer STAT3

Siden det er en invers sammenheng mellom RKIP og STAT3 uttrykk i magekreftprøver [19], evaluert vi enten STAT3 og styrings regulator IL-6 [17] påvirker pRKIP uttrykk. IL-6-behandling med en dose på 25 eller 50 ng /ml økte nivåer av pRKIP protein 1,8 og 1,35 ganger i henholdsvis og total RKIP proteinekspresjon nedsatt 0,8 og økt 1,05 ganger i henholdsvis (figur 2A.). Fosforyleringen av RKIP i respons til IL-6 ble PKC-avhengig (data ikke vist). Disse data indikerer at IL-6 kan også indusere fosforylering av RKIP i mage-celler som kan oppstå, delvis til en PKC-avhengig reaksjonsvei.

makrofager frigjørings cytokiner, inkludert IL-6 under H. pylori-infeksjon
[34] som fører til aktivering STAT3 [17]. For å undersøke effekten av H. pylori
infeksjon på aktivering av STAT3 ble AGS celler transient transfektert med en IRF-en reporter konstruere [18] og co-kultivert med H. pylori
ved den angitte rekke multiplisitet av infeksjon (MOI) i 24 timer. Våre resultater viste at ved en MOI mellom 10-200:1, H. pylori
var i stand til å indusere transkripsjon STAT3 (fig. 2C) og STAT3 pY705 fosforylering (fig. 2B) i løpet av 6 timer etter infeksjon. Vi neste fastslått om IL-6 kan også stimulere STAT3 transkripsjon i AGS celler. AGS-celler ble transient transfektert med IRF-1 og med EV og eller c-myc-merket STAT3 og deretter etter 24 timer celler behandlet med enten IL-6 (50 ng /ml) eller ko-dyrket med H. pylori
på MOI av 100:1. Resultatene, vist på fig. 2D, viser at IL-6 (p < 0,0003) og H. pylori product: (p < 0,0005) ble hver stand til å betydelig stimulere STAT3 transkripsjon, en effekt som ble forsterket da AGS celler ble transfektert med STAT3 og infisert med H. pylori product: (p < 0,0000023). Forbedring av STAT3 Aktiveringen ble signifikant øket når AGS-celler ble ko-behandlet med IL-6 og H. pylori
sammenlignet med behandling med IL-6 (p < 0,000028) eller H. pylori product: (p < 0,0003). alene

Fosforylert RKIP induserer sin egen transkripsjon

Vi brukte en RKIP luciferase reporter analysen for å undersøke effektene av H. pylori
infeksjon på RKIP transkripsjonen aktivitet. H. pylori
betydelig økt RKIP transkripsjon (p < 0,002) med en større enn 10-dobling oppstår med RKIP overekspresjon og større enn 16 ganger økning med kombinasjonen av H. pylori
og RKIP (p < 0,0003) (figur 3A.) sammenlignet med ubehandlede AGS-celler transfektert med tom vektor. Det var en betydelig økning (p < 0,0001) i RKIP transkripsjon med H. pylori-infeksjon og
RKIP overekspresjon når sammenlignet med celler transfektert med RKIP uten infeksjon (fig. 3A). Vi gjentok disse forsøk, i nærvær av Bis for å hemme PKC-aktivitet for å bestemme økningen i RKIP transkripsjon var på grunn av fosforylering. I nærvær av den PKC-inhibitoren, H. pylori
økt RKIP transkripsjon og RKIP overekspresjon også resulterte i forbedring av RKIP promoter aktivitet. Bis redusert RKIP transkripsjon indusert av RKIP overekspresjon og H. pylori-infeksjon
større enn 4 ganger, sammenlignet med celler i RKIP med overekspresjon og antyder at disse effektene var avhengig RKIP fosforylering (fig. 3A). Vi undersøkte lokalisering av RKIP etter H. pylori
infeksjon. Immunoblotting subcellulære fraksjoner AGS celler demonstrerte at pRKIP er lokalisert til kjernen, mens RKIP forblir hovedsakelig i cytosol etter infeksjon (fig. 3B). Sammen utgjør disse dataene antyder at H. pylori
kan fremme translokasjon av pRKIP inn i kjernen hvor det kan aktivere RKIP transkripsjon.

H. pylori
indusert RKIP Fosforylering Avhenger H. pylori er CAG
patogenitet Island og RKIP Serine 153

For å vurdere rollen til spesifikke H. pylori
faktorer i fosforylering av RKIP, villtype H. pylori Hotell og isogene mutanter mangler hele CAG PAI eller
oipA
genet var co-dyrket med AGS celler i 6 timer. H. pylori
mutant mangler CAG PAI
var ute av stand til å indusere RKIP fosforylering, mens villtype flekken og oipA
mutant sterkt indusert RKIP fosforylering (fig. 4A). Den samme tendensen ble observert på STAT3 pY705. Disse resultatene tyder på at gener innenfor H. pylori er
cagPAI er nødvendig for induksjon av RKIP og STAT3 fosforylering.

For å undersøke om mutasjon av serin 153 påvirker H. pylori
formidlet RKIP fosforylering og transkripsjonen aktivering, AGS celler ble transient transfektert med en RKIP konstruere der serin ble byttet ut med valin i posisjon 153 (S153V) og deretter co-dyrket med H. pylori
. Nok en gang vi observert en større enn 16 ganger økning i RKIP promoter aktivitet i celler med RKIP overekspresjon og H. pylori
infeksjon (p < 0,0005). Men i celler transfektert med RKIP S153V før H. pylori
infeksjon, var det en 2,5 ganger reduksjon i transkripsjonen aktivitet (p < 0,0003) sammenlignet med H. pylori
infeksjon i villtype RKIP overekspresjon celler (fig. 4C). I tillegg overekspresjon av S153V RKIP hemmet H. pylori
formidlet RKIP fosforylering (Fig. 4B). Tatt sammen indikerer disse resultatene at fosforylering og transkripsjonelle aktivering av RKIP er avhengig H. pylori er
cagPAI og også på fosforylering av RKIP på S153.

H. pylori
infeksjon resulterer i RKIP Nedbrytning og Induksjon av Snail

Fordi økt RKIP transkripsjon indusert av H. pylori
infeksjon ble ikke assosiert med økt steady state total RKIP protein uttrykk, undersøkte vi om H. pylori
kan samtidig øke nedbrytningshastigheten av RKIP protein gjennom proteasom-mediert degradering, som tidligere er foreslått [35]. MG132 økte RKIP proteinnivåer i nærvær eller fravær av H. pylori
infeksjon, i samsvar med H. pylori
økende proteasomal RKIP degradering (Fig. 5A).

En annen mekanisme som kan forklare den manglende endring i RKIP protein eller mRNA uttrykk ville være transcriptional undertrykkelse av RKIP etter H. pylori
infeksjon. Sneglen er en transkripsjonsfaktor som spiller en viktig rolle i EMT [23] samt å være et kjent transcriptional repressor av RKIP i prostatakreftceller [25]. For å undersøke effekten av H. pylori
infeksjon på uttrykk for sneglen og RKIP, AGS celler ble dyrket med H. pylori
ved en MOI på 100. Snail mRNA uttrykk ble sterkt indusert etter 2-4 timer for infeksjon (Fig. 5D) Western blot analyse viste at H. pylori
infeksjon resulterte i en tid og doseavhengig økning i sneglen protein nivåer (Fig. 5B /C). Dette resultatet er ikke forenlig med våre data på RKIP transkripsjon etter H. pylori
infeksjon (Fig. 3) og antyder at H. pylori-infeksjon
kan ved induksjon av protein (er) som kan oppheve virkningen av sneglen på RKIP transkripsjon. Vi undersøker denne muligheten ved Mass spectometry analyse ved hjelp av foreldre og RKIP knockdown celler (Fig. 6).

RKIP Forbedrer H. pylori
formidlet apoptose

H. pylori
induserer gastrisk epitelial celle apoptose [8]. Siden RKIP kan fremme apoptose [29], undersøkte vi om induksjon av pRKIP etter H. pylori
infeksjon, kan være ansvarlig for H. pylori
indusert apoptose. AGS celler ble transient transfektert med RKIP eller en tom vektor, infisert med H. pylori
i 16 timer og apoptose evaluert via PARP-spaltning flowcytometri og DNA-fragmentering. I enkelte eksperimenter RKIP ble inhibert med lentivirus-mediert RKIP knockdown. Som vist på fig. 6A, H
. pylori
indusert spalting av PARP, en effekt som ble økt med ektopisk uttrykk for RKIP. Flowcytometri analyse indikerte at H. pylori
infeksjon resulterte i en ca 4 ganger økning i apoptose (p < 0,0008), RKIP overekspresjon, en 3-dobling (p < 0,003) og kombinasjonen en seks-dobling (p < 0,0005) sammenlignet med ubehandlede AGS-celler (fig. 6B). I ELISA-baserte DNA fragmentering analyse, økt apoptose aktivitet: 2,5 ganger (p < 0,000063) i celler infisert med H. pylori
; 1,8 ganger (p < 0,006) i celler transient transfektert med RKIP; og 3,5 ganger (p < 0,0007) med kombinasjonen (figur 6C.). For å avgjøre om RKIP var ansvarlig for H. pylori
formidlet apoptose, undertrykt vi RKIP uttrykk ved hjelp lentivirus-mediert RNA hemming og observert en reduksjon i RKIP protein nivåer av Western blot analyse viser reduksjon av RKIP i ubehandlet og H. pylori infiserte AGS celler (fig. 6D). I vårt DNA fragmentering analyse, foreldre AGS celler H. pylori-infeksjon
resulterte i en to-gangers økning (p < 0,0007) på apoptose (figur 6E.). I RKIP knockdown AGS celler, H. pylori
infeksjon resulterte i en 1,5 ganger økning i apoptose (p < 0,003) (Fig. 6E). Reduksjonen i apoptose mellom sperre og RKIP knockdown AGS-celler var statistisk signifikant (p < 0,0006). Disse resultatene indikerer at RKIP er nødvendig for H. pylori
formidlet apoptose.

Diskusjoner

Kronisk gastritt og endret mobilnettet omsetning indusert av H. pylori
infeksjon fremme utviklingen av distal adenokarsinom i ventrikkel [36]. H. pylori
kan regulere gastrisk epitel apoptose gjennom flere mekanismer. For eksempel, etter infeksjon og tilslutning til mage epitelceller, den CAG sekresjon system tjener til å endre intracellulær signaltransduksjon som resulterer i aktivering av NF-kB. NF-kB kan translocates til kjernen for å aktivere transkripsjon av pro-apoptotiske gener [37]. H. pylori
kan også indusere apoptose ved å øke ekspresjon av FAS og dets ligand (Fasl) som fører til aktivering av den ekstrinsiske reaksjonsvei apoptose [38]. Paradoksalt nok, H. pylori
kan også aktivere trasé som downregulate apoptose [39], særlig sent i løpet av kronisk infeksjon [40]. Denne adaptiv respons av epitelceller til å motstå apoptose i kronisk H. pylori
infeksjon kan bidra til å H. pylori
indusert magekreftutvikling [41]. Den apoptotiske respons av mage epitelceller til H. pylori
er også avhengig av stammespesifikke virulensfaktorer. For eksempel kan infeksjon med CAG PAI-positive stammer indusere apoptose hurtigere enn CAG PAI-negative stammer [42]. H. pylori Vaca
genprodukt som stimulerer den indre apoptotiske reaksjonsvei som fører til den mitokondrielle frigjøring av cytokrom c, og caspase-3-aktivering [43]. Vaca-indusert apoptose er assosiert med en reduksjon av STAT3 som fører til nedregulering av Bcl-2 og Bcl-X _{L [43]. I en annen studie ble det vist at H. pylori
induserer apoptose av en vei som involverer sekvensiell induksjon av apikal caspase-8 aktivitet, pro-apoptotiske proteiner Bad og Bud, caspase-9 aktivitet, og effektor caspase-3-aktivitet [44].}

vår studie beskriver en annen mekanismen som H. pylori
infeksjon kan fremme apoptose i magekreftceller, spesielt ved å fremme RKIP fosforylering. Evnen til å inhibere RKIP Raf /MAPK-signalisering [26], [27] og fremme apoptose er blitt godt dokumentert [29]. Samspillet av teser trasé og RKIP uttrykk nivåer har vært innblandet i mange trinn av tumordannelse og /eller progresjon [30]. Videre er overekspresjon av RKIP resulterer i hemming av metastasering og invasivitet i forskjellige tumormodeller [45] - [48]. Den underliggende mekanisme for den differensielle ekspresjonen av pRKIP og RKIP er ikke kjent. Vi hadde forventet at relativt høye nivåer av pRKIP etter smitte kan korrelere med lavere RKIP nivåer. Men vi fant ut at H. pylori
infeksjon resulterte i nedbrytningen av RKIP protein, muligens slik MAPK signal og apoptose induksjon i magekreft etter H. pylori
infeksjon. PKC-mediert fosforylering RKIP kan forstyrre muligheten for RKIP til å binde til Raf og inhibere MAPK signalering [31], men det har ikke tidligere vært noen rapporter om rollen til pRKIP i reguleringen av apoptose. Tidligere studier fra vårt laboratorium har vist at RKIP overekspresjon resultater i direkte aktivering av pro-caspase 8 [29]. Selv om phosphoryation resulterer i atom relocalization, etterfulgt av RKIP aktivering av sin egen transkripsjon, gjør nivået av RKIP protein ikke øke. Dette tyder på en annen mekanisme for RKIP regulering enn det som tidligere er rapportert. Vi er for tiden å undersøke mekanismen som pRKIP utløser apoptose i magekreftceller etter H. pylori
infeksjon.

Cag-positive H. pylori
betydelig oppregulere EMT-forbundet gener Snail, Slug og vimentin i forbindelse med induksjon av MMP-7, noe som tyder på en rolle for disse proteinene i magekreft utvikling [49]. I vår studie observerte vi den raske induksjon av pRKIP protein etter H. pylori
infeksjon, og en økning i RKIP transkripsjon, og en oppregulering av snegle mRNA og protein ekspresjon. Selv om sneglen ble identifisert som en transcriptional repressor av RKIP [25], vår studie viser at det trolig ikke har noen effekt på fosforylert form av RKIP, siden etter smitte vi ikke observere en undertrykkelse av RKIP transkripsjon.

Infeksjoner med cagPAI-inneha stammer av H. pylori
er forbundet med en sterkere betennelsesreaksjon i magen og utgjøre en større risiko for å utvikle magesår eller magekreft enn stammer som mangler CAG øya [36]. H. pylori
induserer en intens inflammatorisk respons og lokalt høye nivåer av flere cytokiner, inkludert interleukin 6 (IL-6) [34].

• PLoS ONE: Programmert Kjemoterapi for pasienter med metastaser unresectable Gastric Cancer
• PLoS ONE: kvantitativ måling av organiske syrer i vev fra magekreft Pasienter Indikerer Økt glukosemetabolismen i Gastric Cancer