PLoS ONE: Påvisning og karakterisering av metastatisk kreft celler i Mesogastrium av magekreft Pasienter

Abstract

Magekreft er den nest største årsaken til kreft død på verdensbasis. Her, foreslår en ny type av tumormetastase betegnet som metastaser V i magekreft. Metastase V er definert som utseendet av kreftceller i mesogastrium med perigastric fettvev. For å oppdage sin forekomst og karakterisere sin klinikk patologiske funksjoner, stort tverrsnitt analyse av mesogastrium vev fra 74 pasienter ble brukt. Metastase V ble påvist i en av 40 (2,5%) pasienter med tidlig magekreft, 8 av 34 (24%) pasienter med avansert magekreft. Gjennomsnittlig avstand fra metastaser V fra mage veggen var ca 2,6 cm. Metastase V var nært knyttet til tumor invasjonsdybde, sammen med en rekke positive lymfeknutemetastase. Prognosen for pasienter med metastaser V var signifikant ( P
< 0,05) verre enn de med tumorcelle-fri mesogastrium. Disse funnene tyder på at ved å bruke hel-sectional analyse, kan metastaser V påvises i mesogastrium av mage kreftpasienter, og antyder også at det kan være en risikofaktor for pasienten overlevelse etter radikal kirurgi

Citation. Xie D, Liu L, Osaiweran H, Yu C, Sheng F, Gao C, et al. (2015) Påvisning og karakterisering av metastatisk kreft celler i Mesogastrium av magekreft pasienter. PLoS ONE 10 (11): e0142970. doi: 10,1371 /journal.pone.0142970

Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, ​​Spania

mottatt: 28 juni 2015; Godkjent: 17 september 2015; Publisert: 13.11.2015

Copyright: © 2015 Xie et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Data Tilgjengelighet: All relevant data . er i avisen og dens saksdokumenter filer

Finansiering: Denne studien ble støttet av Science Foundation of China National, gi tall: 81572861; 81201638; 81302309; 81372324.

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Selv utført med kurativ hensikt og kombinert med neoadjuvant kjemoterapi, radikal kirurgi for avansert mage. kreft (gastrektomi med D2 lymphadenectomy) blir ofte etterfulgt av lokal-regional tilbakefall [1]. Faktisk omtrent 75-80% av tilfellene likevel ende opp med lokal-regional tilbakefall i 2 år etter operasjonen [2]. Lokal-regional tilbakefall etter kurativ radikal gastrektomi er den viktigste årsaken til dårlig prognose av magekreft [3].

I de siste tre tiårene, TME (totalt mesorectal excision) eller CME (komplett mesocolic eksisjon) kirurgiske prosedyrer for tykktarmskreft har redusert sjansene for lokale tilbakefall og økte med 5-års overlevelse [4,5]. Kirurgisk forskning har antydet at de antatte årsakene er bedre teknikker, dyktige kirurger med flere års praksis, avansert peri-drift ledelse, og komplett lymfeknute disseksjoner. På den annen side, er det fortsatt vanskelig å fullt ut forstå hvordan pasienter som fikk R0 reseksjon med iscenesettelsen av T2N0M0 og T3N0M0 har også lokale regionale tilbakefall, som kan variere fra 10% til 30% [6]. Dermed ingen eksakte årsaker eller grunnen til det har blitt grundig vist.

Direkte invasjon, lymfedrenasje, hematogenous spredning og peritoneal formidling er de fire klassiske ruter gjennom hvilke lokale regionale tilbakefall eller fjerne implantater av magekreftceller kan bestemmes. Hver av disse baner ligger i den spesielle hulrom. For eksempel er den direkte invasjon og peritoneal spredt plassert i den serøse hulrom; hematogenous metastase kan bli funnet i blodkar hulrom; i lymfatisk metastase, blir de kreftceller som ligger i hulrom i lymfekar og noder. Men i tillegg til disse banene, folk har også rapportert forskjellige metastatisk kreft celler i lokale perigastric fettvev [7-11]. Siden de ikke klarte å beskrive hulrommet disse vev ble plassert i, har metastaser blitt forklart som en tilfeldig hendelse, en og annen hendelse, eller en forveksles med en underliggende serøs spredning. Den "konvolutten" hypotesen om mesogastrium ble foreslått når en tidligere uidentifisert hulrom, omgitt eller omsluttet av riktig fascia, ble oppdaget med kreftceller som ligger og beveger seg i det [12]. Vi utpekt utseendet på disse kreftceller i mesogastrium med perigastric fettvev som metastaser V [12]. For å bekrefte vår hypotese, vi videre oppdaget forekomst og preget de patologiske kjennetegn ved metastaser V ved hjelp av store tverrsnitts vevsprøver av mesogastrium hentet fra mage kreftpasienter. Totalt 5,892 mesogastrium prøver seksjoner, hver med en tykkelse på 4 mikrometer, fra 74 pasienter ble analysert (figur 1A og 1B).

Materialer og metoder

Pasient, prøver, og den store tverrsnitts vevsprøve analyse

Sytti-fire pasienter som gjennomgikk kirurgi for primær magekreft ved Institutt for Gastrointestinal kirurgi, Tongji Hospital, Tongji Medical College i Huazhong University of Science and Technology mellom oktober 2012 og januar 2014 ble inkludert I denne studien. Pasientene besto av førtito mannlige og trettito kvinnelige pasienter med en gjennomsnittsalder på 52 (range, 23-72 år). Alle disse pasientene gjennomgikk laparoskopi assistert D2 + CME (komplett mesogastrium eksisjon) radikal gastrektomi med en helbredende R0 reseksjon, og hele operasjonen ble utført av professor Jianping Gong, sjef for GI kirurgi av Tongji Hospital, Huazhong University of Science and Technology. Alle deltakerne forutsatt informert skriftlig samtykke til å delta i studien. Denne studien ble godkjent av Tongji Hospital etikkomiteen.

mesogastrium prøver ble innhentet fra resected mage vev. I denne studien ble fire regioner i mesogastrium inkludert, og oppkalt mesogastrium av Venstre Gastroepiploic Vessels (mLGEV), mesogastrium av Høyre Gastroepiploic Vessels (mRGEV), meosgastrium av Høyre Gastric Vessels (mRGV) og mesogastrium av Venstre Gastric Vessels (mLGV) henholdsvis i henhold til de viktigste forsyne fartøy (figur 1A). Alle resekterte prøver ble fiksert i 10% nøytral buffret formalin i minst en time før noen manipulering av mesogastrium. Prøvene ble deretter rettet til å identifisere de respektive pedicles av mesogastrium, og nettstedene til primærtumor (øvre (U), midtre (M), eller lavere (L) deler, fremre eller bakre vegger, mindre eller større kurvaturer). Den nærmeste avstand mellom det primære tumor og hver mesenteriet ble målt og (Fig 1 A) registreres. De mesogastriums ble ekstrahert en bloc fra magen, rettet og målt for deres lengde og bredde. Prøvene ble skåret vinkelrett på veggen i magesekken på 1 cm intervaller, og organisert i et proksimalt til distalt mønster som er merket med romertall (figur 1B). Hver strimmel ble skåret i terninger parallelt med veggen i magesekken på 1 cm intervaller. Kubusene ble så sekvensert i radielle mønstre som er merket og nummerert ved anvendelse av standardtall. Kubene ble satt til innebygging av kassetten, som er lagret i 10% nøytral buffret formalin og overføres til histopatologi laboratoriet for videre prosessering og stor serie snitting. Totalt 5,892 deler, hver 4 mikrometer tykt, ble fjernet fra de 74 pasienter, med et gjennomsnitt på 80 blokker (range, 13-136) per pasient. Alle blokkene ble utsatt for hematoksylin-eosin farging og immunhistokjemi. Tabell 1 viser de kliniske og patologiske kjennetegn ved de 74 pasientene i vår studie. Clinicopathological data ble analysert i henhold til syvende utgaven av AJCC Cancer Staging Manual.

For overlevelsesanalyse, totalt seksti-sju pasienter som fikk laparoskopisk D2 gastrektomi pluss komplett mesogastrium eksisjon med kurativ R0 reseksjon mellom februar 2009 til juni 2012 ble inkludert. Hele operasjonen ble utført av professor Jianping Gong. Etter kirurgisk reseksjon, alle pasienter gjennomgikk en oppfølging, med median oppfølging på analyse være 47 måneder for alle pasienter. Oppfølgingen program for postoperativ overvåking besto av fysisk undersøkelse, blodkjemi inkludert CEA, computertomografi, og ultralyd utføres hver 3. måned for å diagnostisere tilbakevendende sykdommer.

Immunohistochemistry og definisjon av metastaser V i mesogastrium

Immunohistochemistry ble utført ved hjelp av cytokeratin AE1 /AE3 antistoff, et monoklonalt antistoff som reagerer på epitelial tumorceller fra gastrointestinale organer og har vist seg å være en svært sensitiv markør for mage kreft.

Farging ble utført i henhold til standarden streptavidin-biotin-metoden. Kort fortalt ble seksjonene deparaffinized og utvannet, og endogen peroksidase ble hemmet med 0,3% H _{2o 2. For antigen gjenfinning ble snittene kokt i 0,01 M, pH 6,0 natriumsitrat-buffer i 15 minutter i en mikrobølgeovn. Etter blokkering med 5% normalt geiteserum i 30 minutter, den primære anti-cytokeratin AE1 /AE3 monoklonalt antistoff (1: 100) var nå i å blokkere buffere og delene ble inkubert ved 4 ° C over natten. Peroxidase /DAB, kanin /mus, DAKO fra EnVision ™ Detection Systems ble brukt i de følgende trinnene. Seksjonene ble kontra med Mayers hematoksylin, dehydrert i en gradert alkohol serie, ryddet i xylen, og montert. Metastase V er definert som tilstedeværelse av isolerte kreftceller i mesogastrium som er diskontinuerlige fra primær lesjon og ingen lymfeknuter oppdaget på samme lysbilde, som oppdaget av HE farging og farging for cytokeratin AE1 /AE3.}

immunhistokjemi bildeanalyse

intensiteten av reaksjonsproduktet av E-cadherin og DAB2IP immunhistokjemi ble målt semi-kvantitativt ved hjelp av image Pro Plus Software 6.0 (Media Cybernetics, CA, USA). Denne prosedyren kan deles inn i syv ulike trinn: 1. Opprette og måle arealet av interesse (AOI); 2. kalibrering av den optiske tetthet; 3. anskaffe, konvertering og lagring av bilder; 4. utføre bakgrunnen og bakgrunnsfarging korreksjon; 5.setting av AOI i den kjøpte bildet for å måle optisk tetthet; 6.measuring tetthet; 7.creating makroer [13].

Statistical Analysis

statistiske analysene ble utført av SPSS versjon 17.0. Beskrivende data ble presentert som gjennomsnitt ± SD. X ^{2 testen, Fishers eksakte test ble brukes til å bestemme betydningen av forskjellene mellom kovariatene. Overlevelsesvarigheter ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og ble analysert ved log-rank test for å sammenligne den kumulative overlevelses varighet i pasientgrupper. Overlevelseskurven ble beregnet fra datoen for operasjonen. Den Cox modellen ble brukt til å beregne univariate og multivariate farer forholdstall for studieparametere. For alle testene, ble en P-verdi mindre enn 0,05 anses å være statistisk signifikant.
Diskusjon}

Påvisning av metastaser V

metastaser V ble oppdaget

Resultater og i ni av totalt 74 (12%) pasienter med H & E farging og farging (fig 1 C), inkludert en av 40 (2,5%) pasienter med tidlig magekreft, 8 av 34 (24%) pasienter med avansert magekreft (tabell 2). Disse isolerte kreftceller er diskontinuerlig fra den primære lesjonen og ingen lymfeknuter ble observert i samme sleiden (figur 1C). Klinikken patologiske trekk ved metastaser V-positive pasienter ble vist i tabell 2. Av disse pasientene hadde fem dårlig differensiert adenokarsinom og fire hadde moderat differensiert adenokarsinom. I forhold til dybde av tumor invasjon, tumor to hadde gjennomtrengning av serosa, seks hadde en sub-serøse invasjon, og man hadde en sub-slimhinne penetrasjon (tabell 2). Selv om åtte metastase V-positive pasienter hadde positiv lymfeknutemetastase, ble en metastaser V-positiv pasient uten lymfeknutemetastase også identifisert.

Distribusjon og avstand av metastaser V

For å identifisere fordelingen av metastase V, analyserte vi forholdet mellom lokalisering av metastaser V og den primære tumor lesjoner, samt avstanden av metastase V fra mage-veggene. Av disse ni Metastase V-positive pasienter, ble plasseringen av Metastase V i forhold til primærtumor hos fem pasienter detektert i mLGV nær den venstre gastrisk arterie (lymfeknute No. 7 stasjon), den vanlige leverarterien (lymfeknute No. 8 stasjon) og cøliaki bagasjerommet (lymfeknute nr 9 stasjon) (figur 2). De resterende fire ble funnet i mRGEV nær infropyloric lymfeknuter (nr 6 stasjon) (fig 2). Interessant, ble lesjoner av metastaser V finnes i både mLGV og mRGV nær suprapyloric lymfeknuter (stasjon) i en pasient (pasient 5 av figur 2).

Den midlere avstand metastaser V fra mage veggen var omtrentlig 2,6 cm (range, 1-8 cm) (fig 1D). Det område av avstander fra Metastase V fra mageveggene var 1-3 cm i 8 av de 9 pasienter forvente en pasient (Pasient 8) hvor avstanden var 8 cm. Dette kan være på grunn av mesogastrium i bukhulen forlenge ut og endring fra en tredimensjonal form når reseksjon av kirurgen.

Sammenheng mellom metastaser V og kliniske faktorer

De demografiske kjennetegn ved pasientene og de patologiske trekk ved svulster med spredning V, både positive og negative, er vist i Tabell 3. forekomsten av metastaser V var nært knyttet til dybden av primærtumorinvasjon. Metastase V var hyppigere i svulster invadere subserosal (6/20 svulster; 30%) eller serøse laget (2/4 svulster, 50%) sammenlignet med svulster som invaderer submucosa lag (1/40 svulster, 2,5%), noe som var statistisk signifikant (P = 0,001). Dessuten, lymfeknutemetastase ble også tett forbundet med metastase metastase V. V var mer hyppig som antallet lymfeknutemetastase øket (N0: 1/45, 2,2%; N1: 4/18, 22,2%, N2: 1/6 , 16,7%, N3: 3/5, 60%; henholdsvis p = 0,001). Dårlig differensierte svulster var mer sannsynlig å ha metastaser V, men er ikke statistisk signifikant (p = 0,489). Det var ingen signifikante forskjeller mellom metastase V-positive og metastase V-negativer i forhold til kjønn, alder, tumorstørrelse, svulst plassering og histologiske undergrupper (Tabell 3 og S1 Table).

Survival

Basert på våre oppfølgingsdata, prognosen for alle metastase V-positive pasienter var signifikant (p = 0,006) dårligere enn metastase V-negative pasienter (fig 3A). I tillegg, analyserte vi prognostisk betydning Metastase V i de forskjellige tumor undergruppene (T2, T3 og T4) eller kliniske trinn (II og III). Prognosen for pasienter med metastase V-positiv var vesentlig dårligere enn dem med Metastase V-negativ i T3 gruppen (p = 0,004, fig 3B) eller i klinisk stadium II (P = 0,0005, fig 3C), mens ingen signifikant forskjell i prognosen ble funnet mellom metastase V-positive og metastase V-negativer i T2, T4 undergrupper eller i stadium III (data ikke vist). Vi vurderte også prognostiske faktorer som påvirker total overlevelse. Ifølge en univariat analyse, ble størrelsen diameter (P = 0,02), Laurén klassifisering (P = 0,01) og metastase V (P = 0,002) signifikant korrelert med pasientens overlevelse (S2 tabell). I en multivariat analyse ble metastaser V (P = 0,037) funnet å være uavhengige prognostiske faktorer (S3 tabell).

DAB2IP og E-cadherin er nedregulert i metastaser V

For å evaluere den kliniske betydningen av resultatene og utvikle potensielle terapeutiske mål for metastaser V, var det nødvendig å undersøke de underliggende molekylære mekanismene. E-cadherin er å anse som en stor markør for EMT (epitelial-til-mesenchymale overgang), kjent som en kritisk prosess i biologi of cancer metastase [14]. Våre tidligere studier vist at tapet av DAB2IP uttrykk initiert EMT og fremmet tumorinvasjon og metastase [15]. I denne studien ble det mesogastrium metastase og dens matchende primærtumor og tilstøtende normalt vev immunostained for DAB2IP og E-cadherin. Våre resultater viste at ekspresjon av både DAB2IP og E-cadherin avtok i mesogastrium metastaser sammenlignet med det i det tilpassede primærtumor og de tilstøtende normalt vev (figur 4), noe som tyder på at DAB2IP regulerte EMT kan spille en rolle i Metastase V . Siden nedstrøms DAB2IP-mediert Wnt veien er aktivering av transkripsjonsfaktorer som ß-catenin og p65, vi også oppdaget uttrykk for ß-catenin og p65. Våre resultater viste at ekspresjon av både P-catenin og p65 øket (så vel som nukleære lokaliserings) i mesogastrium metastaser sammenlignet med det i primærtumor (S1 Fig). De nøyaktige reguleringsmekanismer, men må undersøkes nærmere.

Diskusjoner

I vår studie, er det klart at metastatiske kreftceller ligge i fettvev rundt magen av magekreft pasient. Disse magekreft med spredning celler viste tre primære egenskaper: (1). de befinner seg i adipose vev og adskilt fra den primære tumor; (2). det var ingen strukturer av blodkar, lymfeknuter eller andre fartøyer rundt disse metastatiske celler (figur 1C); (3). adipose vev ble omsluttet av riktig fascia. Disse egenskapene vist at denne type metastaser var forskjellig fra de fire klassiske typer metastaser, inkludert direkte invasjon, serøs spredning, lymfatisk metastaser eller hematogenous spredning. Siden det var en ny vei, vi betegnet det, for øyeblikket, som Metastase V [12]. De metastatiske kreftceller sprer seg oftest innen forskjellige hulrom av forskjellige krefter, for eksempel, sprer hematogenous metastaser i blodkar hulrom drevet av sirkulasjon av blodet, sprer lymfeknutemetastaser i det lymfatiske hulrom drevet av sirkulasjonen i lymfesystemet strømmen, mens direkte infiltrasjon og serøs sprer er i serøse hulrom som viser en fri selvstendig spredning eller bevegelse. Vår tidligere data antydet at metastaser V ble observert å spre innenfor riktig fascia hulrom, og dataene fra denne studien foreslår videre at DAB2IP-mediert EMT kan være involvert i metastaser V sprer seg gjennom fettvev (fig 4).

Metastase V var nært korrelert med tumorinvasjon dybde i magesekken. Våre data viser at de fleste tilfeller av metastaser V skjedde i T3 eller T4A svulster, selv om noen også skjedde i T1 svulster (tabell 2). Metastase V ble også korrelert med lymfatisk metastasering. Lymfeknuter staging N1-N3 hadde større prosenter av metastaser V enn N0, og selv om N0 hadde tilfeller av metastaser V (tabell 3). Videre prognosen for pasienter med metastaser V-positive tumorer var betydelig dårligere enn de med metastaser V-negative tumorer, spesielt i T3 eller stadium II (figur 3). På grunn av begrenset antall pasienter i studien, bør et større utvalg av kohorten pasienter være registrert for videre analyse. Disse funnene tyder på at påvisning av metastaser V har en dårlig prognostisk betydning hos pasienter som gjennomgår en kurativ reseksjon. Siden D2 radikal gastrektomi kan bare i begrenset grad forbedre overlevelsen av avansert magekreftpasienter, påvisning av metastase V i mesogastrium resekterte bør være en effektiv metode for utvelgelse av pasienter for ytterligere terapeutisk kjemoterapi eller andre mål terapier. Den eksakte ruten eller mekanisme av metastaser V er ikke klart. Det antas at når den primære svulsten invaderer mage veggen til en viss grad, tumorceller frafalt fra hovednettstedet mulig på grunn av DAB2IP regulerte EMT mekanisme, og deretter spredt blant fettvev i riktig fascia hulrom mesogastrium som løgner mellom magen og mesenterium [12].

Metastase V er ikke begrenset bare til magekreft, men kan også foreligge i mange andre krefttyper som stammer fra forskjellige vev, inkludert kreft i endetarmen, nephrogenic adenom, et al [16,17 ]. I vår studie var det en insidens på 24% av metastaser V avansert magekreft, og en slik andel kan forventes å øke når større tverrsnitt av ett lysbilde per 0,5 eller 0,25 cm er gjort.

Selv om andre har vist, gjennom store seriesnitt av mesogastrium av større eller mindre krumninger, at forekomsten av tumorknuter i mesogastrium kan være så høy som 8% [11], er de patologiske trekk og forekomsten av metastase V ikke fullt ut undersøkt. For det første, på grunnlag av embryonale anatomi, jo større omentum og den mindre omentum er ikke fullt ut mesogastrium. Mesogastrium bør ha to egenskaper: den ene er at den skal være plassert langs kanten av magen, den andre er at den skal omslutte de viktigste blodkar mesenteriet som kobler dem til vedlagte organer. I vår studie ble fire regioner i mesogastrium resected ved laparoskopi assistert D2 + CME (komplett mesogastrium eksisjon) radikal gastrektomi, og hver region ble kåret henholdsvis mLGEV, mRGEV, mLGV, mRGV (fig 1A). Vi videre analysert for lokalisering av metastaser V innenfor ulike områder av mesogastrium. Våre data viser at mLGV og mRGEV er oftere detektert med Metastase V enn andre mesogastrium (figur 2), noe som innebærer klinikken betydningen av disse to deler under radikal gastrektomi. Videre studier av avstanden til metastaser V fra mage veggene foreslo utvalget eller lengden på mesogastrium skal resected under radikal kirurgi (Fig 1D).

Det har vært godt kjent i praksis at radikal kirurgi for kreft bør inkludere en bloc reseksjoner av primærtumor og nabo vev. Imidlertid er det vanskelig å forstå nøyaktig grensene for en bloc reseksjon fører til en mer komplett lymphadenectomy blir gjennomført. Modellen av metastaser V innen mesogastrium som er omsluttet av den riktige konseptet foreslår en presis grense og patologisk retning som ikke kan dekkes av modellen av lymphatic metastasering. Videre våre funn er klinisk signifikant fordi metastasering gjennom denne veien alltid krever kirurgisk inngrep som behandling av valget. Gitt at lokal-regional tilbakefall kan være nært forbundet med spredning V, bør fullstendig mesogastrium eksisjon (CME) oppnås sammen med gastrektomi og D2 lymfeknute disseksjon for å redusere forekomsten av lokal-regional tilbakefall i magekreft [18]. En randomisert kontroll studie (NCT01978444) pågår nå i vår avdeling for å evaluere den kliniske betydningen av kirurgisk fjerning av metastaser V.

Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Sammenheng mellom metastaser V og histologiske undergrupper (N = 74)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0142970.s001 plakater (docx)
S2 Table. Univariat analyse for faktorer som påvirker total overlevelse i 67 pasienter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0142970.s002 plakater (docx)
S3 Table. Multivariat analyse for faktorer som påvirker total overlevelse i 67 pasienter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0142970.s003 plakater (docx)
S1 Fig. . Uttrykk av p65 og β-catenin i normal mageslimhinnen, primære mage svulster og metastase V innenfor mesogastrium
representant IHC farging for p65 og β-catenin fra samme pasient
doi:. 10,1371 /journal.pone. 0142970.s004 product: (TIF)

takk

Vi takker Xiaolan Li for teknisk support og Sanpeng Xu for patologisk analyse. Vi takker også Ernest Johann for redaksjonell bistand.

• PLoS ONE: Antidepressiva og Gastric Cancer: En Nationwide populasjonsbasert Nøstet Case-kontroll Study
• PLoS ONE: PFTK1 Fremmer Gastric Cancer Progresjon ved å regulere spredning, migrasjon og Invasion