Stomach Health > magen Helse >  > Gastric Cancer > magekreft

PLoS ONE: Antrakinon G503 induserer apoptose i Gastric kreftceller gjennom mitokondrie Pathway

Abstract

G503 er en anthraquinone sammensatte isolert fra de sekundære metabolitter av en mangrove endophytic sopp fra Sør-Kinahavet. Den foreliggende studien belyser den anti-tumor-aktivitet og den underliggende mekanisme av G503. Celleviabilitet analysen ble utført i ni cancercellelinjer og to normale cellelinjer viste at magekreft cellelinje SGC7901 er de G503-sensitive kreftceller. G503 indusert SGC7901 celledød via apoptose. G503 eksponerings aktivert caspases-3, -8 og -9. Forbehandling med pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK og caspase-9-hemmer Z-LEHD-FMK, men ikke caspase-8 inbibitor Z-IETD-FMK, svekket effekten av G503. Disse resultatene antydet at den indre mitokondrie apoptose vei, snarere enn den ytre vei, var involvert i G503-indusert apoptose. Videre økte G503 forholdet mellom Bax til Bcl-2 i mitokondriene og minsket forholdet i cytosol. G503 behandling resulterte i mitokondrie depolarisering, cytokrom c frigivelse og den etterfølgende spaltning av caspase -9 og -3. Videre er det rapportert at det endoplasmatiske retikulum apoptose sti kan også aktiveres ved G503 ved å fremkalle Capase-4 cleavage. I betraktning av den nedre 50% hemmende konsentrasjon for mage kreftceller, kan G503 tjene som en lovende kandidat for magekreft kjemoterapi

Citation. Huang L, Zhang T, Li S, Duan J, Ye F, Li H, et al. (2014) Antrakinon G503 induserer apoptose i Gastric kreftceller gjennom mitokondrie Pathway. PLoS ONE ni (9): e108286. doi: 10,1371 /journal.pone.0108286

Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania

mottatt: 19 april 2014; Godkjent: 19 august 2014; Publisert: 30.09.2014

Copyright: © 2014 Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer

Finansiering: Denne studien ble støttet av National Nature Science Foundation of China, Grant Nummer:. 30973449, 81172163, 81272515, 81272338, 81200706, National Key Sci-Tech spesielt prosjekt i Kina, Grant Nummer: 2009ZX09103-642, 2013ZX09102053; Program for doktorgrads Station i University, Grant Nummer: 20120171110053, 20130171110053; Key Prosjekt of Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina, Grant Antall Nature: 10251008901000009; Key Sci-Tech Research Project i Guangdong-provinsen, Kina, Grant Nummer: 2011B031200006; Guandong Natural Science Fund, Grant Nummer: S2012010009250, S2012040006986; Key Sci-Tech Research Project of Guangzhou kommune, Kina, Grant Nummer: 2011Y1-00017-8, 12A52061519; Program for Young Lærer i University, Grant Nummer: 10YKPY28; Changjiang Forskere og Innovativ Research Team i Universitets, antall:. 985 prosjekt PCSIRT 0947. De bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser: The forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.

Innledning

kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi er de primære kliniske kreftbehandlinger. Men, kirurgi og strålebehandling er ineffektive i metastatisk kreft; Hvis kjemoterapi brukes riktig, kan metastase hemmes [1]. Med hensyn til anti-kreft legemiddel utvikling, antracykliner har de mest effektive anti-cancer medikamenter [2]. Naturlige produkter fra havet er viktige kilder til nye kreftmedisiner [3]. Marine mikroorganismer metabolitter med unike strukturer og farmakologiske aktiviteter er vanligvis brukt som fører antitumorforbindelsene [4]. Antrakinon-forbindelser, så som daunorubicin, doksorubicin, epirubicin og mitoksantron, er de mest effektive klinisk anti-kreft legemidler [2]. Den marine antrakinon SZ-685C undertrykker proliferasjon av human brystcancer [5] - [6] og human nasofaryngeal carcinom (NPC) celler [7]. Huang et al. vist at antrakinoner fra rabarbra, slik som emodin, aloe-emodin og rhein, hemmer veksten og proliferasjonen av forskjellige kreftceller, for eksempel lunge adenokarsinom, myelogen leukemi, neuroblastom, leverkreft, blærekreft og andre [8].

mekanismen for antitumoraktivitet av antrakinoner er først og fremst involvert i følgende aspekter [9] - [10]: DNA-interaksjoner gjennom binding, interkalerende og forstyrrer separering av DNA-dobbeltkjede; direkte membran effekter; DNA-skade som følge av topoisomerase II-inhibering eller generering av frie radikaler, slik som reaktive oksygenarter (ROS) og induksjon av apoptose via topoisomerase II-hemning, funksjonell p53 eller ROS generasjon. I tillegg antrakinoner også utløse apoptose gjennom JNK (c-Jun N-terminal kinase) [11], Akt /PKB (proteinkinase B) [5], [12] og mitokondrielle trasé [13] -. [14]

G503 er en anthraquinone sammensatte isolert fra de sekundære metabolitter av mangrove endophytic sopp nr 1403 fra Sør-Kinahavet [15] .Men om G503 besitter kreft potensial som anthraquinone forbindelsen har ikke blitt undersøkt. Derfor denne studien var designet for å belyse den anti-tumor aktivitet av G503 og den underliggende mekanismen involvert.

Materialer og metoder

Kjemikalier og reagenser

3- (4 , 5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-diphenylterazolium-bromid (MTT) og ROS scavenger N-acetyl-cystein (NAC) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Hochest 33342, karboksy-H2DCFDA, MitoProbe DiOC2 (3) Assay Kit og MitoProbe Transition Pore Assay Kit (M34153) ble oppnådd fra Invitrogen (USA). Annexin V-FITC (fluoresceinisotiocyanat) /PI (propidiumjodid-) Apoptose Detection Kit ble kjøpt fra Keygen (Nanjing, Jiangsu, Kina). RPMI1640 medium og fosterets bovint serum (FBS) var fra Hyclon (Logan, UT, USA ).
Caspase-8 inhibitor Z-IETD-FMK, caspase-9-hemmer Z-LEHD-FMK og caspase-familien inhibitor Z-VAD-FMK var fra Calbiochem (Gibbstown, NJ, USA) og Beyotime (CHINA). Antistoffer mot caspase-3, caspase-4, caspase-8, caspase-9 og COXIV antistoff var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Antistoffer mot cytokrom c
, Bax, BCL-2, p38, p-p38 og anti-geit LGG-HRP var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Mouse anti-β-aktin og anti-GAPDH primære antibodywere fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Anti-kanin IgG-peroksidase og anti-mus IgG-peroksydase var fra Vector (Burlingame, CA, USA) .Mitochondria isolasjonssett ble kjøpt fra Pierce (Pierce, IL, USA), proteinanalysesett ble kjøpt fra Bio-Rad (Hercules , CA, USA), og ECL deteksjon kit var fra Applygen Technologies Inc (Beijing, Kina).

gjæring, utvinning og isolering av G503 fra Nigrospora
sp. No. 1403

NO.1403 ble isolert fra råtten tre av Kandeliacandel product: (L.) Druce og reidentified som Nigrospora
sp. (Genebank sjonsnummer: HQ891110), samlet inn fra Mai Po, Hong Kong, og en saltsjø i Bahamas. G503 ble isolert og renset fra de sekundære metabolitter av NO. 1403 [15]. Startkulturer ble opprettholdt på cornmeal sjøvann agar. Plugger av agar som støtter mycelvekst ble kuttet og overført aseptisk til en 250 mL Erlenmeyerkolbe inneholdende 100 ml flytende medium (glukose 10 g /l pepton 2 g /l, gjærekstrakt 1 g /l, NaCI 2 g /L, pH 7,0 d). Kolben ble inkubert ved 28 ° C. Etter rysting på en rotasjonsrister i 3-5 dager, ble mycel aseptisk overført til en 500 ml Erlenmeyer kolbe inneholdende kulturmedium (200 ml). Kolben ble deretter inkubert ved 28 ° C i 25 dager.

kulturer (150 L) ble filtrert gjennom osteklede. Filtratet ble konsentrert til 5 l under 50 ° C og ekstrahert tre ganger ved risting med et likt volum av etylacetat. De samlede organiske ekstrakter ble underkastet en silikagel-kolonne og eluert med en gradient av petroleter til etylacetat for å gi forbindelsen.

Forbindelsen ble løst i dimetylsulfoksid (DMSO) ved en konsentrasjon på lager 50 mmol /l og fortynnet til bestemte konsentrasjoner før bruk

Cellekultur kultur~~POS=TRUNC

HUVECs ble isolert fra de humane umbilikalvene snorer av normale parturitions og dyrket følge en protokoll som er beskrevet tidligere [16] -. [ ,,,0],17]. Chang leverceller og tumorcellelinjer Hone-1, CNE-2, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, PC3, A549 og SGC7901, AGS ble opprettholdt ved vårt laboratorium og dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS, 100 U /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin (Gibco) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO 2. Denne studien er i samsvar med prinsippene i Helsinkideklarasjonen, godkjent av Medical Ethics Committee of Sun Yat-Sen universitetet og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra donor.

Celleviabilitet analysen

celler ble sådd ut ved en tetthet på 2 x 10 4 celler /ml i 24-brønners plater (HUVECs ble sådd i gelatin-belagte 24-brønners plater). Når cellene oppnådde en tetthet på 60% -70%, ble de behandlet med forskjellige konsentrasjoner av G503 i 48 timer i RPMI 1640 medium (1 ml /brønn) uten FBS; de negative kontrollgruppene ble behandlet med PBS. Deretter ble 100 ul MTT (5 mg /ml) oppløst i PBS tilsatt til hver brønn og inkubert i ytterligere 4 timer for å tillate dannelse av formazancrystals. Krystallene ble oppløst i 1 ml DMSO i hver brønn. Den optiske tetthet (OD) verdier av den lilla løsning som representerte cellelevedyktighet ble målt ved 570 nm [18] - [19]. Etter tre uavhengige eksperimenter, ble celleoverlevelse beregnet ved hjelp av følgende formel: overlevelse (%) = (midlere OD eksperimentell verdi /bety kontroll OD verdien) x 100%. Verdiene ble uttrykt som den 50% hemmende konsentrasjon (IC 50), som ble beregnet ved regresjon fremgangsmåten i det lineære området.

Hoechst 33342 fargingsanalyse

SGC7901 celler ble platet i 6-brønns plater ved en tetthet på 10 5 celler per brønn og behandlet med G503 konsentrasjoner i området fra 0 ^ mol /L til 40 pmol /l i 24 timer. Cellene ble merket med 10 ug /ml Hoechst 33342 [20] i 10 minutter ved 37 ° C og observert ved hjelp av fluorescensmikroskopi (Olympus X71-A12FL /PH).

Annexin V-FITC /PI farging assay

SGC7901 celler ble samlet opp ved en tetthet på 5 x 10 5 til 5 x 10 6 /ml etter G503 behandling ved konsentrasjoner i området fra 0 ^ mol /L til 40 pmol /l i 24 timer i 6-brønners plater; celler behandlet med 25 umol /L kolkisin ble anvendt som positiv kontroll. Cellene ble deretter vasket og farget i henhold til produsentens instruksjoner (Annexin V-FITC /PI apoptose Detection Kit). I korthet ble cellene resuspendert i 500 pl 1 x bindingsbuffer. Deretter ble 5 ul AnnexinV-FITC og 5 ul 20 ug /ml PI tilsatt til prøve og inkubert ved værelsestemperatur i 15 min i mørket. De fargede Prøvene ble deretter vurdert av flowcytometri (Becton Dickinson, NJ, USA) for å identifisere apoptotiske celler.

Fastsettelse av mitokondriell membranpotensiale

SGC7901 celler ble sådd ut i 6-brønners plater. Ved å oppnå en tetthet på 60%, ble cellene behandlet med 20 umol /L G503 i 18 timer og deretter oppsamlet for å vurdere mitokondriemembranpotensialet i henhold til produsentens anbefalinger (MitoProbe DiOC2 (3) Assay Kit). I korthet, ble 1 x 10 6 /ml celler ble resuspendert i 37 ° C PBS. De positive kontrollgrupper ble forbehandlet med 1 pl 50 mmol /L CCCP ved 37 ° C i 5 minutter. Alle gruppene ble deretter behandlet med 5 ul av 10 umol /l DiOC 2 (3) i 30 minutter ved 37 ° C og evaluert ved flow cytometri. Den mitokondriemembranen potensialet ble beregnet på grunnlag av følgende ligning:. Mitokondriemembranpotensiale = (rød fluorescens intensitet) /(grønn fluorescens intensitet)

Deteksjon åpningen av mitokondrier Permeabilitet Transition Pore (MPTP)

SGC7901 celler ble sådd ut i 6-brønns plater. Ved å oppnå en tetthet på 60%, ble cellene behandlet med 20μmol /l G503 i 18 timer og oppsamlet for å vurdere MPTP åpning ved strømningscytometri (Becton Dickinson, NJ, USA) i henhold til produsentens protokoll (MitoProbe Transition Pore Assay Kit). Kort beskrevet, ble hver prøve delt i 3 porsjoner og behandlet som følger: aliquot 1 ble behandlet med 5 pl 2 umol /L Calcein AM i mørket; delmengde to ble behandlet med 5 mL Calcein AM og 5 pl 80 mmol /L CoCl 2 i mørket; og aliquot 3 ble behandlet med 5 ul Calcein AM, 5 ul CoCl 2 og 5 pl 100 umol /L ionomycin. Alikvotene ble deretter inkubert ved 37 ° C i 15 minutter i mørket. Etter å ha blitt vasket med HBSS /Ca 2+ og re-suspendert i 400 mL HBSS /Ca 2+, cellene ble bestemt ved flowcytometri innen 1 time. MPTP åpning tilstand er beregnet som følger: (fluorescens av aliquot 2- fluorescensen av alikvoten 3) /(fluorescensen av alikvoten 1- fluorescensen av alikvot 3). Calcein AM penetrerer cytoplasma og organeller inkludert mitokondriene. CoCl 2 slukker Calcein AM fluorescens i cytoplasma, men ikke i mitokondriene. Calcein AM translocates til cytoplasma fra mitokondrier når MPTP er åpnet, og den fluorescens blir dempet av CoCl 2.

Isolering av celle mitokondrier og cytoplasma

SGC7901 celler ble sådd ut i 100 mm-plater; hver gruppe ble belagt i to plater. Etter å ha oppnådd 60% -70% konfluens, ble cellene behandlet med eller uten 20 umol /L G503 i 18 timer. Etter behandling ble mitokondrie og cytoplasmatiske fraksjoner oppnådd i henhold til produsentens instruksjoner (Mitokondrier isolasjon kit).

Western blotting-analyse

Som beskrevet tidligere, ble cellene lysert i RIPA buffer [21] . Proteinkonsentrasjonene i mitokondriene, cytoplasma og hel-celle ble detektert ved BCA-metoden ved bruk av Bio-Rad proteinanalyse kit. I alt ble 60 ug proteiner fra hver gruppe adskilt med 12% eller 15% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). De proteiner fra SDS-PAGE ble overført til en PVDF-membran. Etter at de ikke-spesifikke bindingsseter på membranene ble blokkert i 1-2 timer ved romtemperatur med TBST-buffer inneholdende 10% ikke-fettholdig melk, ble membranene inkubert over natten ved 4 ° C med primært antistoff i henhold til produsentens instruksjoner. De sekundære antistoffer med eller uten fluorescens konjugert til de aktuelle primære antistoffer ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Membranene med fluorescerende sekundære antistoffer ble vurdert ved hjelp av Odyssey system (Li-COR, Nebraska, USA) for å skanne fluorescerende band [22], og membranene med normale sekundære antistoffer ble visualisert ved hjelp av ECL deteksjon kit for immunoblotter. Membranene ble strippet og re-probet med β-aktin eller COXIV antistoffer. β-aktin ble benyttet som intern standard for den totale cellelysat og cytoplasmiske ekstraksjoner, mens COXIV ble brukt som kontroll for mitokondrie ekstraksjoner. Densitometrisk analyse av båndene ble utført ved hjelp Antall One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) [23].

Statistisk analyse

Alle data ble presentert som betyr ± SD minst tre eksemplarer bestemmelser . SPSS 13,0 programvare ble benyttet for t-test og enveis variansanalyse (ANOVA) i alle statistiske analyser. En P
verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant i alle tilfeller.

Resultater

G503-mediert hemming på spredning er den mest potente i SGC7901 celler blant de 11 cellelinjer undersøkt

Vi brukte MTT analyse for å bestemme hvorvidt den antrakinon-forbindelsen G503 er cytotoksisk i de følgende cellelinjer: to normale cellelinjer (human navlestrengvene endotelialceller (HUVECs) og Chang leverceller og ni tumorcellelinjer (HONE -1, CNE-2, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, PC3, A549 og SGC7901). Alle celler ble inkubert med 0, 2,5, 5, 10, 20 eller 40 umol /L G503 i 48 timer. Celle viabilities ble målt ved anvendelse av MTT-analysen som nevnt, og IC 50 verdi for SGC7901 celler var den laveste, mens IC 50 verdiene for de normale cellelinjer, HUVEC og Chang leverceller, var signifikant høyere enn SGC7901 ( Tabell 1).

G503 induserer apoptose i SGC7901 og AGS mage kreftceller
Gitt at SGC7901 cellelinjen var den mest følsomme for G503 av de elleve cellelinjer

undersøkt (tabell 1), vi ytterligere undersøkt denne cellelinjen separat. SGC7901-celler ble farget med Hoechst 33342 for å bestemme hvorvidt den hemmende effekten var knyttet til apoptose. Resultatene viser en økning i antall celler som viser atom krymping og kromatin kondensasjon med økende G503 konsentrasjoner (Figur 1a). I tillegg, for å undersøke hvorvidt G503 induserer apoptose i andre gastrisk cancer cellelinjer, ble AGS magekreftceller også undersøkt. Annexin V /PI farging ble anvendt for å analysere virkningene av G503 i SGC7901 og AGS magecancerceller ved strømningscytometri. For disse forsøk ble 25 umol /L kolkisin anvendt som positiv kontroll. Etter behandling med 0 umol /L, 2,5 umol /l, 5 umol /L, 10 pmol /L, 20 pmol /l og 40 pmol /L G503 og 25 umol /L colchicines i 24 timer, andelen av apoptotiske SGC7901 cellene 5,625% ± 0,50%, 6,19% ± 0,13%, 10,25% ± 0,47%, 16,99% ± 1,73%, 25,72% ± 0,55% 31,03 ± 1,03% og 20,69% ± 1,91%, henholdsvis (figur 1B); prosenten av apoptotiske AGS celler var henholdsvis 15,37% ± 2,36%, 19,30% ± 4,45%, 22,72% ± 4,89%, 24,93% ± 4,76%, 30,44% ± 9,42%, 47,51% ± 18,29% og 31,49% ± 2,45%, (figur 1C). Påvisningen av apoptose i AGS-celler og de ovenfor angitte resultater indikerer at G503 induserer magekreft celle apoptose i en doseavhengig måte.

G503 induserer apoptose i en caspase-avhengig måte

For ytterligere å undersøke den mekanisme som er involvert i G503-indusert apoptose i magekreftceller, studerte vi SGC7901 celler. Caspase-3 er en effektor caspase som kan gå inn kjernen og direkte kontakt med underlaget, og dermed fremme celle apoptose [24]. Caspse-9 er initiativtaker caspase som aktiverer caspse-3 [25]. Cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner G503 for angitte tidspunkter og oppsamlet for å vurdere caspase-3 og -9 ved Western blotting. Ekspresjon av caspase-3-forløper ble redusert i en dose- og tidsavhengig måte, mens caspase-3 spaltningssetene fragmenter øket i en dose- og tidsavhengig måte (figur 2A, B). Ekspresjon av caspase-9 forløper også redusert, og spaltningssetene fragmentene økt etter at cellene ble behandlet med 20 umol /L G503 i 24 timer (Figur 2C). Disse effektene blir opphevet ved den pan-kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK (figur 2C, D). I samsvar med aktivering av caspase-9 og -3, de apoptotiske celler priser indusert indusert av 20 mikromol /L G503 i SGC7901 celler ble betydelig redusert etter forbehandling med Z-VAD-FMK (figur 2E). Disse data antydet at G503 induserer apoptose i SGC7901 celler i et caspase-avhengig måte.

G503-indusert apoptose er ikke avhengig av caspase-8

For å undersøke om dødsfallet reseptor-mediert apoptotiske sti er indusert av G503, vi studerte caspase-8, initiativtaker caspase død reseptor-mediert apoptotiske sti [26]. SGC7901 celler ble behandlet med forskjellige doser av G503 for angitte tidspunkter. Cellene ble samlet opp for å måle caspase-8 ved Western blotting. Resultatene indikerte at caspase-8-forløper ble redusert og spaltet caspase-8 økte på en tids- og doseavhengig måte (figur 3A, B). Cellene ble forbehandlet med 20 umol /L caspase-8-inhibitor Z-IETD-FMK i 30 min og deretter behandlet med 20μmol /l G503 i 24 timer. Caspase-8 proform øket i celler co-behandlet med caspase-8-inhibitor og G503, sammenlignet med celler behandlet med G503 bare. Imidlertid caspase-9 proform, spaltet caspase-9 og caspase-3, ble opprettholdt på samme nivå i celler behandlet med caspase-8-inhibitor og G503 G503 eller alene (figur 3C). I samsvar med figur 3C, G503-indusert apoptotiske celler priser i SGC7901 celler ble ikke redusert med forbehandling med Z-IETD-FMK (figur 3D). Disse data antydet at til tross for aktivering av G503, er caspase-8 ikke involvert i pro-apoptotiske aktivitet av G503.

G503-indusert apoptose er avhengig av caspase-9

caspase-9, den initiator caspase av mitokondrie apoptotiske reaksjonsvei kan bli aktivert ved å kombinere med cytokrom c plakater (Cyto c
) og apoptotisk protease-aktiverende faktor-1 (Apaf-1) [25] - [26]. For ytterligere å undersøke hvorvidt den mitokondrielle reaksjonsveien er involvert i G503-indusert apoptose, ble aktiveringen av caspase-9 undersøkt etter G503 behandling ved forskjellige konsentrasjoner og tider. I tillegg ble den apoptotiske cellen frekvensen også måles ved samtidig behandling med G503 og caspase-9-inhibitor Z-LEHD-FMK. Resultatene indikerte at caspase-9 proform redusert og spaltningssetene fragmentene økte på en tids- og doseavhengig måte (figur 4A, B). Deretter ble cellene forbehandlet med 20 umol /L Z-LEHD-FMK i 30 min og ko-inkubert med 20 pmol /L G503 i 24 timer. For å kvantifisere de apoptotiske celler, ble cellene farget med AnnexinV /PI og analysert ved strømningscytometri. Resultatene indikerte at den apoptotiske cellen sank når cellene ble samtidig behandlet med Z-LEHD-FMK og G503 (figur 4C). Samlet utgjør disse data antyder at det G503-indusert SGC7901 celle apoptose er avhengig av caspase-9-aktivering.

G503 induserer apoptose via den mitokondrielle apoptotiske reaksjonsvei

Det er velkjent at den mitokondrielle reaksjonsveien er en viktig apoptotiske sti. For å undersøke hvorvidt G503 induserer apoptose via mitokondrie vei, undersøkte vi apoptose-relaterte proteiner, den mitokondriemembranen potensial (MMP), og åpningen av MPTP for å bekrefte induksjon av mitokondrie apoptotiske reaksjonsvei. Følge av G503 behandling, mitokondriell fluorescens ble redusert sammenlignet med kontrollgruppen (figur 5A), og derved antyder at MPTP ble åpnet av G503. Dessuten, som vist i figur 5B, ble betydelig rød /grønn fluorescens intensitet ble observert i kontrollgruppen. Imidlertid, etter behandling med 20 umol /L G503, ble det rød /grønn fluorescens intensitet reduseres. Dette resultatet antydet at G503 reduserer mitokondriemembranen potensialet i SGC7901 celler. I tillegg, total Cyto c
protein nivåer ikke særlig bytte mellom kontroll og narkotika gruppe; Men Cyto c
ble relocalized til cytoplasma fra mitokondriene (figur 5C). Bax og BCL-2 er avgjørende faktorer i reguleringen av mitokondrie-kanaler og utgivelsen av ulike apoptose relaterte proteiner [27]. Derfor Vi studerte fordelingen av Bax og Bcl-2 i forskjellige cellulære avdelinger og har ikke observere en fremtredende forandring i den totale proteinnivåer Bax og Bcl-2 mellom kontroll- og medikamentgruppe; imidlertid, G503 fremmet translokasjon av Bax fra cytoplasma til mitokondriene, så vel som den translokasjon av Bcl-2 fra mitochondria til cytoplasma (figur 5D). Til sammen induserer G503 apoptose i SGC7901 celler via mitokondrie vei.

G503 induserer apoptose i SGC7901 celler blant annet gjennom caspase-4 aktivering

caspase-4 kan direkte aktivere caspase-9, men ikke gjennom den mitokondrielle veien [28] - [29]. For å undersøke hvorvidt kaspase-4 aktiveres av G503 og hvorvidt aktiverte caspase-4 aktiverer caspase-9, undersøkte vi spaltningssetene fragmenter av caspase-4 og -9. Resultatene indikerte at caspase-4 spalting fragment økt betydelig i celler behandlet med G503, sammenlignet med kontrollgruppen (figur 6A). Behandling med caspase-4-hemmer Z-LEVD-FMK økte caspase-9 proform, som ikke ble oppdaget i G503 behandlingsgruppen (figur 6B). Resultatene indikerte at G503 induserer SGC7901 magekreft celle apoptose blant annet gjennom aktivering av caspase-4.

Diskusjoner

Det er rapportert at p
kinon delen av kinon holdige molekyl spiller en meget viktig rolle i anti-kreft potensial [30]. Perchellet et al. også funnet at p-kinon J4, o-kinon J1 og usubstituert modell p-kinon J7 redusert mest L1210 tumorcellelevedyktighet på åtte forbindelser syntetisert og vist i sin innledende studie [31]. For å forstå forholdet mellom anti-kreft potensialet av altersolanol A og struktur-aktivitets, Teiten et al. evaluert effekten av altersolanol A og relaterte Anthracene derivater: tetraacetylaltersolanol A, tetrahydroaltersolanol B og ampelanol. De fant at bare altersolanol A og dens acetylert derivat tetraacetylaltersolanol En fore en cytotoksisk effekt på K562-celler, mens derivater med reduksjon av én av karbonylgruppene, slik som tetrahydroaltersolanol B og ampelanol, har ingen effekt [32]. p
kinon strukturen G503 (figur S1) kan også bidratt til kreftcelle apoptose, og i neste forskning vil vi analysere G503 og dets derivater for å identifisere den foreløpige struktur-aktivitetsforhold. I denne studien, finner vi at den magekreft cellelinjen SGC7901 er den mest G503-sensitive kreftcellelinje undersøkt ved anvendelse av en cellelevedyktighet analyse i ni cancercellelinjer og to normale cellelinjer. G503 induserer SGC7901 magekreft celledød via apoptose i en doseavhengig måte. En annen magekreftceller AGS er også undersøkt, og er følsom for G503-indusert apoptose i tillegg. Som et resultat av dette er 20 umol /L G503 den optimale konsentrasjon som induserer alvorlig apoptose.

humane genom koder for minst 10 typer av kaspase-homologer. De følgende kaspase homologer delta i apoptose: Caspase-2, -3, -8, -9 og -10 [33]. Selv caspases spille en rolle i apoptose, er det ulike caspase uavhengige veier eksisterer. For eksempel, i nærvær av kaspaseinhibitorer, tumornekrosefaktor (TNF) induserer celle-nekrose, som besitter egenskapene til apoptose og nekrose [34] - [36]. I tillegg, apoptose-induserende faktor (AIF) er et DNA-enzym som nedbryter DNA direkte. Når mitokondriemembranen potensialet endres, blir AIF frigjøres til cytoplasma fra mitochondria og blir aktivert av sin vekselvirkning med cyclophilinA [37] - [38]. Endo G kan også svekke DNA direkte i et caspase-uavhengig måte [39].

I vår studie, aktiverer caspase-3, -8 og -9 i en dose- og tidsavhengig måte (figur G503 eksponering 2A, B; 3A, B; 4A, B). Er G503-indusert apoptose avhengig av kaspasene? Når celler ble ko-behandlet med Z-VAD-FMK og G503, hemmer Z-VAD-FMK caspase-9 og -3 aktivering (figur 2C, D), og antallet av apoptotiske celler indusert av G503 ble redusert (figur 2E), derved indikerer at G503-indusert SGC7901 celle apoptose er caspase-avhengig. For å skille om G503-indusert apoptose er avhengig av caspase-8, -9 eller begge deler, ble SGC7901 celler forbehandlet med Z-IETD-FMK og Z-LEHD-FMK og deretter samtidig behandling med G503. Resultatene indikerer at Z-IETD-FMK ikke inhiberer caspase-9 og -3 aktivering (figur 3C) og heller ikke redusere antallet av apoptotiske celler indusert av G503 (figur 3D); imidlertid redusert Z-LEHD-FMK antallet apoptotiske celler (Figur 4C). Således G503-indusert SGC7901 celle apoptose er ikke avhengig av caspase-8, men er på caspase-9.

Mitokondriene består av en ytre membran, membranen plass og matrise. Apoptose-relaterte proteiner, slik som kaspase proenzymer, Cyto c
og AIF eksistere i membranen plass. Imidlertid, når porene dannet i den ytre mitokondriemembranen eller permeabiliteten forandres, er disse apoptose-relaterte proteiner frigjøres til cytoplasma. Medlemmer av Bcl-2-familien kontrollere permeabiliteten av den ytre mitokondriemembranen, og kan deles opp i to deler som fremmer apoptose (for eksempel Bax og Bak) eller inhibere apoptose (slik som Bcl-2 og Bcl-xL). De pro-apoptotiske medlemmer fremme frigivelse av apoptose-relaterte proteiner, slik som Cyto c
, fra mitokondrier, mens anti-apoptotiske medlemmer har en motsatt virkning [40]. Bax primært finnes i cytoplasma, mens Bcl-2 kombinerer med hydrofobe grupper ved C-terminal av cellen bio-membran [41]. Bax strukturen endres i løpet av ytre stress, slik at den kombinerer med den ytre mitokondriemembranen tospontaneously danne et galleri ved homolog oligomerisering. Denne virkning induserer frigjøring av apoptose-relaterte proteiner [42] eller dannelsen av mitokondriene Permeabilitet Transition Pore (MPTP), som består av spenningsavhengig anion kanal (VDAC) på den ytre mitokondriemembranen og adenin-nukleotid Translocator (ANT) i den indre membran [43]. Bax bare samhandler med VDAC å skape en åpen pore når Bax konsentrasjonene er lave. I motsetning til dette, Bax kommuniserer samtidig med VDAC og ANT når Bax høye konsentrasjoner for å åpne porene i den indre og ytre membran. Dette reduserer den indre membranpotensialet, øker det osmotiske trykk av den mitokondrielle matriks, fremmer indre membran hevelse og øker det osmotiske trykk i den ytre membran, for derved å fremme frigivelse av apoptose-relaterte proteiner [26], [44] - [46 ]. Et viktig skritt i den mitokondrielle apoptotiske sti er utgivelsen av Cyto c product: [47] - [49]. Cyto c
kombinerer med Apaf-1 og caspase-9 proform å lage apoptosome. Apaf-en eksponerer sitt oligomerisering domene, og den N-terminale caspaseaktivering og rekrutterings domener (KORT) kombinerer med caspase-9 proform CARD. Således er caspase-9 aktivert, og den aktiverte caspase-9 spalter nedstrøms kaspaser, som caspse-3 og -7. Effektorcellene caspaser til slutt spalte i de tilsvarende substrater for å indusere celle apoptose [47], [49] -. [50]

I denne studien, øker G503 andelen av Bax /Bcl-2 på mitokondriemembranen og avtar forholdet Bax /Bcl-2 i cytoplasma (figur 5D). G503 fremmer også MPTP åpning og reduksjon av mitokondriemembranpotensialet (figur 5A, B). Deretter Cyto c
ble overført fra mitokondriene til cytoplasma (figur 5C). I tillegg fremmer G503 overføring av Bax til mitokondriene fra cytoplasma og Bcl-2 til cytoplasma fra mitochondria. Økt Bax og redusert BCL-2 i mitokondriene øke gjennomtrengning av mitokondrie ytre membran og promotere utgivelsen av Cyto c
. Reguleringen av Bax /Bcl-2 av G503 kan observeres fordi G503 er en liten molekylær forbindelse. Det er mulig at G503 direkte går inn i cellene, og kombinerer med Bax og Bcl-2 for å endre sine strukturer, og dermed forårsaker Bax binding til den ytre mitokondriemembranen og Bcl-2-frigivelse fra mitochondria.

Flere studier har vist at ROS generasjon er avgjørende for antrakinon-indusert apoptose i kreftceller [51] - [52].

Other Languages