PLoS ONE: MIR-26a Undertrykker tumorvekst og metastasering av målretting FGF9 i Gastric Cancer

Abstract

Rollen MIR-26a i kreftceller virket kontroversielt i tidligere studier. Inntil nå, rollen MIR-26a i magekreft forblir udefinert. I denne studien, har vi funnet at MIR-26a ble sterkt nedregulert i magekreft (GC) vev og cellelinjer, og dens ekspresjonsnivåene var assosiert med lymfeknutemetastase og klinisk stadium, så vel som total overlevelse og replase overlevelse av GC . Vi fant også at ektopisk uttrykk for MIR-26a hemmet GC celleproliferasjon og GC metastaser in vitro Hotell og in vivo
. Vi videre identifisert en ny mekanisme av MIR-26a å undertrykke GC vekst og metastasering. FGF9 ble vist seg å være et direkte mål for MIR-26a, ved hjelp av luciferase assay og western blot. FGF9 overekspresjon i MIR-26a-uttrykke celler kan redde invasjon og vekstdefekter av MIR-26a. I tillegg MIR-26a uttrykk omvendt korrelert med FGF9 protein nivåer i GC. Til sammen våre data tyder på at Mir-26a fungerer som en tumor suppressor i GC utvikling og progresjon, og holder løftet som en prognostisk biomarkør og potensiell terapeutisk mål for GC

Citation. Deng M, Tang Hl, Lu xh, Liu Min, Lu XM, Gu Yx, et al. (2013) MIR-26a Undertrykker tumorvekst og metastasering av målretting FGF9 i magekreft. PLoS ONE åtte (8): e72662. doi: 10,1371 /journal.pone.0072662

Redaktør: H. Sunny Sun, Institute of Molecular Medicine, Taiwan

mottatt: 29 mars 2013; Godkjent: 12 juli 2013; Publisert: 28 august 2013

Copyright: © 2013 Deng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Nature Scientific Foundation of China (81101526, 31100936) og Guangzhou Medical College Doctor start Foundation (2012C11). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

mirnas er endogent uttrykt, små ikke-kodende RNA som negativt regulerer genuttrykk ved å forårsake nedbrytning av målet mRNA, hemming av oversettelsen av disse mRNA eller begge [1]. mirnas ta en del på viktige cellulære prosesser, for eksempel den stressrespons, utvikling, differensiering, apoptose og proliferasjon [2]. Altered miRNA uttrykk er blitt rapportert i tallrike maligniteter, inkludert bryst [3], [4], lunge [5], lever [6], mage [7], tykktarm [8], hjerne [9], leukemi [10], og lymfom [11]. Et økende antall studier har vist at mirnas kan fungere som onkogener eller tumor dempere, og de er ofte dysregulerte i tumorer [12], [13]. I denne forbindelse er onkogene mirnas ofte oppregulert, mens krefthemmende mirnas er nedregulert i tumorer. For eksempel, har la-7 blitt rapportert å være underexpressed i lungekreft og til å målrette den onkogene Ras [14], [15]. Vi har tidligere rapportert at Mir-216b er sterkt nedregulert i nasofaryngeal karsinom og demper tumorvekst ved å målrette KRAS [16]. I kontrast er den onkogene MIR-17-92 klynge av miRNAs oppregulert i forskjellige tumor [17], og håndheves uttrykk for disse miRNAs i godt studert Eμ-myc transgen musemodell for B-celle lymfom dramatisk akselererer sykdomsutbruddet og progresjon [18]. Imidlertid er rollen til mir-26a i kreftceller virket kontroversielt, da det er en tumor suppressor i leverkreft [19], brystkreft [20] og nasofaryngeal karsinom [21], [22], men er et onkogen i glioma [23 ] og kolangiokarsinom [24]. Inntil nå, rollen MIR-26 i magekreft var udefinert.

I denne studien undersøkte vi MIR-26a uttrykk i 40 sammen normale og GC eksemplarer av kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) analyse . MIR-26a ble funnet å være sterkt nedregulert i GC vev sammenlignet med den til tilstøtende normale mage vev. Dette resultatet ble ytterligere bekreftet ved in situ hybridisering på microarray som består av 126 tilfeller av GC vev og 41 tilfeller av tilstøtende normale vev. Videre redusert MIR-26a var assosiert med dårlig prognose og kan uavhengig forutsi total overlevelse (OS) og replase overlevelse (RFS) i magekreft. Funksjonelle studier viste at Mir-26a trykt GC cellevekst og metastase ved å målrette FGF9.

Resultater

MIR-26a er nedregulert i Human Gastric Cancer

Ved hjelp av en QRT-PCR metode, MIR-26a-nivåer ble påvist i 40 par av magekreft vev og deres matchede tilstøtende vev, så vel som gastrisk cellelinjer. Blant de 40 pasienter med magekreft, ca 70% (28 av 40 pasienter) av svulster viste en mer enn to-fold reduksjon i MIR-26a nivåer, med en 5,76-fold reduksjon i forhold til tilstøtende normalt vev, noe som tyder på at reduksjon av MIR -26a var en hyppig hendelse i menneskelig GC (figur 1A). Videre ble MIR-26a uttrykk redusert i alle magekreftcellelinjer (MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, og BGC-823) i forhold til ikke-ondartet magecellelinje GES-en (figur 1B). For ytterligere å bekrefte resultatene om biologiske rolle MIR-26a i menneskets mage karsinogenese, vi ansatt in situ hybridisering for å evaluere MIR-26a uttrykk i 126 GCer og 41 ikke-tumor vev på microarray (TMA). Resultatene viste at uttrykket score til Mir-26a ble betydelig redusert i GCer sammenlignet med normalt vev (figur 1C). Deretter fant vi ut de potensielle clinicopathological konsekvenser av endret MIR-26a uttrykk. Kliniske prøver ble delt inn i lav uttrykk og høye uttrykk grupper basert på MIR-26a uttrykk score større eller mindre enn medianen. I samsvar med ovennevnte data, ut av 41 totalt normale mageprøver, 35 (85%) hadde høyt uttrykk av MIR-26a. I motsetning til 60% (76 av 126) av gastrisk karsinom prøvene hadde lav til negativt ekspresjonen av MIR-26a. Av de 126 personer med GC, 38 var negative for lymfeknutemetastaser, og 45% av disse pasientene hadde lav til negativ uttrykk for MIR-26a (tabell 1). Åtti-åtte pasientene var positive for lymfeknutemetastaser, og 67% av dem viste nedregulering eller tap av MIR-26a (tabell 1). Videre har vi funnet lav ekspresjon av MIR-26a i 37% og 77% av gastriske tumorer som er klassifisert som stadium I /II og stadium III /IV, henholdsvis (tabell 1). Derfor MIR-26a uttrykk omvendt korrelerer med lymfeknutemetastase og klinisk stadium ( P
= 0,019 og P
< 0,001, henholdsvis). Men gjorde MIR-26a ikke korrelerer med alder, kjønn, celledifferensiering, eller invasjon dybde (T scenen). Disse resultatene tyder på at Mir-26a kan spille en avgjørende rolle i GC metastaser og progresjon.

Redusert MIR-26a korrelerer med dårlig klinisk prognose

For ytterligere å analysere betydningen av MIR-26a i form av klinisk prognose, ble Kaplan-Meier overlevelsesanalyse utført ved hjelp av pasientens total overlevelse og tilbakefall overlevelse. Resultatene viste at pasienter med lav MIR-26a uttrykk hatt kortere median OS og RFS enn gjorde pasienter med høyt MIR-26a uttrykk (21,6 måneder versus 39,0 måneder, P
< 0,001 for OS, 15,2 måneder kontra . 31,6 måneder, P
= 0,002 for RFS, figur 1D). Vi brukte Cox proporsjonal farer regresjon for ytterligere å vurdere sammenhengen mellom MIR-26a uttrykk og prognose. I univariat analyse, lymfeknutemetastase, TNM stadium, og MIR-26a nivåene var signifikant assosiert med OS og RFS (tabell 2, 3). Den endelige multivariate modellen viste at total overlevelse tid betydelig avhengig av lymfeknutemetastaser, TNM stadium, og MIR-26a nivåer (tabell 2), og tilbakefall overlevelse tid gjorde på lymfeknutemetastase og MIR-26a nivåer (Tabell 3).

MIR-26a Undertrykker GC vekst og metastase

Som merker seg invers korrelasjon mellom MIR-26a nivåer og metastasering, undersøkte vi effekten av MIR-26a re-uttrykk på migrasjon og invasjon evner GC-cellelinjer. To GC cellelinjer (SGC-7901 og AGS) med relativt lav basal uttrykk for MIR-26a (figur 1B) ble infisert med enten MIR-26a eller kontroll lentivirus og valgt med 5 mg /l puromycin i to uker. Deretter sårheling analysen og transwell analysen ble utført. Som forventet, overekspresjon av MIR-26a undertrykte betydelig celle migrasjon og invasjon evner (figur 2A, B, figur S1).

For å demonstrere effekten av MIR-26a på GC vekst, utførte vi GC-analysen celleproliferasjon. Analysen spredning viste at ektopisk uttrykk for MIR-26a i SGC-7901 og AGS svekket celleproliferasjon sammenlignet med kontrollceller (Figur 2C). Videre ektopisk MIR-26a uttrykk hemmet kolonidannelse evne i myk agar (figur 2D). Vi deretter utført celle apoptose analyse og avslørte at Mir-26a overekspresjon i SGC-7901 indusert celle apoptose (figur 2E).

Deretter testet vi om MIR-26a kan spille en rolle i tumordannelse ved hjelp av naken mus xenograft modeller. Vi fant at overekspresjon av MIR-26a i SGC-7901 celler undertrykte betydelig tumorvekst i hårløse mus (figur 3A, figur S2). Deretter ble SGC-7901-celler infisert med enten MIR-26a eller kontroll lentivirsus injisert i halevenen til nakne mus for å undersøke lungemetastase. Som vist figur 3B, kan et betydelig lavere antall av makroskopiske lungemetastaser observeres i MIR-26a overekspresjon celler enn kontrollceller. Disse resultatene indikerer at Mir-26a kan undertrykke GC vekst og metastasering.

MIR-26a Direkte Målsettinger og Hemmer FGF9

For å forstå hvordan MIR-26a undertrykker GC vekst og metastasering, brukte vi tre algoritmer (Targetscan, Pictar og Miranda) for å identifisere MIR-26a mål i menneskelige mage kreft. Av disse målgener som ble spådd av alle tre algoritmer (tabell S1), FGF9 tiltrakk seg oppmerksomheten umiddelbart som det har vært innblandet i tumorigenesis eller metastase [26] - [28]. Vi klonet full-lengde FGF9 3'-UTR inn i et luciferase reporter vektor. Luciferase assay viste at Mir-26a direkte bundet til FGF9 3'-UTR, og der det bemerkelsesverdig redusert luciferasepreparater aktiviteter (Figur 4A). Men mutasjon av de antatte MIR-26a områder i 3'-UTR av FGF9 avskaffet luciferase respons til MIR-26a (figur 4A). For å vurdere effekten av MIR-26a på FGF9 uttrykk direkte, utførte vi western blot analyse. Som vist i figur 4B, lentiviral indusert ektopisk MIR-26a dramatisk undertrykt de FGF9 protein nivåer i SCG-7901 og AGS celler. Videre knockdown av MIR-26a, gjennom transfeksjon av anti-MIR-26a, i GES-1 celler økte FGF9 protein nivåer (figur 4B, figur S1). Samlet utgjør disse resultatene indikerer at FGF9 er en direkte nedstrøms mål for Mir-26a i GC-celler. Resultatene ovenfor bedt oss om å undersøke om MIR-26a undertrykker GC vekst og metastasering gjennom undertrykke FGF9 uttrykk. For dette formål, FGF9 ble gjen uttrykt i MIR-26a-transfektert SGC-7901-celler. I MIR-26a-uttrykke celler, re-uttrykk for FGF9 reddet invasjonen og vekstdefekter av MIR-26a (figur 4C, D, E). Endelig testet vi om MIR-26a uttrykk korrelert med FGF9 protein nivåer i GC. Det var en invers korrelasjon mellom FGF9 protein nivåer, angitt med immunhistokjemi flekker, og MIR-26a uttrykk vurdert ved in situ hybridisering i 126 GC vev på TMA som brukt ovenfor (figur 4F, Figure1C). Våre funn viser at Mir-26a har egenskaper som samsvarer med tumor suppressor funksjon. Evnen til å modulere FGF9 nivåer kan forklare, i hvert fall delvis, hvorfor MIR-26a kan hemme GC vekst og metastasering.

Diskusjoner

MIR-26a tilhører MIR-26-familien, som inneholder et annet medlem MIR-26b, som begge huset identisk sekvens med unntak av 2 forskjellige nukleotider i modne mirnas. MIR-26a er en funksjonell miRNA som har fortjent forrige undersøkelse [29]. Det er kjent at MIR-26a spiller en betydelig rolle i vekst, utvikling og celledifferensiering av forskjellige vev [29]. Flere studier har vist at MIR-26a uttrykk er uordnede i en rekke humane tumorer [19], [22], [24], [30], [31]. Imidlertid er ingen av disse studiene er relatert til magekreft. I denne studien har vi brukt QRT-PCR og ISH å vise at MIR-26a nivåer i mage kreft vev var betydelig lavere enn i ikke-tumorvev. Videre ble Mir-26a nivåer forbundet med klinisk stadium og tilstedeværelse av lymfeknutemetastaser. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse viste at pasienter med primær svulster vises lavt uttrykk av MIR-26a hadde en kortere OS og RFS i GC. I tillegg Cox proporsjonal farer regresjonsanalyse viste at redusert MIR-26a i tumorer var en sterk og uavhengig prediktor for kortere OS og RFS. På grunnlag av array-data, var det tidligere rapportert at en kombinasjon av flere mirnas kan være nyttig som prognostiske markører i magekreft, [32], [33]. I tillegg kan en enkelt-miRNA, slik som MIR-218, kan være en prognostisk indikator [34]. Imidlertid har disse mirnas blitt undersøkt i bare noen få mage kreftpasienter. Her kan MIR-26a være nyttig som en prognostisk markør for å forutsi overlevelse og tilbakefall i magekreft.

Denne studien viste at ektopisk uttrykk for MIR-26a i GC cellene nedsatt migrasjon, invasjon, spredning og kolonivekst som samt indusert apoptose. Videre in vivo data viste MIR-26a hemmet tumorvekst og metastasering. Disse in vitro og in vivo data videre indikert at MIR-26a fungerer som en tumor suppressor i magekreft. Flere studier støtter våre resultater. For eksempel er dette miRNA redusert i NPC vev, og kan svekke cellevekst og tumordannelse ved å målrette EZH2 [22]. Leverkreft også viser redusert uttrykk av MIR-26a [19]. Systemisk administrering av denne miRNA i en musemodell for HCC ved hjelp av et adeno-assosiert virus (AAV) resulterer i hemning av kreftcellevekst, indusering av tumor-spesifikke apoptose, og dramatisk beskyttelse mot sykdomsutviklingen uten toksisitet [35]. Men ulike nyere studier avslørte onkogene rollen MIR-26a i tumorer som glioma og kolangiokarsinom. Huse et al. rapportert at MIR-26a ble overexpressed i høyverdig glioma og direkte rettet PTEN [23]. Tilsvarende ble MIR-26a funnet å være overuttrykt i humane kolangiokarsinom vev og for å fremme vekst kolangiokarsinom ved aktivering av B-catenin [24]. Disse kontroversielle resultatene antydet at rollen MIR-26a var muligens tumor spesifikke og svært avhengig av sine mål i ulike kreftceller. Ulike studier har vist at PTEN [23], EZH2 [21], [22], SMAD1 [36], CDK6 og cyclin E1 [37] er potensielle nedstrøms målgener av MIR-26a. I denne studien FGF9, en ny direkte og funksjonelle mål av MIR-26a, ble identifisert i GC. FGF9, også kjent som glial aktiverende faktor, er en av 23 medlemmer av den svært konserverte FGF-familien. Som et utskilt, glykosylert 26-kDa-proteinet, har den mitogene virkninger på en rekke forskjellige celletyper [26]. FGF9 har vist seg å være implisert i forskjellige kreftformer, slik som ovarie endometrioid adenocarcinoma [26], hepatocellulært karsinom [27] og prostata-karsinom [28]. I våre studier, bekreftet vi at FGF9 var et direkte mål på MIR-26a i GC-celler. For å avgjøre om MIR-26a undertrykker GC vekst og metastasering gjennom undertrykke FGF9 uttrykk, fant vi at FGF9 overekspresjon kunne redde invasjon og vekstdefekter av MIR-26a. Disse resultatene antydet at Mir-26a hemmer GC vekst og metastase dels ved å målrette FGF9.

Til sammen observerte vi nedregulering av MIR-26a i mage kreftceller og viste at Mir-26a kan fungere som en uavhengig prediktor for OS og RFS. Vi videre funnet at Mir-26a besitter styrken til å undertrykke GC vekst og metastasering ved å regulere FGF9. Våre funn tyder på MIR-26a fungerer som en tumor suppressor i GC og holder løftet som en prognostisk biomarkør og potensiell terapeutisk mål for GC.

Materialer og metoder

Cell Culture

den gastrisk epitel cellelinje GES-en ble kjøpt fra Beijing Institute for Cancer Research (Beijing, Kina). De GC cellelinjer MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, og BGC-823 ble innhentet fra Chinese Academy of Medical Science (Beijing, Kina). Disse cellene ble holdt ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO _{2 i RPMI-1640 (MGC-803, BGC-823, MKN-28, SGC-7901), DMEM (GES-1) eller F12 ( AGS) medium supplementert med 10% føtalt bovint serum, penicillin og streptomycin (Gibco BRL, New York, USA). Alle transfections brukt Lipofectamine 2000 ((Invitrogen, Carlsbad, USA)).}

kliniske prøver

Alle vevsprøver som brukes i denne studien ble samlet inn fra Hunan Provincial Tumor Hospital (Changsha, Hunan, Kina). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltagerne. Denne studien ble godkjent av etikkomiteen av Guangzhou Medical University Health Authority. Innsamling og bruk av vev fulgt prosedyrene som er i samsvar med de etiske normer slik de er formulert i Helsinkideklarasjonen

Vevsprøver fra 40 mage kreftpasienter (23 mannlige og 17 kvinnelige,. Median alder 59 år; range 40-84 år) ble anvendt for kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR-analyse). Resected kreft vev (tumor) og sammenkoblede matchet normale mage vev (Normal) ble umiddelbart kuttet, frosset i flytende nitrogen, og holdt ved -80 ° C til RNA ekstraksjon.

microarray (TMA), som består av 126 GCer og 41 tilstøtende normale mage vev, ble brukt for in situ hybridisering analyse. Median alder for mage kreftpasienter ved diagnose var 57 år (range 31-82). Median oppfølgingstid for total overlevelse (OS) og tilbakefall overlevelse (RFS) var 22 måneder og 15 måneder, henholdsvis. Alle data fra 126 GC prøver, inkludert alder, kjønn, tumorlokalisering, histologiske grad, invasjon dybde (T stadium), klinisk stadium, og lymfeknutemetastase ble oppnådd fra kliniske og patologiske poster og oppsummert i tabell 2. supplerende

Kvantitativ RT-PCR-analyse

Total RNA ble ekstrahert fra cellene ved bruk av TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA). Revers transkripsjon og QRT-PCR-reaksjoner ble utført ved anvendelse av en qSYBR-grønn PCR-kit (Qiagen, Germantown, USA) og U6 snRNA ble anvendt som en endogen kontroll. Brett endringen ble bestemt som to ^{-ddCt. Den Ct er den fraksjonelle syklus nummer ved hvilken fluorescens av hver prøve passerer den faste terskel. Den ddCt ble beregnet ved å subtrahere DCT av referanseprøven (paret ikke-tumorvev for kirurgiske prøver og GES-1 celle for seks gastrisk cancer-cellelinjer) fra DCT av hver prøve. Sekvensene til de spesifikke primere for MIR-26a og U6 snRNA var 5'-CTTCAAGTAATCCAGGATAGGC-3 'og 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3', henholdsvis.}

In situ hybridisering og
Immunhistokjemi

Påvisning av MIR-26a ved in situ hybridisering utnytte DIG-merket låst nukleinsyre (LNA) -basert sondere spesifikk for MIR-26a (Exiqon, Vedbæk, Danmark) ble utført i henhold til produsentens instruksjoner og U6 snRNA ble anvendt som en positiv kontroll. Brie fl y, vev microarray ble objektglassene deparaffinized, behandlet med proteinase K (5 min i 2 pg /ml protease K), vasket i PBS og deretter blokkert endogen peroksidaseaktivitet med 3% H _{2o 2. Hybridisering ble utført ved 52 ° C over natten etter tilsetning av 50 nM av DIG-merkede LNA prober, etterfulgt av en vaskestringens på SSC buffere. Etter blokkering (2% saueserum og 2 mg /ml BSA i PBS med Tween-20) ved værelsestemperatur ble probe-mål-komplekset visualisert ved anvendelse av en anti-DIG-POD-antistoff, og DAB-kompleks.}

immunhistokjemi ble utført på vev microarray seksjoner ved hjelp av anti-FGF9 antistoff (Santa Cruz, CA, USA). Komplekset ble visualisert med streptavidin /peroksidase og DAB-komplekset, og kjerner motfarget med hematoksylin. In situ hybridisering og immunhistokjemi resultatene ble bedømt etter intensitet (0-4) og prosentandelen av farging (0 til 100%). Relativ ekspresjon ble oppnådd ved å multiplisere intensitet av prosent. Skinnene ble analysert ved to uavhengige patologer.

rekombinant vektor

Rekombinante lentiviruses inneholder MIR-26a forløper eller krafse sekvensene ble kjøpt fra SunBio (Shanghai, Kina). For luciferase-analyse, ble full-lengde FGF9 3'-UTR amplifisert fra humant blod genomisk DNA, og deretter klonet inn i nedstrømsområdet av en ildflue luciferase kassett i pMIR-RAPPORT luciferase vektor (Ambion, Austin, TX, USA). De tilsvarende mutant konstruksjoner, der de første seks nukleotider komplementære til MIR-26a frø-regionen ble mutert ved seterettet mutagenese (Stratagene, La Jolla, CA, USA). For å konstruere FGF9-uttrykkende vektor, ble FGF9 ORF cDNA kjøpt fra GeneCopeia (Rockville, MD, USA) og subklonet inn i den eukaryote ekspresjonsvektoren pcDNA3.1 (+) (Invitrogen).

Luciferase Assay Reporter

MIR-26a eller krafse lentiviruses og pMIR-3'UTR vektor ble ko-transfektert inn i HEK-293T celler. Renilla og ildflueluciferase aktiviteter ble målt med Dual-luciferaserapportørplasmid system (Promega, Madison, WI) 24 timer etter transfeksjon. Ildflue luciferase-aktiviteten ble normalisert til Renilla luciferase-ekspresjon for hver prøve. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer.

Western Blot

Western blotting ble utført som beskrevet tidligere [16]. Kort sagt ble protein lysater separert ved 10% SDS-PAGE, og elek-trophoretically overført til PVDF (polyvinyliden difluorid) membran. Deretter ble membranen inkubert med muse-antistoff mot anti-FGF9 antistoff (Santa Cruz, CA, USA) fulgt av HRP (pepperrotperoksidase) -merket geite-antimuse-IgG (Santa Cruz, CA, USA) og detekteres av kjemiluminescens. β-aktin ble benyttet som en protein-lasting kontroll.

celleproliferasjonsanalyse

Cellene ble sådd ut på 12-brønners plater ved de ønskede cellekonsentrasjoner. Celletall ble estimert ved trypsinizing cellene og utføre analyser ved hjelp av en Coulter Counter (Beckman Coulter, Fullerton, USA) ved de angitte tidspunkter i tre eksemplarer.

Cell migrasjon og invasjon Analyser

Cell migrasjon ble undersøkt ved å bruke sårhelende analyser. En kunstig "såret" er laget på en konfluent celle monolag, og bildene ble tatt ved hjelp av en invertert mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) 24 timer.

For celle invasjon analysen ble cellene sådd ut på basalmembran matrise til stede i innsatsen av en 24-brønners dyrkingsplate (EC matrise, Chemicon, Temecula, CA) og føtalt bovint serum ble tilsatt til det nedre kammer som et kjemotiltrekkende. Etter ytterligere 48 timer, ble de ikke-invaderende celler og EC matrise forsiktig fjernes med en bomullspinne. Invaderende celler lokalisert på den nedre siden av kammeret ble farget med krystallfiolett, telles og avbildes.

kolonidannelse Assay

seks-brønns plater ble dekket med et lag av 0,6% agar i mediet supplert med 20% føtalt bovint serum. -Celler (1 x 10 ^{4) ble fremstilt i 0,3% agar og sådd ut i triplikat. Etter at platene ble inkubert ved 37 ° C i to uker, ble koloniene tellet.}

Apoptose Analyse

apoptotiske celler ble evaluert av Annexin V-FITC og propidium jod-farging (BD, USA ) og analysert med en FACS Calibur instrument (BD, USA). De innsamlede data ble analysert ved hjelp FlowJosoftware.

Mus Xenotransplantat Modell

Den magekreft modell i naken mus ble konstruert som beskrevet tidligere [25]. For å vurdere rollen til MIR-26a i tumordannelse, ble SGC-7901 celler infisert med MIR-26a eller krafse virus spredd og inokulert subkutant i rygg flankene av hårløse mus (5 i hver gruppe). Tumorstørrelse ble målt hvert 5 dager. Etter 30 dager ble musene drept, obduksjon ble gjennomført, og tumorene ble veid. Tumorvolumene ble bestemt i henhold til følgende formel: A x B ^{2/2, hvor A er den største diameter, og B er diameteren perpendikulært på A. For å analysere MIR-26a effekt på tumormetastase, SGC-7901-celler infisert med MIR-26a eller krafse virus ble injisert i halevenen til nakne mus (6 i hver gruppe). Etter 45 dager ble obduksjon. Tall av mikrometastaser i lunge per HE-farget delen i individuelle mus ble analysert ved morfologi observasjon. De eksperimentelle protokollene ble godkjent av forsøksdyrutvalget Protection Committee of Guangzhou Medical University. Standard dyr omsorg og laboratorie retningslinjene ble fulgt.}

Statistical Analysis

Sammenligninger mellom gruppene ble analysert av t-
test og x ^{2 test. Totalt overlevelseskurver og tilbakefallsfritt kurver ble plottet ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden, med log-rank test søkt sammenligning. Overlevelse ble målt fra dagen for kirurgi. Variabler med en verdi på P
< 0,05 i henhold til den univariate analysen ble brukt i påfølgende multivariat analyse basert på Cox modell. Spearmans korrelasjons tester ble brukt for å evaluere den parvise uttrykket korrelasjon mellom MIR-26a og FGF9 i GC vev. Alle forskjellene var statistisk signifikant på nivå med P
≤0.05. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS15.0 programvare.}

Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
QRT-PCR målt Mir-26a uttrykk nivåer i SGC-7901 og AGS celler infisert med MIR-26a lentivirus samt GES-1 celler transfektert med MIR-26a-hemmere
doi:. 10,1371 /journal.pone .0072662.s001 product: (TIF)
Figur S2.
QRT-PCR målt Mir-26a uttrykk nivåer av tumorvev hentet fra hårløse mus på den 30. dagen på kreftceller injeksjon. Alle data er vist som gjennomsnitt verdier ± S.E.M.
doi:. 10,1371 /journal.pone.0072662.s002 plakater (TIF)
Tabell S1.
Målgener som ble spådd av alle tre algoritmer (Targetscan, Pictar og Miranda)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0072662.s003 plakater (XLS)
Tabell S2.
Kjennetegn på pasienter med magekreft
doi:. 10,1371 /journal.pone.0072662.s004 plakater (DOC)

Takk

Vi takker J Ma og CK Wang for deres teknisk assistanse.

• PLoS ONE: ERCC1 og ERCC2 Varianter Tippe overlevelse hos pasienter med ventrikkelkreft
• PLoS ONE: Klinisk Betydningen av MYT1L Gene Polymorfisme i kinesiske pasienter med magekreft