PLoS ONE: Multiple-til-flere relasjoner mellom microRNAs og målgener i Gastric Cancer

Abstract

microRNAs (mirnas) fungere som transkripsjons regulatorer og spille sentrale roller i kreftutvikling. Ifølge miRNA måldatabaser, kan en miRNA regulerer mange gener som sine mål, mens ett gen kan bli målrettet av mange miRNAs. Disse funnene tyder på at forholdet mellom mirnas og deres mål ikke kan være en-til-en. Imidlertid har mange rapporter beskrevet bare en en-til-en, en-til-flere eller multiple-til-en forhold mellom miRNA og dens mål-genet i humane kreftformer. Derfor er det nødvendig å avgjøre hvorvidt en kombinasjon av noen miRNAs vil regulere flere mål og være involvert i kreftutvikling. Å finne noen grupper av mirnas som kan synergistisk regulerer sine mål i human magekreft (GC), vi re-analysert våre tidligere miRNA uttrykk array-data, og funnet ut at 50 mirnas var oppregulert på behandling med 5-aza-2'-deoxycytidine i en GC-cellelinje. Den "TargetScan" miRNA Måldatabasen spådd at noen av disse miRNAs har felles mål gener. Vi viste også til GEO database for uttrykk av disse felles mål gener i menneske GCer, som kan være relatert til magekreftutvikling. I denne studien analyserte vi to miRNA kombinasjoner, MIR-224 og -452, og MIR-181c og -340. Over-uttrykk for både miRNA kombinasjoner dramatisk nedregulert sine mål gener, DPYSL2 Hotell og KRAS
, og KRAS Hotell og MECP2
hhv. Disse miRNA kombinasjoner synergistisk redusert celleproliferasjon ved transfeksjon. Videre har vi avdekket at disse mirnas ble nedregulert gjennom promoter hypermethylation i GC-celler. Således er det sannsynlig at forholdet mellom mirnas og deres mål ikke er en-til-en, men flere-til-fler i gcs, og at disse komplekse sammenhenger kan være knyttet til magekreft

Citation:. Hashimoto Y, Akiyama Y, Yuasa Y (2013) Multiple-til-flere relasjoner mellom microRNAs og målgener i magekreft. PLoS ONE 8 (5): e62589. doi: 10,1371 /journal.pone.0062589

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan

mottatt: 14 desember 2012; Godkjent: 24 mars 2013; Publisert: 8. mai 2013

Copyright: © 2013 Hashimoto et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra A3 Foresight sight~~POS=HEADCOMP Program av Japan Society for Promotion of Science (JSP) (YY), og Stipend av JSP Unge Forskere (YH). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

microRNAs (mirnas), en klasse av små ikke-protein-kodende RNA, har blitt identifisert som en ny type gen regulator som binder til de 3'-utranslaterte regioner (UTR) av mål-mRNA, som derved resulterer i mRNA degradering eller blokkering av mRNA oversettelse [1]. Det er generelt kjent at miRNA endringer er forbundet med tumorgenese [1]. Ifølge miRNA måldatabaser, kan en miRNA regulerer mange gener som sine mål, mens ett gen kan bli målrettet av mange miRNAs. Men mange studier avslørte en en-til-en forhold mellom miRNA og dens målgenet. Det har også blitt rapportert at flere eller en klynge av mirnas ko-operativt regulere et gen, som er relatert til karsinogenese [2] - [4]. På den annen side er flere gener rettet av en miRNA [3], [4]. Selv multiple-til-flere relasjoner mellom mirnas og mål er rapportert ved bruk av beregnings analyser [5], [6]. Imidlertid har det vært bare noen få papirer eksperimentelt validerer flere-til-flere relasjoner i kreftceller.

Magekreft er den fjerde vanligste menneskelige ondartet sykdom og den nest hyppigste årsaken til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis, med anslagsvis en million nye tilfeller per år [7]. Gastric kreft er histologisk klassifisert i to hovedtyper, tarm og diffuse typer [8]. Diffuse-type GC er ofte vanskelige og viser en dårlig pasient prognose. Nylig viste vi at tap av Cdh1 og Trp53 funksjoner induserer diffuse typen GC bruker mus modeller [9]. Selv om dette funnet vil hjelpe oss til å utvikle nye menneskelige mage kreft terapi, videre undersøkelser på molekylære mekanismene bak magekreftutvikling er nødvendig for å utvikle andre metoder for målrettet terapi.

Arrangøren CpG island hypermethylation er en av de mest vanlige mekanismene ved hvilken tumorsuppressorgener inaktiveres i humane cancere [10]. Nylig har det blitt klart at noen mirnas er også mål for epigenetisk lyddemping i kreft [11]. Våre og andre grupper har tidligere vist at farmakologisk eller genetisk forstyrrelse av DNA-metylering i cancercellelinjer som induserer oppregulering av betydelig antall mirnas [12] - [15]. Disse data førte til identifisering av kandidattumorundertrykkende mirnas som lyddemping er assosiert med CpG island metylering. Så langt metylering av MIR-124 familiemedlemmer har blitt identifisert i kolorektal kreft og i svulster i andre organer [11]. I tillegg har MIR-34b /c klynge en typisk CpG øy, og blir nedregulert ved hyppig metylering i tykk- og gastriske cancere [12]. Tilsvarende fant vi at Mir-181c metylering er forbundet med magekreft via regulering av onkogene gener KRAS Hotell og NOTCH4 product: [13]. Nedregulering av mange mirnas gjennom metylering samtidig forekommer i kreftceller, og kan forsterke multiple-til-fler forhold mellom mirnas og mål.

I denne studien, for å validere multippel-til-flere relasjoner mellom mirnas og mål i kreftceller, vi viste at to par flere mirnas, MIR-224 og -452, og MIR-181c og -340, hadde flere mål gener og synergi redusert celleproliferasjon gjennom regulering av sine mål i menneske GC-celler.

Resultater

50 mirnas ble oppregulert i en GC Cell line, KATO-III, etter fem-aza-2'-deoxycytidine Behandling

For å identifisere kandidat mirnas at synergi påvirke deres målgener, vi re-analysert vår tidligere microarray data (GEO tiltredelse nr GSE16006) [13]. Vi vurderte at miRNA nivåer var oppregulert på 5-aza-2'-deoksycytidin (5-aza-CDR) behandling når netto intensiteter av bestemte 3 spots var mer enn 1,5 ganger. Videre har vi også utvalgte mirnas hvorav gjennomsnittene ble funnet å være økt mer enn tre ganger høyere på mikromatriseanalyse. Basert på disse nye kriteriene, fant vi at 50 mirnas ble oppregulert i en GC cellelinje, KATO-III (tabell S1). Vi bekreftet oppregulering av fem av seks representative forløper mirnas, det vil si MIR-145, -148a, -152, -224 og -340, etter fem-aza-CDR behandling av RT-PCR (figur 1A).

TargetScan Forut Common målgener av kandidaten mirnas

for å avgjøre hvorvidt epigenetiske regulerte mirnas har felles mål gener, vi søkte på TargetScan database (versjon 5.1) for deres felles mål. Ifølge TargetScan, kunne 50 mirnas klassifiseres i 46 grupper basert på deres frø sekvenser. TargetScan viste også at disse 46 gruppene kan målrette 6,460 gener. Blant disse målgener, valgte vi 13 hvor ekspresjon ble rapportert å være økt i GC i den GEO databasen (GEO aksesjonsnr GSE2685), eller for å være knyttet til magekreftutvikling (tabell S2). Her fokuserer vi på fire mirnas, MIR-152, -181c, -224 og -340, fordi vi allerede har rapportert at MIR-181c er epigenetiske nedregulert i GC [13] og CpG Øyene ligger i oppstrøms regionene tre andre mirnas (Figur 2A og C, og figur S1). Figur 2a viser også at MIR-452 er gruppert med MIR-224. TargetScan spådd at de fem mirnas kan regulere felles mål. For eksempel DPYSL2 plakater (Dihydropyrimidinase lignende to, også kjent som kollapser respons mekler protein 2, CRMP2
) blir målrettet av MIR-224, -452, og -181c, KRAS
av MIR-224, -452, -181c, -340 og -152, og MECP2 plakater (metyl CpG bindende protein 2) av MIR-181c og -340, henholdsvis (figur 3).

uttrykk av MIR-224, -452, -152 og -340 Redusert på DNA Hypermethylation i GC cellelinjer

Vi undersøkte involvering av epigenetiske forandringer i nedregulering av miRNAs. Ekspresjonen av MIR-224, -340 og -152 ble økt med 5-aza-CDR behandling i flere GC cellelinjer (figur 1B). Vi analyserte kvantitativt moden Mir-224 uttrykk i 9 GC cellelinjer og endetarmskreft (CRC) cellelinje. Ingen uttrykk for MIR-224 ble påvist i 7 av 10 kreftcellelinjer (figur 1C). Vi analyserte også ekspresjonen endring av MIR-224 /-452 klynge i KATO-III celler behandlet med en lav dose av 5-aza-CDR (0,2 umol /l), et histon deacetylase-inhibitor, trichostatin A (TSA, 0,3 umol /l), eller en kombinasjon av disse to medikamenter. KATO-III celler med lav-dose 5-aza-CDR behandling oppviste opp-regulering av MIR-224 /-452 klynge, mens TSA alene ikke forårsaker opp-regulering. Mir-224 /-452 klynge ble synergi oppregulert i KATO-III celler med kombinerte 5-aza-CDR og TSA behandling (figur 1D). Disse resultatene indikerer at MIR-224 og MIR-452 kan bli nedregulert gjennom DNA-metylering i GC-cellelinjer som på samme transkripsjonsenheten.

Det er blitt rapportert at intronic mirnas reguleres gjennom promotor metylering av verts gener [14], [15]. Ifølge resultatene av matematisk analyse, er det MIR-224 /-452 klynge og MIR-340 ligger i intron 6 i GABRE Hotell og intron 2 i RNF130
, henholdsvis, som begge inneholde tette CpG øyer bare i promotorområdene av sine vertsgener (figur 2A og C). Vi har undersøkt forholdet mellom ekspresjonsnivåer av disse mirnas og metylering status av deres vertsgener i GC-cellelinjer ved MSP analyse. GC cellelinjer uten Mir-224 uttrykk utstilt bare metylering signaler, mens uttrykk-positive cellelinjer viste sterke unmethylation mønstre (figur 2B). Et lignende forhold er registrert en MIR-340 i GC-cellelinjer (figur 2D). Disse dataene indikerer at uttrykk av disse miRNAs i GC cellelinjer kan bli brakt til taushet gjennom arrangøren metylering av sine verts gener.

epigenetiske regulerte mirnas kan være relatert til GC Cell Proliferation

For å avgjøre om epigenetiske regulert mirnas er tumor-undertrykkende eller ikke, vi evaluert effekten av 5-aza-CDR i siDICER1-transfektert KATO-III og DICER1 KO HCT116 (D1KO) celler (figur 4A). De ubehandlede KATO-III og foreldre HCT116 cellene viste bremses spredning etter behandling med 5-aza-CDR. På den annen side, i siDICER1-transfekterte KATO-III og D1KO celler, effekten av 5-aza-CDR-behandling på celleformering ble svakt i begge tilfeller. Disse resultater antyder at effekten av 5-aza-CDR ble redusert ved lave eller null-DICER1 celler, og at epigenetiske regulerte mirnas spiller en viktig rolle i GC og CRC-celler.

For å analysere sammenhengen mellom disse mirnas og 13 målgener vist i tabell S2, transfektert vi KATO-III celler med siDICER1 og /eller behandlet med 5-aza-CDR. Selv om uttrykket av tre ( DPYSL2
, KRAS Hotell og MECP2
) av de 13 genene ble redusert etter 5-aza-CDR behandling, uttrykket av disse genene gjorde ikke endre på 5-aza-CDR behandling etterfulgt av transfeksjon av siDICER1 (figur 4B).

kombinatoriske transfeksjon av MIR-224 og -452 trykt GC Cell Proliferation

Vi transfektert GC cellelinjer med MIR-224 og /eller -452 imiterer som en representant for miRNA klynger, eller en negativ kontroll, og deretter gjennomført vann løst tetrazolium-8 (WST-8) analyser. Sytti-to timer etter transfeksjon, observerte vi at ektopisk uttrykk for MIR-224 eller -452 undertrykte veksten av to cellelinjer, KATO-III og AGS (figur 5A). Spesielt, kombinatoriske transfeksjon av MIR-224 og -452 ligner omfattende redusert vekst av to GC cellelinjer (figur 5A).

Mir-224 /-452 Cluster samarbeide Redusert uttrykk for DPYSL2 Hotell og KRAS

for å undersøke hvorvidt MIR-224 /-452 klynge faktisk er relatert til regulering av DPYSL2 Hotell og KRAS
, analyserte vi uttrykk for DPYSL2
etter transfeksjon av KATO-III og AGS celler med MIR-224 /-452 klynge alene eller sammen. Vi gjennomførte RT-PCR og Western blot analyser. DPYSL2 Hotell og KRAS
mRNA nivåer ble redusert etter transfeksjon med MIR-224 eller Mir-452 etterligne (figur 5B). Interessant, i tilfelle av kombinatoriske transfeksjon med MIR-224 og -452, ekspresjon av disse målgener ble ytterligere nedregulert (figur 5B). Nedregulering av DPYSL2 ble også observert på proteinnivå i de to cellelinjer (figur 5C). Vi har også undersøkt uttrykket nivåer av fem andre gener, MECP2, MYC, JUNB, MUC1 Hotell og SETDB1
, som ikke ble vist som mål for Mir-224 eller -452 av TargetScan. Som forventet ble det ikke uttrykks endringer av disse fem gener funnet i KATO-III celler etter transfeksjon med MIR-224 eller -452 (figur S2). Disse data tyder på at MIR-224 og -452 spesielt nedregulert DPYSL2 Hotell og KRAS
.

DPYSL2
var assosiert med GC Cell Proliferation

Vi har undersøkt effekten av knockdown av DPYSL2
, som viste seg å være et mål på MIR-224 /-452 klynge, på celleproliferasjon. Transfeksjon av DPYSL2
siRNA tydelig redusert nivåene av DPYSL2
transkripsjoner (figur 5D), og hemmet veksten av AGS og KATO-III celler 72 timer etter knockdown av DPYSL2
(figur 5E), noe som indikerer at DPYSL2 har en onkogen aktivitet.

kombinatoriske Transfeksjon av MIR-340 og -181c trykt GC celleproliferasjon, og Induced nedregulering av KRAS
og MECP2
Expression

Som et annet eksempel på flere-til-flere relasjoner mellom microRNAs og målgener, vi analysert sammenhengen mellom MIR-340 /-181c og KRAS /MECP2 .
Når MIR-340 og MIR-181c ble transfektert inn i KATO-III celler, spredning var synergi nedregulert av to mirnas (Figur 6A). For å avgjøre hvorvidt epigenetiske regulert MIR-340 og MIR-181c samarbeide påvirke sine mål, vi analyserte mRNA nivåer av KRAS Hotell og MECP2.
På RT-PCR-analyse, KRAS Hotell og MECP2
ble funnet å være nedregulert av MIR-340 og MIR-181c alene, eller kombinatoriske transfeksjon i KATO-III celler (figur 6B). Som for de fire genene, MYC, JUNB, MUC1 Hotell og SETDB1
, viser ingen spådd sider for disse to mirnas av TargetScan, uttrykket nivåer ble ikke endret i denne studien. Representative data er vist i figur 6B. Dermed kan effekten av MIR-340 og -181c være spesifikke for deres felles mål gener samt MIR-224 og -452.

Expression og Metylering Status for MIR-224 og -340 i Primær GC Cases

Vi undersøkte metylering status for MIR-224 og -340 i grunnskolen GC tilfeller. Metylerte mønstre av MIR-224 ble påvist i 15 av 26 (57,7%) primære GC vev (Figur 7A og tabell 1). Sammenkoblet ikke-kreft mage slimhinner knapt viste en metylering mønster av MIR-224. Neste, vi kvantitativt undersøkt MIR-224 nivåer i grunnskolen GC vev og tilsvarende ikke-kreft slimhinner av TaqMan RT-PCR. En betydelig reduksjon av Mir-224 uttrykk i GC vev ble observert i metylering-positive krefttilfeller sammenliknet med i metylering-negative enere og ikke-kreft mage slimhinner (figur 7C).

Vi videre analysert DPYSL2
mRNA nivåer i sammenligning med metylering status for MIR-224 i GC vev: GCer med MIR-224 metylering (Ca MIR-224 MT), GCS med MIR-224 unmethylation (Ca MIR-224 Un), og ikke -cancerous vev med unmethylation (N MIR-224 Un). DPYSL2
mRNA nivå i "Ca MIR-224 Mt" gruppen var signifikant høyere enn de i "N MIR-224 Un" og "Ca MIR-224 Un" grupper, p = 0,049 og p = 0,035, henholdsvis (figur 7D). Dermed er det en sammenheng mellom metylering status for MIR-224 og DPYSL2
uttrykk i GC vev.

Den MIR-340 metylering frekvens var relativt lav i primær GC vev testet (4 26 år, 15,4%) (figur 7B og tabell 1), mens ingen av 26 paret ikke-kreft mage slimhinner utstilt åpen metylering mønstre av MIR-340. Som for MIR-152 metylering analyse, vi prøvde tre primersett utformet i oppstrøms regionen MIR-152 inneholder CpG øyer (Figur S1), men ingen av dem helt matchet Mir-152 uttrykk på MSP analyser (data ikke vist).

Diskusjoner

Selv om det har blitt rapportert at uttrykket av noen miRNAs er redusert i flere kreftformer gjennom DNA metylering, de fleste av rapportene beskrevet som forholdet mellom avvikende uttrykk for miRNAs og dets mål gener var en-til-en, en-til-flere eller multiple-til-en. For å undersøke muligheten for flere til flere relasjoner mellom mirnas og mål i kreftceller, fokuserte vi på to kombinasjoner av mirnas i GC-celler, Mir-224 /-452 klynge, og MIR-181c og -340, i denne studien . Vi fant at de to sett av mirnas, MIR-224 og -452, og MIR-181c og -340, hadde flere mål gener, DPYSL2 Hotell og KRAS
, og KRAS
og MECP2
, henholdsvis, og synergistisk redusert celleproliferasjon i humane cellelinjer GC. Det er bemerkelsesverdig at et onkogen, KRAS product: [16], ble funnet å være målrettet av fire mirnas, selv om kandidat bindingssteder for de fire mirnas er forskjellige i 3'-UTR av KRAS
(TargetScan). Vi har tidligere rapportert at Mir-181c nedregulert NOTCH4
også [13]. Dermed multiple-til-flere relasjoner mellom mirnas og mål ble antydet ikke bare av databaseanalyser, men også ved transfeksjon forsøk med menneskeceller.

MIR-224- og /eller -340 utfoldelse-negative GC cellelinjer utstilte hypermethylation signaler på MSP analyse og uttrykk for MIR-224 og -340 restaurert på demethylating middel behandling. Videre hypermethylation av MIR-224 og -340 ble sett oftere i primær GCer enn tilsvar noncancerous slimhinner. I MIR-224 metylering-positive tilfeller uttrykk for MIR-224 var betydelig lavere enn i metylering-negative. Disse dataene indikerer sterkt at avvikende DNA metylering er en av de viktigste mekanismene bak nedregulering av MIR-224 og -340 i GC-celler.

Vi viste at hemming av miRNA behandling av siDICER1 transfeksjon eller bruke DICER1 knockout celler minsket effekten av 5-aza-CDR, det vil si redusert celleproliferasjon og nedregulering av målgener, i GC og CRC-celler. Det har blitt rapportert at overflod av DICER1, enzymet som katalyserer det siste trinnet av miRNA modning, er direkte forbundet med tumorprogresjon [17]. Disse resultatene tyder på at avvikende regulering av miRNA modning bidrar til GC og CRC formasjon.

Vi fant at MIR-224 /-452 klynge ble abnormt nedregulert i GCer gjennom hypermethylation. Avvikende uttrykk for MIR-224 har også blitt rapportert i andre svulster. Uttrykk av MIR-224, la-7F og MIR-516a er redusert i eggstokkreft, og de synergi regulere uttrykk for kallikrein relaterte peptidase 10 (KLK10) [18]. MIR-224 er nedregulert i metotreksat-resistente CRC cellelinjer sammenlignet med i sensitive celler [19]. Her finner vi også avdekket at metylering status for MIR-224 ble korrelert med DPYSL2
nivå i menneskelig GCer. Til sammen spiller MIR-224 en viktig rolle som en svulst-undertrykkende miRNA i GC så vel som i flere andre kreftformer. I kontrast er MIR-224 oppregulert i levercellekarsinom [20] og Medulloblastomas [21] sammenlignet med i normalt vev. Dermed er videre studier er nødvendig for å avklare hvilken rolle MIR-224 i kreftutvikling.

Vi har undersøkt de felles målene for epigenetiske nedregulert miRNAs. DPYSL2
ble vist å bli nedregulert av MIR-224 og -452. DPYSL2 spiller en viktig rolle i etableringen av neuronal polaritet [22]. DPYSL2 er også involvert i veiene som regulerer spredning av ikke-nevronale celler gjennom fosforylering av regulatoriske proteiner. DPYSL2 gjennomgår dynamiske fosforylering endringer i respons til kontakt hemming-indusert quiescence og hyperfosforylering av DPYSL2 oppstår i en tumor [22]. Selv om rollen DPYSL2 i GCer er ikke klart, vår siRNA-baserte knockdown av DPYSL2 uttrykk induserte en reduksjon av spredning i de to GC cellelinjer, noe som tyder på onkogene aktivitet DPYSL2.

I sammendraget, våre funn tyder på at multiple-til-flere relasjoner mellom mirnas og målgener virkelig eksisterer i GC. Det er sannsynlig at avvikende metylering reduserer uttrykk for flere kreftundertrykkende mirnas som MIR-224, -452, -340 og -181c, som deretter indusere overuttrykk av flere onkogene gener, som KRAS
DPYSL2
, og MECP2
. Disse unormale flere-til-flere relasjoner mellom mirnas og mål vil være en av de viktigste mekanismene bak magekreftutvikling. Det er derfor meget mulig at epigenetiske medikamenter kan normalisere ekspresjon av ikke bare tumorundertrykkende gener, men også flere tumorundertrykkende mirnas, noe som resulterer i reduksjon av unormal mange-til-fler forhold mellom mirnas og mål, og kan således bli gode terapeutiske legemidler mot kreft.

Materialer og metoder

etikk erklæringen

Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle fag, og etikkutvalg av Tokyo Medical and Dental University School of medisin godkjent denne forskningen.

celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og vevsprøver

Vi studerte 9 GC cellelinjer (KATO-III, MKN45, AGS, MKN74, TGBC11TKB, HSC59, HSC43, HSC58 og GCIY), 2 CRC cellelinjer (HCT116 og DICER1
slå ut HCT116 [23]), og 26 primær GC tilfeller. MKN45, MKN74, TGBC11TKB og GCIY ble kjøpt fra Riken cell bank, og KATO-III og AGS var fra ATCC (American Type Cell Collection). HSC59, HSC43 og HSC58 ble hentet fra Dr. Kazuyoshi Yanagihara [24], [25]. KATO-III, ble MKN45, MKN74, HSC59, HSC43 og HSC58 dyrket i RPMI 1640, og AGS, TGBC11TKB, GCIY og de to CRC-cellelinjer in Dulbeccos modifiserte Eagle medium, minimalt essensielt medium eller i McCoys 5A, supplert med 10% føtalt bovint serum. Kirurgisk resected prøver fra 26 primær GC pasienter ble tilfeldig hentet fra Affiliated Hospital of School of Medicine, Tokyo Medical and Dental University.

I silico analyse

Vi henvist til GEO database for miRNA og genuttrykk profiler (GEO tiltredelse No. GSE16006 og GSE2685). Vi har også brukt miRNA målet databasen "TargetScan".

Drug Treatment of Cells og RNA Utvinning

For demetylering studier ble cellene daglig behandlet med 5 mikromol /l 5-aza-CDR (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) i 72 timer. Vi behandlet også celler med 0,3 umol /l TSA alene, og med en kombinasjon av 0,2 umol /l 5-aza-CDR og TSA. Total RNA ble isolert ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) eller en miRNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Tyskland).

Kvantitativ Real-time Reverse Transcription-polymerase kjedereaksjon

sann~~POS=TRUNC tids~~POS=HEADCOMP revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) ble utført ved anvendelse av en StepOne real-time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA), EagleTaq Master Mix med ROX (Roche, Mannheim, Tyskland), en TAQMAN revers transkripsjon kit (Applied Biosystems), og TaqMan miRNA analyser (Applied Biosystems), i henhold til produsentens instruksjoner. Uttrykket nivåer av miRNA ble beregnet fra mengden av target miRNA forhold til den for RNU6B som en kontroll for å normalisere startende inntaks av total RNA.

Metylering Analyse

Bisulfite behandling av DNA var utføres med Methylamp (Epigentek, Brooklyn, New York). Metylering-spesifikke polymerase kjedereaksjon (MSP) analyser ble utført som tidligere beskrevet [26]. Primersekvensene og PCR-produkt størrelser er vist i Tabell S3.

Synthetic miRNA Transfeksjon

KATO-III og AGS-celler ble transfektert med et forløpermolekyl som etterligner MIR-224, -452, -340 eller -181c, eller kryptert sekvens miRNA (Sigma) for å gi en sluttkonsentrasjon på 25-50 nmol /l ved hjelp av en electroporator, Neon (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. På 24-72 timer etter transfeksjon ble cellene høstet for RT-PCR eller Western blot analyse.

celleproliferasjonsanalyse

MIR-etterligne-transfektert KATO-III og AGS celler ble sådd ut i en x 10 ^{3 eller 1 x 10 4 celler per brønn i 96-brønners plater. Celleproliferasjon ble evaluert på dag 1-4 etter transfeksjon ved å bestemme antall celler med celleformering reagens WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Mashikimachi, Japan), i henhold til produsentens instruksjoner.}

miRNA Target Tippe og Western blotting

De predikerte målene for mirnas og deres målse ble analysert ved hjelp av TargetScan. De mRNA ekspresjonsnivåer av de forutsagte målene i transient transfekterte celler ble analysert 24 timer etter transfeksjon ved RT-PCR. Western blot analyser ble utført som tidligere beskrevet [26]. Det primære antistoff som ble benyttet var kanin anti-DPYSL2 (1:500;Ϋ3, Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Vi brukte mus anti-α-tubulin (1:1000; sc-8085, Santa Cruz Biotechnology) som en intern kontroll for Western blotting. De sekundære antistoffene som ble anvendt alkalisk fosfatase-konjugert anti-kanin-IgG og anti-mus IgG (1:2000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Blottene ble utviklet med ImmunoStar AP Substrat (Bio-Rad Laboratories).

Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Skjematisk fremstilling av COPZ2
region som inneholder MIR-152. Fylte bokser viser eksoner av COPZ2
A og en tom boks betegner uoversatt regionen COPZ2
. En bøyd pil viser transkripsjon start stedet for COPZ2
. En vertikal pil viser plasseringen av MIR-152. Vertikale linjer indikerer CpG nettsteder. Pilspisser indikerer regionene undersøkt for MSP
doi:. 10,1371 /journal.pone.0062589.s001 plakater (TIFF)
Figur S2.
Effekter av transfeksjon av MIR-224 og -452 i KATO-III celler. RT-PCR-analyser etter transfeksjon med MIR-224 og /eller -452. Ekspresjon av målgener ble analysert 48 timer senere ved RT-PCR. MIR-224 og -452 spesielt nedregulert DPYSL2 Hotell og KRAS
, men ikke andre fem gener undersøkt, noe som er i samsvar med resultatene av database analyse (figur 3).
doi: 10,1371 /journal.pone.0062589.s002 plakater (TIFF)
Tabell S1.
Expression profilering av menneskelige miRNAs i KATO-III celler etter 5-aza-CDR behandling
doi:. 10,1371 /journal.pone.0062589.s003 plakater (XLSX)
Tabell S2.
Liste over målgener som ekspresjon undersøkte vi ved hjelp av RT-PCR etter behandling med eller uten 5-aza-CDR, og transfeksjon med 20 nmol /L av siDICER1 eller kryptert siRNA
doi:. 10,1371 /journal.pone .0062589.s004 product: (XLSX)
tabell S3.
Sekvenser av primere brukt i denne studien
doi:. 10,1371 /journal.pone.0062589.s005 plakater (XLSX)

Takk

Vi ønsker å takke Dr. Bert Vogel for å gi DICER1 knock-out HCT116 cellelinje.

• PLoS ONE: Hypoksi Stimulerer EMT av magekreft celler gjennom Autocrine TGFB Signaling
• PLoS ONE: Flotillin2 Expression korrelerer med HER2 Nivåer og dårlig prognose i Gastric Cancer