PLoS ONE: Reg IV er et direkte mål av Tarm Transkripsjonell Factor CDX2 i Gastric Cancer

Abstract

REG4
, som koder Reg IV protein, er medlem av kalsiumavhengig lectin super og potent aktivator av epidermal vekstfaktor reseptor /Akt /aktivator protein-1 signalveien. Flere menneskerettighets kreft overuttrykker Reg IV, og Reg IV uttrykk er assosiert med tarm fenotype differensiering. Men regulering av REG4
transkripsjon er fortsatt uklart. I denne studien undersøkte vi om CDX2 regulerer Reg IV uttrykk i magekreft (GC) celler. Uttrykk for Reg IV og CDX2 ble analysert ved Western blot og kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon i 9 GC cellelinjer og to tykktarm kreft cellelinjer. Funksjonen til det 5'-flankerende region av REG4
genet ble karakterisert av luciferase-assay. I 9 GC cellelinjer, ble endogen Reg IV og CDX2 uttrykk godt korrelert. Ved hjelp av en østrogen reseptor-regulert form av CDX2, ble rask induksjon av Reg IV uttrykk observert i HT-29 celler. Reportergen-analyser avslørte en viktig rolle ved transkripsjon for konsensus CDX2 DNA-bindingselementer i den 5'-flankerende region av REG4
genet. Kromatin immunoutfellingsstudier analyser viste at CDX2 binder direkte til 5'-flankerende område av REG4
. Disse resultatene indikerer at CDX2 protein regulerer direkte Reg IV uttrykk

Citation. Naito Y, Oue N, Hinoi T, Sakamoto N, Sentani K, Ohdan H, et al. (2012) Reg IV er et direkte mål av Tarm Transkripsjonell Factor CDX2 i magekreft. PLoS ONE 7 (11): e47545. doi: 10,1371 /journal.pone.0047545

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

mottatt: May 24, 2012; Akseptert: 12. september 2012; Publisert: 02.11.2012

Copyright: © 2012 Naito et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grants-in-støtte til forskning fra departementet for utdanning, kultur, vitenskap, sport og teknologi i Japan, og til dels av en Grant-in-Aid for tredje Omfattende 10-år Strategi for kontroll av kreft og for kreftforskning fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferds av Japan, og for National Institute of Biomedical Innovation (Program for fremme av grunnleggende studier i helsefag). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er en av de mest vanlige humane kreftformer i verden. Kreft oppstår som et resultat av flere genetiske og epigenetiske forandringer [1]. Vi har tidligere utført serie analyse av genuttrykk (SAGE) av fire primær GCer og identifisert flere GC-spesifikke gener [2]. Av disse genene, gjenoppfriske holme-avledet familiemedlem fire plakater ( REG4
, som koder Reg IV protein) er en kandidat genet for kreftspesifikke uttrykk [3]. REG4
er medlem av REG
genet familie, som tilhører den kalsiumavhengig lektin super. REG4
ble opprinnelig identifisert ved high-throughput sekvensanalyse av en stor inflammatorisk tarmsykdom cDNA-bibliotek [4]. Reg IV er en potent aktivator av den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) /Akt /aktivator protein-1 (AP-1) signalveien i kolon kreftceller og øker ekspresjon av Bcl-2, Bcl-xl og Survivin, som er proteiner forbundet med inhibering av apoptose [5]. Forsterkning av REG4
genet har blitt rapportert i bukspyttkjertelkreft [6]. Reg IV har blitt identifisert som en av de genene oppregulert i kreft-initiere celler [7]. Vi har tidligere undersøkt effekten av tvungen ekspresjon av Reg IV i GC-cellelinje. Vi viste at Reg IV hemmer 5-fluorouracil (5-FU) -indusert apoptose gjennom EGFR aktivering i GC-celler [8]. I motsetning til dette ble Reg IV-overekspresjon celler ingen signifikant forskjell i proliferasjon og invasjon aktivitet sammenlignet med celler transfektert med tom vektor [8]. Disse funnene støtter oppfatningen om at Reg IV protein deltar i magekreft

GC kan deles inn i fire fenotyper ifølge slimstoffekspresjon. Gastrisk eller foveolar fenotype; intestinal fenotype; intestinal og mage blandet fenotype; og hverken mage eller tarm-fenotype [9]. Forskjellige genetiske endringer synes å være forbundet med gastrisk og intestinal fenotype GC [10]. I våre tidligere observasjoner, ble Reg IV uttrykt i 30% av GC tilfeller og ble korrelert med tarm fenotype [11]. Et antall av immunhistokjemiske analyser av Reg IV er blitt rapportert i humane cancere [11] - [20]. Generelt er disse analysene rapportert at Reg IV er uttrykt i adenokarsinomceller viser en tarm fenotype. Det har blitt rapportert at Reg IV ekspresjon induseres ved GLI1, som er et nøkkel transkripsjonen faktor i pinnsvin signaleringsveien [21], eller av vekstfaktorer så som EGF, transformerende vekstfaktor-α (TGF-α), hepatocytt-vekstfaktor (HGF), eller basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) [22]. Men disse molekylene er usannsynlig å gjøre rede for sammenhengen mellom Reg IV uttrykk og tarm fenotype differensiering.

Vi har tidligere funnet at uttrykk for Reg IV ble korrelert med CDX2 uttrykk [11]. CDX2 er en pattedyrhalerelatert tarmtranskripsjonsfaktor og viktig for opprettholdelse av intestinale epitelceller [23], [24]. Flere linjer av bevis tyder på at intestinal metaplasi i mage og tarm fenotype GC er forbundet med ektopisk ekspresjon CDX2 [9], [25]. I denne studien undersøkte vi om CDX2 regulerer Reg IV uttrykk i GC og funnet ut at CDX2 binder direkte til 5'-flankerende område av REG4
genet og forbedrer promoter aktivitet.

Resultater

Reg IV og CDX2 Expression er korrelert i GC Cells

Vi først undersøkt induksjon av Reg IV uttrykk ved CDX2 i GC cellelinjer. Western blot-analyse av CDX2 i 9 GC cellelinjer avdekket at ingen eller lav-nivå ekspresjon av CDX2 ble påvist i MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, og KATO-III (fig. 1A). For å bestemme om CDX2 og Reg IV ekspresjon ble tett korrelert i GC-celler, Western blot og kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR) av Reg IV ble utført på 9 GC-cellelinjer. Som vist på fig. 1A, Reg IV protein uttrykk ble bare påvist i de 3 cellelinjer med høye nivåer av REG4
transkripsjoner målt ved QRT-PCR. Av de fem GC cellelinjer med CDX2 protein uttrykk, 2 cellelinjer (MKN-en og MKN-28) manglet påvisbare uttrykk for REG4
transkripsjoner og protein. Cellelinjene med ikke målbart CDX2 protein uttrykk (MKN-7, TMK-en, HSC-44PE og KATO-III) viste ikke REG4
transkripsjoner eller protein (Fig. 1a).

Deretter genereres vi en polyklonal populasjon av MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, og KATO-III celler som uttrykker høye nivåer av CDX2 ved infeksjon av cellene med replikasjons-defekte retrovirus som bærer en full-lengde human CDX2 cDNA fordi ingen eller lav-nivå ekspresjon av CDX2 ble påvist i disse cellelinjene. Imidlertid overekspresjon av CDX2 mislyktes i å aktivere Reg IV ekspresjon av Western blot (data ikke vist). Fordi det er mulig at CDX2 alene ikke er tilstrekkelig for å aktivere Reg IV ekspresjon, ekspresjon av CDH17 plakater (som koder for LI-cadherin-protein), som er et av målene for CDX2 [24], ble også undersøkt. Imidlertid aktivering av LI-cadherin-ekspresjon ble ikke funnet i MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, og KATO-III celler som uttrykker høye nivåer av CDX2 (data ikke vist). Fordi vi viste aktivering av LI-cadherin ekspresjon av CDX2 i HT-29 colon cancer-cellelinje [24], ble induksjon av Reg IV ekspresjon undersøkt i den samme cellelinje. Som vist på fig. 1B, induksjon av Reg IV ekspresjon ble påvist i HT-29 celler infisert med retrovirus som bærer en full-lengde human cDNA CDX2. Vi har også generert en polyklonal populasjon av SW480 (colon cancer-cellelinje) celler som uttrykker høye nivåer av CDX2 ved infeksjon av cellene med replikasjons-defekte retrovirus som bærer en full-lengde human cDNA CDX2. Som vist på fig. 1B, induksjon av Reg IV uttrykk ble funnet i SW480 celler infisert med retrovirus bærer en full-lengde human CDX2 cDNA. Disse resultatene tyder på at Reg IV ekspresjon kan bli indusert ved CDX2 i cellelinjer avledet fra tykktarmskreft. Fordi i intestinal metaplasi av magen, CDX2 og Reg IV ekspresjon er godt korrelert [11], ved bruk av en tykktarmskreft cellelinje kan være egnet for modellen av intestinal metaplasi.

For bedre å vurdere forholdet mellom CDX2 og Reg IV uttrykk, studerte vi Reg IV uttrykk i en HT-29-avledet tråd med strengt regulert CDX2 aktivitet. Vi har anvendt et polyklonalt HT-29 cellelinje som var blitt transdusert med den pCDX2-ER vektor. Den pCDX2-ER vektor koder for et kimært protein hvor full-lengde CDX2 sekvensene er sammensmeltet oppstrøms for en mutert østrogenreseptor (ER) ligand-bindende domene. Den muterte ER ligand-bindende domene ikke lenger binder østrogen, men har beholdt evnen til å binde tamoxifen. Behandling av HT-29 /CDX2-ER-cellelinjen med 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) resulterte i sterk induksjon av Reg IV protein ekspresjon i løpet av 48 timer (fig. 1C). Disse resultatene indikerer at Reg IV er en direkte eller primært mål-genet reguleres ved CDX2. Det er imidlertid ikke tilstrekkelig for å aktivere Reg IV uttrykk CDX2 alene.

Hemming av CDX2 av RNA interferens (RNAi) Resultater i nedregulering av Reg IV i GC Cells

For å avgjøre om CDX2 er nødvendig for Reg IV ekspresjon i GC-celler, analyserte vi effekten av inhibering av CDX2 ekspresjon av RNAi i nivået av Reg IV ekspresjon i HSC-39-cellelinjen fordi høye endogene CDX2 og Reg IV ekspresjon ble påvist i HSC-39-cellelinjen. CDX2 spesifikke små interfererende RNA (siRNAs) undertrykte betydelig CDX2 protein uttrykk 3 dager etter transfeksjon, og uttrykk for Reg IV transkripsjon ble nedregulert ca 50% av CDX2 sirnas i HSC-39 sammenlignet med nivåene i kontroll siRNA-behandlede celler ( fig. 1D). Disse resultatene indikerer at CDX2 er involvert i å opprettholde Reg IV genuttrykk.

Funksjonell Karakterisering 5'-flankerende område av REG4
Gene av Luciferase Assay

For å identifisere potensielle CDX2 -binding steder i REG4
promoter-regionen, et søk av de genomiske sekvenser like 5 'for den presumptive transkripsjon start stedet ble utført ved hjelp av en konsensus bindende element for CdxA kylling hale
homolog (5'-A, A /T, T, A /T, A, T, A /G-3 ') [26] og en tidligere beskrevet søkealgoritme [27]. Vi fant fire antatte CDX2-bindingsseter i to kilobase (kb) 5'-flankerende område av REG4
genet (fig. 2A). Disse var: reiser A (5'-AATAATA-3 ', -1828 til -1834), reiser B (5'-CTTTACAG-3', -901 til -908), område C (5'-TTTTATGG-3 ', -114 til -121), reiser D (5'AATAATA -3', -90 til -96). For å vurdere rollen til disse presumptive CDX2-bindingsseter i regulering REG4
transkripsjon, ulike reporter genkonstruksjoner ble generert. Som vist på fig. 2B, reporter genkonstruksjoner som inneholder 2,1, 1,2 eller 0,6 kb av 5'-flankerende sekvens fra REG4
genet viste sterk aktivitet i HSC-39 celler, som viser sterk endogen uttrykk for REG4
utskrifter og protein. Til sammenligning MKN-1-celler har liten endogent REG4
transkripsjon og viste liten eller ingen transkripsjonen aktivitet indusert av 2,1, 1,2 eller 0,6 kb REG4
reporter genkonstruksjoner (data ikke vist) . REG4
reporter genkonstruksjoner inneholder basepar -116 til 58 og -87-58 hadde redusert aktivitet i HSC-39 celler (figur 2B.), Noe som indikerer at sekvenser mellom basepar -634 og - 116 spiller en nøkkelrolle i å aktivere REG4
transkripsjon. Videre analyserte vi én og flere mutasjoner i presumptive CDX2-bindingsseter i 5'-flankerende område av REG4
genet ved hjelp av HSC-39 celler (Fig. 2C). Som forventet, presumptive CDX2-bindingssete C, som ligger mellom basepar -634 og -116, spiller en avgjørende rolle i å aktivere REG4
transkripsjon.

CDX2 Direkte binder seg til 5 ' tilgrensende region REG4
Gene

for å analysere om CDX2 binder direkte til de antatte CDX2-bindingsseter i REG4
5'-flankerende område, vi utførte kromatin immunpresipitering (chip) analyser ved hjelp av HSC-39 celler. Bruke 6 primere for REG4
5'-flankerende område (fig. 3A), vi gjenvunnet DNA-fragmenter som inneholder REG4
5'-flankerende område av primer 1, som omfatter presumptive CDX2- bindingssete C (fig. 3B). DNA-fragmenter fra den 5'-flankerende region av REG4
, som ble dannet ved anvendelse av primerne 2, 3, 4, 5 og 6 slik at de ikke inneholder presumptive CDX2 bindingsseter, ble ikke gjenvunnet ved anti- CDX2 antistoff. Spesifisiteten til utvinning av REG4
promoter regionen etter brikke med anti-CDX2 antistoff ble vist av det faktum at andre irrelevant DNA-fragmenter mangler CDX2-bindingsseter (f.eks ekson 3 av CDX1
genet) ble ikke gjenopprettet (fig. 3B). I tillegg mock immunoprecipitation (mus IgG) ga noen REG4
eller CDX1
-spesifikke DNA-fragmenter (fig. 3B). Alle disse funnene tyder på at CDX2 aktiverer REG4
transkripsjon ved direkte binding til sekvenser i 5'-flankerende område av genet.

Trimethylation av Histone H3 Lysin 27 (H3K27me3) på REG4
Arrangøren i GC cellelinjer

Selv om CDX2 protein uttrykk ble funnet i MKN-en og MKN-28 cellelinjer, disse 2 cellelinjer manglet påvisbare uttrykk for REG4
transkripsjon og protein. Fordi det har blitt rapportert at DNA hypermethylation av CpG-øyer er forbundet med stanse av flere gener [28], undersøker vi hvorvidt DNA-metylering indusert transcriptional inaktivering av Reg IV i MKN-1 og MKN-28-celler. Vi behandlet disse cellene med en demethylating agent, 5-aza-2'-deoksycytidin (Aza-DC) og deretter utførte QRT-PCR. Imidlertid Reg IV ekspresjon ble ikke gjengitt i disse cellelinjer (data ikke vist), noe som tyder på at DNA-metylering er ikke sannsynlig å påvirke Reg IV uttrykk. Det er også rapportert at H3K27me3 har vært forbundet med undertrykt genekspresjon [29]. Vi undersøkt videre H3K27me3 i GC cellelinjer. For å bestemme berikelse av H3K27me3 på REG4
promoter i GC cellelinjer, chip ble utført. I MKN-en og MKN-28 cellelinjer, H3K27me3 nivåer på REG4
promoter-regionen var høy, mens i HSC-39 cellelinje, H3K27me3 nivå på REG4
promoter-regionen var lav (fig. 3C). Disse resultatene tyder på at lukkede kromatinstruktur av REG4
arrangøren kan hemme Reg IV uttrykk ved CDX2.

Diskusjoner

Selv om det har blitt rapportert at Reg IV uttrykk er indusert av GLI1 [21] eller EGF [22], disse molekylene er usannsynlig å gjøre rede for sammenhengen mellom Reg IV og tarm differensiering. I denne studien, viste vi at endogen CDX2 og Reg IV uttrykk var godt korrelert i GC cellelinjer. I tillegg bruker en ER-regulert form av CDX2, fant vi at det var rask induksjon av Reg IV uttrykk etter fire-OHT behandling. Reporter gen-analyser avslørte en viktig rolle for konsensus CDX2 DNA bindende elementer i REG4
promoter-regionen i sin transkripsjon. Påfølgende chip analyser viste at CDX2 binder direkte til REG4
promoter. Vi har tidligere vist at det i primær GC vev og intestinal metaplasi av magen, CDX2 og Reg IV ekspresjon ble godt korrelert [11]. Disse resultatene indikerer at CDX2 protein regulerer direkte Reg IV ekspresjon i GC og intestinal metaplasi av magen.

CDX2 er overuttrykt i tarm fenotype GC og i intestinal metaplasi av magen [9], [25]. I motsetning til dette ble tap av CDX2 ekspresjon observert i et delsett av primær kolorektal kreft, vanligvis i dårlig differensierte kolorektal kreft [30]. Betydningen av endring av CDX2 ekspresjon i humane kreftformer er fortsatt uklart, og derfor er det viktig å definere målet gener som er nedstrøms av CDX2. Vi har identifisert flere CDX2 regulerte gener som CDH17 plakater (som koder for LI-cadherin) [24], HEPH plakater (som koder hephaestin) [31], ABCB1
(som koder for multiresistens 1) [32], og dsc2 plakater (som koder desmocollin 2) [33]. Blant disse genene, ABCB1
ble opprinnelig identifisert som en overuttrykt og amplifisert gen i multiple medikamentresistente celler, og dets produkt, P-glykoprotein synes å spille en kritisk rolle i resistens [34]. Tidligere rapporterte vi at tvangs ekspresjon av Reg IV i GC-celler inhiberte 5-FU-indusert apoptose ved induksjon av Bcl-2 og dihydropyrimidin-dehydrogenase [8]. Til sammen er det mulig at i tarm fenotype GC, uttrykk (eller ektopisk uttrykk) av CDX2 induserer Reg IV og multiresistens 1 uttrykk, noe som resulterer i en økning i narkotika-motstand. Faktisk har det blitt rapportert at postoperativ kjemoterapi er ikke gunstig for pasienter med tarm fenotype GC [35].

Selv om våre data støtter det syn at CDX2 spiller en rolle i regulering av REG4
transkripsjon via binding til promoter-regionen, flere funn tyder på at CDX2 alene er ikke tilstrekkelig for å aktivere REG4
uttrykk. I denne studien, genererte vi en polyklonal populasjon av MKN-7, TMK-en, HSC-44PE og KATO-III celler som uttrykker høye nivåer av CDX2 infeksjon med retrovirus bærer en full-lengde human CDX2 cDNA. Men overekspresjon av CDX2 unnlatt å aktivere Reg IV uttrykk. I GC cellelinjer, ingen av cellelinjer med ikke målbart CDX2 protein uttrykk hadde påvisbare REG4
utskrifter og protein. Derfor er CDX2 kreves for Reg IV ekspresjon, men CDX2 alene er ikke tilstrekkelig for å aktivere Reg IV uttrykk. I foreliggende studie ble ni GC cellelinjer undersøkt. Opprinnelsen til cellelinjene var som følger. Den MKN-7, MKN-28, og MKN-74 cellelinjer ble etablert fra tarmtypen GC. De TMK-1 og MKN-45 cellelinjer ble etablert fra diffuse typen GC. Den KATO-III, HSC-39, og HSC-44PE cellelinjer ble etablert fra signetring cell carcinoma. Den MKN-en cellelinje ble etablert fra adenosquamous cell carcinoma. Fordi i intestinal metaplasi av magen, blir CDX2 og Reg IV uttrykk vel korrelert, kan GC-cellelinjer etablert fra diffuse Type GC eller signet ring cellekarsinom ikke være egnet for analyse av Reg IV induksjon ved CDX2. Faktisk kan Reg IV uttrykk induseres av CDX2 i cellelinjer avledet fra tykktarmskreft i denne studien. Videre viste vi at H3K27me3 nivåer på REG4
promoter-regionen var høy i MKN-en og MKN-28 GC cellelinjer. Disse 2 cellelinjer manglet påvisbare uttrykk for REG4
selv CDX2 protein uttrykk ble funnet. Derfor H3K27me3 nivåer på REG4
promoter-regionen kan være høy i MKN-7, TMK-en, HSC-44PE og KATO-III celler, hvor overekspresjon av CDX2 unnlatt å aktivere Reg IV uttrykk.

det har blitt rapportert at REG4
mRNA-ekspresjon ble forbedret ved stimulering med TGF-α, EGF, HGF, eller bFGF ved aktivering av mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) veien [22] . Dermed kan det bli en hypotese om at Reg IV er også regulert av nedstrøms transkripsjonsfaktorer av MAPK trasé. Vi utførte i silico
analyser av REG4
gen 5'-flankerende område, og funnet minst én presumptive AP-1 konsensussekvenser (på -883 basepar av REG4
-gen 5'-flankerende region), som er en nedstrøms transcriptional faktor på MAPK-signalering. I denne studien, HSC-39 celler viste lignende transkripsjonen aktivitet av reporter genkonstruksjoner som inneholder 1,2 kb og 0,6 kb REG4
5'-flankerende sekvens. Som effekten av EGF eller TGF-α på REG4
transkripsjon ble ikke undersøkt i denne studien, videre undersøkelser er nødvendig for å klargjøre signalmekanismer som induserer regulering av REG4
transkripsjon.

I konklusjonen, våre nåværende data viser at CDX2 protein regulerer direkte Reg IV uttrykk. Reg IV aktiverer EGFR /Akt /AP-1 signalveien. Som tarm fenotype GC ofte uttrykker EGFR [36], er det foreslått at denne Reg IV-aktivert reaksjonsvei spiller en viktig rolle i denne subtype av GC. Fordi CDX2 induserer også uttrykk for genet for multiresistens, ABCB1
, anti-EGFR terapi, men ikke kjemoterapi kan være gunstig for pasienter med tarm fenotype GC.

Materialer og metoder

Plasmider

CDX2 cDNA ble satt inn i det multiple kloningssete av den retrovirusekspresjonsvektor pPGS-CMV-Cité-neo som tidligere beskrevet [24]. Full-lengde, villtype CDX2 cDNA ble også subklonet inn i den retrovirale vektoren pBabe-Puro ER som beskrevet tidligere for å generere pCDX2-ER [24]. Den pCDX2-ER vektor koder for et kimært protein hvor full-lengde CDX2 sekvensene er sammensmeltet oppstrøms for en mutert ER ligand-bindende domene. Den muterte ER ligand-bindende domene ikke lenger binder østrogen, men har beholdt evnen til å binde tamoxifen. Genomiske DNA sekvenser fra 5'-flankerende region av det humane REG4
-genet ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av genomisk DNA renset fra HSC-39-celler som et templat, og subklonet inn i pGL4.10 [luc2] vektor (Promega , Madison, WI). PCR-baserte metoder ble brukt for å introdusere mutasjoner i de presumptive CDX2-bindingsseter i pGL4.10-REG4 reporter genkonstruksjonen bruker QuikChange seterettet mutagenese Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Fire antatte CDX2-bindingsseter ble endret. Alle fragmenter ble generert ved hjelp av PCR ble verifisert ved automatisert sekvensering. Plasmidet pGL4.74 [hRluc /TK] vektor (Promega) ble brukt som en kontroll for transfeksjon effektivitet i reporter analyser.

cellelinjer, Retrovirus Infeksjoner, and Drug Treatment

amfotrofisk Phoenix emballasje cellelinje ble levert av G. Nolan (Stanford University, Stanford, California) [37]. Ni cellelinjer avledet fra humane GC og 2 cellelinjer avledet fra human koloncancer ble anvendt. Den TMK-1-cellelinjen ble etablert i vårt laboratorium [38]. De HSC-39 og HSC-44PE cellelinjer ble etablert av en av forfatterne (Kazuyoshi Yanagihara) [39], [40]. Fem GC cellelinjer av MKN serien ble vennlig levert av Dr. Toshimitsu Suzuki [41], [42]. Den KATO-III cellelinjen ble vennlig levert av Dr. Morimasa Sekiguchi [43]. HT-29 og SW480 kolon kreftcellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection. Celler ble lagret i flytende nitrogen inntil initiering av denne studien. Etter opptining fra frosset lager, ble cellene holdt ved lav passasje gjennom hele studien. Konsistent cellemorfologi ble overvåket ved sammenligning av mikroskopiske bilder. The Phoenix emballasje celler ble transfektert med retrovirale uttrykk konstruksjoner (pPGS-CDX2, pPGS-Neo, og pCDX2-ER) og supernatanten inneholder nonreplicating amfotrofisk virus ble høstet som tidligere beskrevet [24]. I HT-29 celler som uttrykker CDX2-ER-fusjonsprotein (HT-29 /CDX2-ER), ble CDX2 funksjon aktivert ved tilsetning av 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) (Sigma Chemical, St. Louis, MO) til veksten medium til en sluttkonsentrasjon på 500 nmol. For å undersøke hvorvidt DNA-metylering indusert transcriptional inaktivering av Reg IV, ble cellene behandlet med en endelig konsentrasjon på 1 uM Aza-dC (Sigma Chemical) i 5 dager før de ble høstet for RNA-ekstraksjon.

Western Blot analyse

For Western blot analyse ble cellene lysert som beskrevet tidligere [44]. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved Bradford proteinanalyse (Bio-Rad, Richmond, CA) med BSA brukt som standard. Lysatene (20 ug) ble oppløst i Laemmli prøvebuffer ved koking og deretter utsatt for 12% SDS-polyakrylamidgel-elektroforese etterfulgt av elektrooverføring til en nitrocellulosefilter. Filteret ble inkubert i 1 time ved romtemperatur med et anti-Reg IV-antistoff (kanin-polyklonalt antistoff utviklet i vårt laboratorium, Ref. 10) eller anti-CDX2 antistoff (BioGenex, San Ramon, CA). Peroksydase-konjugert anti-kanin eller anti-mus-IgG ble anvendt i den sekundære reaksjon. Immunokomplekser ble visualisert med en ECL Plus Western Blot Detection System (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). β-aktin (Sigma Chemical) ble også gjenkjent som en lasting kontroll.

QRT-PCR analyse

Total RNA ble ekstrahert med en RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA), og en ug av total RNA ble omdannet til cDNA med en First Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences). Kvantifisering av REG4
mRNA nivåer ble utført av sanntids fluorescens deteksjon som beskrevet tidligere [45]. PCR ble utført med en SYBR Grønn PCR kjerne Reagenser Kit (Applied Biosystems, Foster City, California). Sporing i sanntid av utslipp intensiteten av SYBR grønn bundet til dobbeltkjedet DNA ble utført med en ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems), som beskrevet tidligere [46]. ACTB
-spesifikke PCR-produkter ble forsterket av de samme RNA prøver og fungerte som en intern kontroll. Sekvenser av primere for REG4
QRT-PCR er vist i tabell 1. QRT-PCR ble utført i triplikat for hver prøve primersett, og middelverdien og standardavvik (SD) av de tre forsøk ble beregnet som relativ kvantifisering verdi. På slutten av 40 PCR-sykluser, ble reaksjonsprodukter separert elektro på 8% ikke-denaturerende polyakrylamidgeler for visuell bekreftelse av PCR produktene.

RNAi

For å knockdown endogen CDX2, RNAi ble utført . To siRNA tomannsboliger rettet mot CDX2 (5'-AACCAGGACGAAAGACAAAUA-3 ', CDX2 siRNA1, og 5'-AAGCCUCAGUGUCUGGCUCUG-3', CDX2 siRNA2) og en nonsilencing siRNA duplex (5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ') ble syntetisert (Qiagen). Transfeksjon ble utført ved anvendelse av Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge produsentens protokoll. Kort sagt ble 60 pmol av siRNA og 10 ul Lipofektamin RNAiMAX blandet i 1 ml RPMI-medium (10 nmol /liter sluttkonsentrasjon siRNA). Etter 20 minutters inkubering, ble blandingen tilsatt til cellene, og disse ble sådd ut på retter for hver analyse. Tre dager etter transfeksjon ble cellene analysert for alle forsøk.

reportergenet Analyser

HSC-39 og MKN-1 celler ble sådd i 6-brønners plater (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ ). Transfeksjon av celler med 50% -80% konfluens ble utført med 3 mL av FuGENE6 transfeksjon reagens (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), 0,8 ug reporter pGL4.10 genkonstruksjoner, og 0,2 ug pGL4.74 [hRluc /TK] vektor (Promega). Ved 48 timer etter transfeksjon, ble cellene samlet og resuspendert i passiv lyseringsbuffer (Promega). Luciferase aktivitet ble bestemt med en dual luciferase assay system (GloMax 96 Mikro Luminometer, Promega).

chip Analyser

chip analysene ble utført ved hjelp av EZ-Chip Chromatin Immunpresipitasjon Kit (Millipore, Billerica , MA) per produksjon instruksjoner. For å analysere om CDX2 binder direkte til de antatte CDX2-bindingsseter i REG4
5'-flankerende område, utførte vi chip analyser ved hjelp av HSC-39 celler. I korte trekk, HSC-39-celler (1-2 x 10 ^{7) var kryssbundede med 1% formaldehyd i fosfatbuffret saltvann (PBS) i 15 min ved 37 ° C, og glycin ble tilsatt for å stoppe reaktive aldehyder. Etter vasking av cellene med kald PBS ble cellene resuspendert i SDS-lysebuffer (1% SDS, 10 mM EDTA, og 50 mM Tris, pH 8,1) med Proteinase Inhibitor (Roche Diagnostics). Etter at prøver ble ultralydbehandlet, ble kromatin ekstrakter inneholdende DNA-fragmenter (gjennomsnittlig størrelse, 500 basepar) immunopresipitert ved bruk av 2 ug monoklonalt anti-CDX2 antistoff (BioGenex) eller 2 ug muse IgG (Millipore). Hver immunopresipitert DNA-prøve ble kvantifisert ved qPCR bruk av primerne er angitt i tabell 1. Som en negativ kontroll, en tilnærmet 200 basepar DNA-fragment fra ekson 3 av CDX1
-genet ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av spesifikke primere (tabell 1 ).}

for å bestemme berikelse av H3K27me3 på REG4
promoter i GC cellelinjer, chip analysene ble utført ved hjelp av MKN-1, MKN-28, og HSC-39 cellelinjer. I korte trekk GC-celler (1-2 x 10 ^{7) var kryssbundede med 1% formaldehyd i PBS i 15 minutter ved 37 ° C, og glycin ble tilsatt for å stoppe reaktive aldehyder. Etter vasking av cellene med kald PBS ble cellene resuspendert i SDS-lyseringsbuffer med Proteinase Inhibitor (Roche Diagnostics). Etter at prøver ble ultralydbehandlet, ble kromatin ekstrakter inneholdende DNA-fragmenter (gjennomsnittlig størrelse, 500 basepar) immunopresipitert ved bruk av 2 ug polyklonalt anti-H3K27me3 antistoff (Abcam, Cambridge, MA) eller 2 pg kanin IgG (Millipore). Hver immunopresipitert DNA-prøve ble kvantifisert ved hjelp av qPCR REG4
Primer 1 (tabell 1).}

qPCRs ble utført i triplikat for hver prøve primersett, og middelverdien og standardavvik (SD) av de tre forsøk ble beregnet som den relative verdi kvantifisering. På slutten av 40 PCR-sykluser, ble reaksjonsprodukter separert elektro på 8% ikke-denaturerende polyakrylamidgeler for visuell bekreftelse av PCR produktene.

Takk

Vi takker Mr Shinichi Norimura for utmerket teknisk assistanse og råd. Dette arbeidet ble utført med den type samarbeid med Senter for molekylærmedisin, Det medisinske fakultet, Hiroshima University. Vi takker Analysis Center of Life Science, Hiroshima University, for bruk av deres fasiliteter.

• PLoS ONE: RhoC Regulerer spredning av magekreft celler gjennom Interaksjon med IQGAP1
• PLoS ONE: Differential Expression av fosfolipase C Epsilon 1 er assosiert med kronisk atrofisk gastritt og magekreft