PLoS ONE: Adenoviral Levering av EMX2 Gene undertrykker vekst i Human Gastric Cancer

Abstract

Bakgrunn

EMX2 er et menneske orthologue av Drosophila
tom spiracles homeobox genet som har vært innblandet i embryogenese. Nyere studier tyder på mulig involvering av EMX2 i kreft hos mennesker; Men rollen som EMX2 i kreft trenger videre leting.

Resultater

I denne studien, rapporterte vi at nedregulering av EMX2 uttrykk var signifikant korrelert med EMX2 promoter hypermethylation i magekreft. Gjenoppretting EMX2 ekspresjon ved hjelp av et adenovirus leveringssystem i magecancercellelinjer som mangler endogen EMX2 uttrykk førte til inhibering av celleproliferasjon og Wnt signalveien både in vitro og i en magekreft xenograft modell in vivo. I tillegg observerte vi at dyr behandlet med adenovirus EMX2 ekspresjonsvektoren hadde signifikant bedre overlevelse enn de som ble behandlet med tom adenovirusvektor.

Konklusjon

Vår studie tyder på at EMX2 er en antatt tumor suppressor i human magekreft. Den adenovirus-EMX2 kan ha potensial som en roman genterapi for behandling av pasienter med magekreft

Citation. Li J, Mo M, Chen Z, Chen Z, Sheng Q, Mu H, et al. (2012) Adenoviral Levering av EMX2 Gene undertrykker vekst i Human Gastric Cancer. PLoS ONE 7 (9): e45970. doi: 10,1371 /journal.pone.0045970

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

mottatt: 13. april 2012; Godkjent: 23 august 2012; Publisert: 21.09.2012

Copyright: © Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra National Key Basic Forskning og utvikling (973) Program of China (2011CB910800 og 2012CB917304), Stiftelsen National Natural Science of China (31170732), Natural Science Foundation i Zhejiang-provinsen (Y2101329), og Postdoktor Science Foundation i Zhejiang-provinsen (2010-BSH-031). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den fjerde vanligste kreftformen og nest vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall i verden [1], [2], [3]. Selv om den globale forekomsten har gått ned, fortsatt forekomsten høy i asiatiske land [2], [4], [5]. De fleste av magekreftpasienter er diagnostisert ved avanserte stadier [6]. Til tross for bedring i behandlingsstrategier [7], [8], 5-års overlevelse for pasienter med avansert magekreft som fikk konvensjonell terapi er fortsatt mindre enn 30% [4]. Derfor er alternative tilnærminger et presserende behov.

Genterapi, inkludert virale og ikke-virale gen-avgivelsessystem, er en lovende metode for behandling av kreft [9]. Blant alle for tiden tilgjengelig system, rekombinant adenovirus (AD) vektorer er spesielt lovende. Fordelene med Ad vektorer omfatter evnen til å produsere høye titere, evne til å infisere delende og ikke-delende celler effektivt, genom stabilitet, og lave nivåer av DNA integrering i vertsgenomet [9], [10]. Det har blitt rapportert at gjenopprettelse av gener gjennom denne tilnærming fører til tumorregresjon og induserer apoptose in vivo
uten å påvirke normalt vev [11], [12], [13].

EMX2, den menneskelige ortolog av Drosophila
tomme spiracles (eMS) homeobox genet, tilhører homeobox genet familie som koder for transkripsjonsregulerende proteiner (Homeoprotein) essensielle for mange aspekter av vekst og differensiering [14]. EMX2 spiller en viktig rolle under hjernen [15] og skjelettutvikling [16]. Mus som bærer homozygot EMX2 mutasjoner vise dramatisk størrelsesreduksjon av caudal-medial områder, inkludert occipital cortex og hippocampus [17], [18], [19]. Forstyrrelse av EMX2 uttrykk kan endre formeringshastigheten av voksen neuralstamceller [20]. EMX2 styrer også pattedyr reproduksjon ved å justere livmor celleproliferasjon uten å påvirke differensiering [21].

Nyere studier tyder på mulig involvering av EMX2 i kreft hos mennesker [22], [23], [24], [25]. For eksempel har EMX2 er vist som en tumor suppressor i lungekreft, og lav EMX2 ekspresjon er assosiert med redusert total overlevelse og gjentakelse overlevelse hos pasienter med lunge adenokarsinomer [22], [23]. Det er også rapportert at EMX2 uttrykket er rikelig i normal endometrium av postmenopausale kvinner, men fraværende eller redusert i endometrial svulster, og EMX2 nivåer er negativt korrelert med spredning [24], [25]. Videre kan EMX2 regulere tumorigenesis gjennom Wnt signalveien, en kritisk bane regulere celle skjebne bestemmelse, utvikling vev og tumorigenesis [26], [27], [28]. EMX2 er funnet som en direkte repressor av Wnt1 uttrykk, og banket ned av EMX2 genet induserer ektopisk uttrykk for Wnt1 i utviklings telencephalon og kortikal dysplasi [29]. Epigenetisk stanse av den EMX2 uttrykk kan være viktig for avvikende aktivering av Wnt signal i lungekreft, og påfølgende spredning og metastasering [22]. Imidlertid, hvis funksjon EMX2 under tumorigenesis og tilhørende mekanisme fortsatt trenger å bli ytterligere belyst. I denne studien rapporterer vi EMX2 som en antatt tumor suppressor i human magekreft. Vi viser den EMX2 nedregulering og dens korrelasjon med metylering status av genet promoter-regionen i magekreft. Vi viser også at restaurering av EMX2 ved hjelp av en adenovirus leveringssystem hemmer celledeling og Wnt signal in vitro
, og resulterer i bedre overlevelse av en magekreft xenograft modell in vivo
. Våre data sterkeste at det terapeutiske potensialet i å bruke Ad-EMX2 som genterapi for fremtidig behandling av pasienter med magekreft.

Materialer og metoder

Etikk erklæringen

Denne studien ble godkjent av etisk komité av Xuanwu Hospital, Capital Medical University i Beijing. En skriftlig informert samtykke godkjent av etisk komité, ble oppnådd for hver pasient før vev prøvetaking.

Cell Culture, 5-aza-2'-deoxycytidine (DAC) /trichostatin A (TSA) Behandling og vevsprøver

Menneskelige mage kreft cellelinjer (AZ521, AGS og MKN28) ble hentet fra Kina Senter for Type Culture Collection (Wuhan, Kina). Cellelinjer ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplert med 10% føtalt bovint serum, penicillin og streptomycin ved 37 ° C i en fuktig inkubator med 5% CO _{2. For å analysere restaurering av EMX2 genet, ble cellene behandlet med 4 uM DAC eller 300 nM TSA (Sigma, St. Louis, USA) i 4 dager, med erstatning av friskt medium inneholdende den samme dose av DAC eller TSA hver dag. Kontrollceller ble dyrket med friskt medium inneholdende DMSO. Cellene ble dermed høstet for DNA /RNA-ekstraksjon.}

Totalt 20 formalinfiksert parafin-embedded vev blokker (10 mage kreft vev og 10 tilstøtende normalt vev), samt total RNA fra 15 mage dysplasi prøver og 20 mage kreft kirurgiske prøver ble innhentet fra Xuanwu Hospital, Capital Medical University i Beijing. Total RNA og genomisk DNA ekstrahert fra human voksne normale mage vev ble kjøpt fra Biochain (Hayward, CA, USA).

DNA-konstruksjoner

Topflash /Fopflash journalister som inneholder villtype og mutant TCF /LSF bindingsseter henholdsvis var velvillig gitt av Dr. Yeguang Chen (Tsinghua University, Beijing, Kina). En mutant CTNNB1 (S45Y) cDNA konstruksjon ble også vennlig levert av Dr. Yeguang Chen (Tsinghua University, Beijing, Kina). Rekombinante adenovirus vektorer som uttrykker EMX2 og kontroll vektor ble kjøpt fra Vector Biolabs (Vector Biolabs, Burlingame, CA, USA).

Metylering spesifikke PCR (MSP) og Bisulfite Sekvensering (BS)

den bisulfite konvertering fra vev og celler ble utført uten forutsetning for DNA-rensing ved hjelp av EZ DNA Metylering-Direct Kit (Zymo, Orange, CA, USA). De FFPE- vev var første de-paraffinized i xylen (Sigma) og rehydrert i gradert etanol, før sulfitt behandling per produsentens instruksjoner. For MSP, er endret DNA forsterket ved hjelp av MSP primere (oppført nedenfor) som er spesielt anerkjent enten denaturert eller unmethylated EMX2 promotersekvenser etter bisulfit behandling. PCR ble utført i et endelig volum på 20 ul inneholdende 1 x MSP reaksjonsbuffer [30], 0,5 uM av hver primer og en U Zymo Taq
™ DNA Polymerase (Zymo). PCR tilstand var som følger: 10 min ved 95 ° C; 40 sykluser på 30 sek ved 95 ° C, 30 s ved 50 ° C og 30 ved 72 ° C; og 7 min endelig forlengelse ved 72 ° C. For BS, amplifikasjon av bisulfitt-konverterte DNA ble utført i et sluttvolum på 50 pl inneholdende 1 pM hver primer BS og to U av Zymo Taq
™ DNA Polymerase. PCR tilstand var som følger: 10 min ved 95 ° C; 40 sykluser på 30 sek ved 95 ° C, 40 s ved 55 ° C og 1 min ved 72 ° C; og 7 min endelig forlengelse ved 72 ° C. PCR-produktene ble klonet inn PMD-18T (Takara, Dalian, Kina). Enten 5 eller 3 tilfeldig utvalgte positive kloner fra hver gruppe ble sekvensert i Shanghai Invitrogen (Shanghai, Kina). Primere var som følger:

MSP-M (fremover): 5'TAGTTTTTTGTTCGTTTCGCGTTTC-3 '

MSP-M (revers): 5'GAATTAAAATAAACGCCCCTACCGAC-3'

MSP-U (fremover): 5'-GTTTTTTGTTTGTTTTGTGTTTTGA-3 '

MSP-U (revers): 5'-CCAAATTAAAATAAACACCCCTACCAAC-3'

BS-A (fremover): 5 ' -GTTTGTAAATTTTTTTGGAAGGATTT-3 '

BS-A (revers): 5'-AACAAAAAACTATCCTTAACCACCA-3'

BS-B (fremover): 5'-GGTTAGGGATTTTGTAGGGAT-3 '

BS-B (bakover): 5'-AAAATCACATAAACAACTTCCTCC-3 '

Immunohistochemistry (IHC)

IHC ble utført etter standard protokoll. Antistoffer brukt i studien inkluderte mus anti-human Ki67 (1:100, BD, San Jose, CA, USA) og mus anti-human EMX2 (1:500, Pierce, Rockford, IL, USA), og Alexa 594-konjugert geit anti-mus sekundære antistoff (1:200, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Lysbilder ble også kontra med hochest 33342 (Invitrogen). Zeiss LSM 710 konfokalt mikroskop (Oberkochen, Tyskland) ble brukt til å undersøke farging. Intensiteten av Ki67 ble kvantifisert ved hjelp av Image Pro® Plus. EMX2 farging ble visualisert med Histostain Plus DAB-kit (bredt spektrum, Invitrogen) i overensstemmelse med fabrikantens instruksjoner, motfarget med hematoksylin (Sigma), og fotografert ved hjelp av et Leica SCN400 lysbilde scanner (Leica, Tyskland).

Luciferase Assay

celler ved en tetthet på 5 x 10 ^{3 per brønn ble sådd ut på 24-brønners plater før transfeksjon. Topflash eller Fopflash plasmider ble ko-transfektert med PRL-TK plasmid. Etter at cellene ble dyrket i 18 timer, ble luciferase-aktivitet målt ved hjelp av Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, USA). Forholdet mellom ildflue luciferase aktivitet (Topflash /Fopflash) og Renilla aktivitet ble brukt for TCF /LSF transkripsjonsaktivitet.}

Immunoblotting

Både total protein (20 mikrogram) og cytoplasma ekstrakter (40 mikrogram) ble utsatt for immunblotting. De primære antistoffer inkludert anti-EMX2 (1:500, Pierce), anti-β-Actin (1:5000, Sigma), anti-cyclin D1 (1:500, BD) og anti-c-myc (1:200; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA).

Proliferation Assay

Cellevekst vekst~~POS=HEADCOMP ble bestemt av CellTiter 96 Vannholdig spredning Assay Kit (Promega). Cellelinjene ble platet i 96-brønners kulturplater med antallet av 5 x 10 ^{2 celler /brønn. Etter at cellene ble dyrket i flere dager 0, 2, 3 og 4, ble MTS oppløsninger tilsettes til mediet og inkubert i 1,5 time. Absorbansen ved 490 nm ble målt ved hjelp av mikroplateleser modell 680 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).}

kolonidannelse analysen

Cells (1 × 10 ^{3) smittet med adenovirus vektor uttrykker EMX2 eller tom vektor ble sådd i tre eksemplarer til 100 mm-retter. Fersk medium ble endret etter 3 dager. Etter å ha dyrket i 3-4 uker ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd i 10 minutter, vasket med PBS, farget med 0,1% krystallfiolett i 20 min og fotografert.}

RNA ekstraksjon og Kvantitativ Real-time Reverse Transcription -PCR (RT-PCR)

RNA-ekstraksjon og sanntids RT-PCR ble utført som tidligere beskrevet [31]. Primersekvensene ble tidligere beskrevet [22].

Animal Model og Adenoviral Vector Levering

Alle mus forsøk ble gjennomført under patogenfrie forhold i dyrefasilitet på Tsinghua University og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Tsinghua University. Magekreft xenotransplantater ble etablert i fem uker gamle BALB /c nakne mus. Kort beskrevet, etter å ha dyrket til konfluens, MKN28 eller AGS-celler ble trypisnized og resuspendert i PBS (pH 7,4) og deretter blandet 01:01 (v /v) med matrigel (kraftig) ved 4 ° C for å injisere en mus i et totalt volum på 150 ul. Blandingen ble s.c injisert i høyre flanke av 16 hunn-mus med 10 ^{7 celler per mus (dag 0). På dag 7, mus med lokale svulster varierte fra 50 til 100 mm 2 mottas et direkte intra-tumoral injeksjon av 1 x 10 9 plaque-dannende enheter av den indikerte adenovirus (fortynnet med PBS i et totalt volum på 100 ul). Den svulstdannelse ble overvåket i opp til 1? Måneder. Tumorstørrelse ble målt ved hjelp av caliper og fastsettes ved å multiplisere med 0,5 × bredde 2 × lengde. Kaplan-Meier-metoden ble brukt for å beregne overlevelse av de to grupper av behandlede dyr. Ved fullføring av forsøket ble tumorene fra hver behandling oppsamlet i 10% bufret formalin, innstøpt i parafin og skåret i 5-mikrometer tykke skiver for ytterligere Ki-67 deteksjon. Cytosoliske proteiner og hele cellelysat ble også hentet fra disse svulstene for Western analyse.}

Statistical Analysis

Alle data ble beregnet som betyr ± standardavvik. Forskjeller mellom grupper ble sammenlignet med en tosidig t-test. En P
verdi på 0,05 eller mindre ble ansett å være betydelig.

Resultater

nedregulering av EMX2 i Human Gastric Cancer

Vi undersøkte EMX2 uttrykk i ni humane mage kreft-cellelinjer, så vel som tumor og sammenkoblet tilstøtende normale vev fra ti magekreftpasienter (figur 1). Ved hjelp av sanntids RT-PCR, har vi funnet at ekspresjonen av EMX2 var signifikant nedregulert i åtte av de ni cellelinjene undersøkt sammenlignet med den i normal gastrisk vev (P < 0,01, figur 1A). På den annen side, en cellelinje AZ521 viste tilsvarende nivå av EMX2 uttrykk som i normal kontroll (figur 1A). For å oppdage EMX2 protein uttrykk i pasient vevsprøver ble immunhistokjemi (IHC) utføres og intensiteten av IHC farging ble kvantifisert ved bilde Pro® Plus. Alle ti analyserte prøvene ble funnet å vise enten mangel på EMX2 uttrykk eller redusert nivå av EMX2 uttrykk i kreftvev i forhold til sine normale kolleger (P < 0,01, figur 1B). For å etablere den mulige rollen EMX2 i patologisk progresjon av menneskelig magekreft, analyserte vi EMX2 uttrykk ved hjelp total RNA som vi hentet fra femten mage dysplasi prøver og tjue magekreft kirurgiske prøver. Vi fant at EMX2 uttrykk var signifikant nedregulert i dysplasi prøver (P < 0,05). Og nesten mistet i kreftprøver i forhold til at det i voksen normal mage vev (figur 1C), noe som tyder på at EMX2 downregulation kan oppstå ved non-invasiv forstadier scenen

Rettelse mellom EMX2 Expression og dens Arrangøren metylering status

Vi undersøkte metylering status for EMX2 promoter i ni magekreft cellelinjer og normal mage vev. Regioner av CpG øyer (CGI) ble identifisert med MethPrimer -800 til -470 og -55 til 459 i forhold til de forventede transkripsjon start steder (+1) av EMX2 genet (Figur 2A). Metylering status ble analysert ved hjelp av bisulfitt sekvensering (BS) (figur 2B) og metylering-spesifikke PCR (MSP) (figurene 2C-2D). Vår BS og MSP Resultatene viste at EMX2 arrangøren i normale mage vev og AZ521 celler var unmethylated, mens i de andre åtte cellelinjer undersøkt det ble tett metylert (Tall 2B-2C). Disse resultater er konsistente med EMX2 uttrykk nivåer i disse cellelinjer: høy i normalt vev og AZ521, men lav i de andre åtte cellelinjer undersøkt. En blanding av denaturert og unmethylated bandet ble funnet i flere cellelinjer inkludert MKN28, N87, og SNU16 indikerer delvis metylering. Videre fant vi at metylering status for pasienten vevsprøver avslørt av MSP er konsistente med EMX2 uttrykk nivåer i disse prøvene (figur 2D, fire av ti par av vevsprøver ble undersøkt på grunn av utilgjengelighet av genomisk DNA fra de andre seks par ). Disse dataene antyder at nedregulering av EMX2 uttrykk kan være et resultat av sin promoter hyper-metylering i magekreft.

For ytterligere å undersøke sammenhengen mellom EMX2 uttrykk og arrangøren metylering, behandlet vi MKN28 og AGS cellelinjer med en metyltransferase inhibitor DAC og en histondeacetylase inhibitor TSA. Cellelinje AZ521 ble brukt som en negativ kontroll som sin promoter regionen er unmethylated. Vi har observert at unmethylation spesifikt bånd betydelig høyere (figur 3A) med EMX2 ekspresjonsnivåer oppregulert tilsvarende (figur 3B) ved DAC behandling i begge AGS og MKN28 celler, mens de i AZ521 celler forble uforandret (figur 3). Behandlingen av TSA hadde minimal effekt på både metylering status og EMX2 uttrykk nivåer. Til sammen våre resultater sterkt at nedregulering av EMX2 uttrykk var signifikant korrelert med EMX2 promoter hypermethylation i human magekreft.

Hemming av cellevekst av Adenovirus levert EMX2 in vitro

Vi neste undersøkt hvilken rolle EMX2 på cellevekst av mage kreftceller. Veksten av AGS og MKN28 celler ble betydelig undertrykt ved infeksjon med adenovirus uttrykker EMX2 (Ad-EMX2) sammenlignet med en tom vektor kontroll (Ad-ctrl) (P < 0,001, figur 4A), mens veksten av AZ521 cellene ikke ble påvirket (P > 0,05, figur 4A). Disse observasjonene ble også bekreftet ved kolonidannelse analysen (figur 4B). Våre resultater viser anti-spredning funksjon EMX2 i magekreftceller

Undertrykkelse av Wnt signalveien ved Adenovirus levert EMX2

Funksjonen EMX2 har vært knyttet til Wnt signalveien.; derfor har vi studert forholdet mellom EMX2 og Wnt signal i magekreft. Vi brukte en Topflash /Fopflash reporter analyse for å måle TCF /LSF-avhengig transkripsjon aktivitet regulert av kanoniske Wnt veien. Vi har funnet at TCF /LEF-avhengig transkripsjonsaktiviteten ble betydelig inhibert av Ad-EMX2 i AGS og MKN28 celler som mangler endogen EMX2 uttrykket (P < 0,05), men ikke i AZ521 celler som uttrykker endogen EMX2 (P > 0,05, figur 5A). Konsekvent, protein nivåer av cytosoliske β-catenin og kanoniske Wnt veien nedstrøms mål c-myc og cyclin D1 ble undertrykt i disse AGS og MKN28 celler infisert med Ad-EMX2, men ikke i AZ521 celler (restaurering av EMX2 uttrykk i disse cellelinjene etter Ad-EMX2 infeksjon ble bekreftet ved Western) (figur 5B). For ytterligere å undersøke relevansen av Wnt veien nedregulering og spredning undertrykkelse av Ad-EMX2, vi transfektert og uttrykt stabilisert β-catenin (S45Y mutasjon) i disse magekreftceller infisert med Ad-EMX2. Vi har observert at over-uttrykke β-catenin betydelig svekket veksten undertrykkelse effekten av Ad-EMX2 i både AGS og MKN28 celler (P < 0,01), men ikke i AZ521 celler (figur 5C). Samlet utgjør disse resultatene støtte en viktig rolle EMX2 i undertrykkelse av Wnt veien i magekreft.

Undertrykkelse av magekreft Vekst av Adenovirus levert EMX2 in vivo

Vi etablerte MKN28 og AGS xenograft modeller for å utforske det terapeutiske potensialet av adenovirus levert EMX2 for magekreft in vivo
. En uke etter inokulering, mus med lokale svulster som strekker seg fra 50 til 100 mm ^{2 fikk en direkte intratumoral injeksjon av 1 x 10 9 plaque-dannende enheter av den indikerte adenovirus. Veksten av svulster i Ad-EMX2 infiserte mus var betydelig lavere enn i kontrollgruppen (P < 0,05, Figur 6A forlot to paneler). Ved fullføring av forsøket tumormasse i Ad-EMX2 infiserte mus også betydelig mindre enn i kontrollgruppen (P < 0,05 for MKN28 tumor, P < 0,01 for AGS svulst, figur 6A høyre panel). Farging intensiteten av en proliferativ Ki67 av vevsprøver ved fullføring av forsøket viste at levering av Ad-EMX2 betydelig redusert Ki-67 farging (P < 0,01, figur 6B), noe som tyder på celleproliferasjon hemming i tumorer. Videre overlevelse av Ad-EMX2 infisert gruppen var signifikant bedre enn den til kontrollgruppen (p = 0,014, figur 6C). I samsvar med vår in vitro
analyse, cytosolic β-catenin og kanoniske Wnt pathway nedstrøms er rettet mot c-myc og cyclin D1 ble også nedregulert i Ad-EMX2 infisert MKN28 og AGS svulster (restaurering av EMX2 uttrykk i disse in vivo svulster ble også bekreftet av Western) (figur 6D). Til sammen våre resultater viser en terapeutisk potensial av adenovirus-levert EMX2 å behandle magekreft.}

Diskusjoner

Homeobox gener har blitt godt kjent for sin betydning i utvikling i flere tiår, mens studiet av disse genene under onkogenese er fortsatt i sin barndom. Avvikende homeobox genekspresjon er dokumentert i en rekke kreftformer [32], [33], noe som indikerer endringer av hemeobox uttrykk kan være viktig for onkogenese. Dette kan tilveiebringe en molekylær basis for potensielle kliniske anvendelser. Men flere grunnleggende spørsmål fortsatt må fullt opp, inkludert de molekylære mekanismene som driver avvikende uttrykk, og nedstrøms mål og signalveier som fremmer onkogenese. I denne studien gir vi innsikt i disse spørsmålene ved å undersøke EMX2 i human magekreft.

Vår studie rapporterte en betydelig reduksjon og tap av EMX2 uttrykk i mage kreft cellelinjer og primære tumor vev, og viste at nedregulering var signifikant korrelert med hyper-metylering av EMX2 arrangøren, noe som tyder på epigenetisk lyddemping som en viktig mekanisme for EMX2 feilregulering i human magekreft. Faktisk har epigenetisk modifikasjon blitt foreslått som en viktig mekanisme er ansvarlig for homeobox gener nedregulering eller demping i andre kreft vevstyper hvor disse genene fungere i tumor suppresjon [14], [32]. Videre vår observasjon av EMX2 dowregulation i ikke-invasiv gastrisk dysplasi støtter en mulig viktig rolle EMX2 i patologisk progresjon av menneskelig magekreft. En begrensning av vår studie er antallet av vevsprøver analysert. Et større antall pasientprøver må undersøkes ytterligere å validere funn av metylering-stanse av EMX2 i magekreft. Likevel, våre resultater gir et første direkte bevis for å støtte denne mekanismen i magekreft og identifisere EMX2 som en antatt ny tumor suppressor i magekreft.

I tillegg har vi undersøkt viktige onkogene trasé gjennom hvilke EMX2 fungerte i magekreft , og fant ut at Wnt signalveien kan spille en nøkkelrolle å formidle EMX2 funksjon. Vi illustrert i sprednings analyser at høyt uttrykk for eksogene EMX2 undertrykte betydelig vekst av magekreft cellelinjer som mangler endogen genekspresjon (AGS og MKN28 celler), i samsvar med tidligere rapporter om at forskjellen i EMX2 uttrykket er negativt korrelert med spredning i andre kreftcelletyper [ ,,,0],24], [25]. Vi viste også at Wnt signalveien ble dramatisk hemmet av EMX2 in vivo Hotell og in vitro
, noe som gir ytterligere bevis på at Wnt signalveien kan megle funksjon EMX2 i kreft som tidligere foreslått [22 ].

Endelig våre resultater indikerer potensialet for bruk av EMX2 genterapi for behandling av magekreft. Infeksjon av svulster med Ad-EMX2 undertrykte betydelig spredning og enda viktigere, bedre total overlevelse. Det er verdt å merke seg at avgivelsessystemet vi anvendes for behandling var rekombinant adenovirus serotype 5 (Ad5), den mest brukte vektor i flere typer kreft genterapi [11], [12], [34], [35]. Sammenlignet med adeno-assosiert virus (AAV) og retrovirusleveringssystemer, adenovirale vektorer, slik som Ad5, åpenbart har mange fordeler. For eksempel, adenovirale vektorer som har bred tropisme tillate effektiv målretting på mange vev av interesse, en stor lastekapasitet og høy transduksjon effektivitet i forhold til AAV system [10], og også en ikke-integrert egenskaper som ellers fremkalle fare for tilfeldig mutagenese av genomet [ ,,,0],10], [36] [36], [37], [38]. Videre kan adenovirale vektorer konstrueres til kreft-selektive onkolytiske virus [39], [40], [41], som er kritiske for klinisk anvendelse av kreft genterapi. Men det er fortsatt mange utfordringer ved bruk av adenovirus vektorer for å levere genterapi hos pasienter. For eksempel kan de bli raskt tapt fra celler som deler seg raskt etter infeksjon. Andre faktorer som påvirker klinisk anvendelse av adenoviral levering omfatter pakkekapasitet og vertsområde av adenovirale vektorer, deres genekspresjon profil og tendensen til å utløse immunrespons, spesielt viktig dersom gjentatt administrering er nødvendig for [42], [43]. Likevel, vår in vivo
studie av Ad-EMX2 infeksjon antyder at EMX2 genterapi kan ha potensial til å bli en klinisk anti-tumor terapeutisk strategi for behandling av magekreft i fremtiden.

• PLoS ONE: Differential Expression av fosfolipase C Epsilon 1 er assosiert med kronisk atrofisk gastritt og magekreft
• PLoS ONE: stanse av XB130 er knyttet Både Prognose og kjemosensitivitet av magekreft