PLoS ONE: Redusert uttrykk av ARID1A Gene er assosiert med dårlig prognose i Primær Gastric Cancer

Abstract

Bakgrunn

ARID1A
genet koder adenin-thymin (AT) rik interaktiv domene som inneholder protein 1A, som deltar i kromatin remodeling. ARID1A
har blitt vist å fungere som en tumor suppressor i ulike krefttyper. I denne studien undersøkte vi uttrykket og prognose verdi på ARID1A
i grunnskolen magekreft. I mellomtiden, den biologiske rollen ARID1A
ble videre undersøkt ved hjelp av cellemodellen in vitro.

Metodikk /hovedfunnene

For å undersøke hvilken rolle ARID1A
genet i primærmagekreft patogenesen, ble real-time kvantitativ PCR og Western blotting brukes til å undersøke ARID1A
uttrykk i sammenkoblede kreft og noncancerous vev. Resultatene viste redusert ARID1A
mRNA ( P
= 0,0029) og protein ( P
= 0,0015) uttrykk i de fleste tumorbærende vev sammenlignet med matchet tilstøtende ikke-tumor vev, og i mage kreft cellelinjer. For ytterligere å undersøke clinicopathological og prognostiske roller ARID1A
uttrykk, utførte vi immunhistokjemiske analyser av de 224 parafininnstøpte magekreft vevsblokker. Data viste at tap av ARID1A
uttrykk var signifikant korrelert med T scenen ( P
= 0,001) og klasse ( P
= 0,006). I samsvar med disse resultatene, fant vi at tap av ARID1A
uttrykk var signifikant korrelert med dårlig overlevelse i mage kreftpasienter ( P
= 0,003). Cox regresjonsanalyse viste at ARID1A
uttrykk var en uavhengig prediktor for total overlevelse ( P
= 0,029). Videre funksjonene til ARID1A
i spredning og kolonidannelse av mage cellelinjer ble analysert ved trans celler med full-lengde ARID1A
ekspresjonsvektor eller siRNA målretting ARID1A
. Gjenopprette ARID1A
uttrykk i magekreftceller betydelig hemmet celledeling og kolonidannelse. Dempe ARID1A
uttrykk i gastrisk epitel cellelinje betydelig forbedret cellevekst.

Konklusjon /Betydning

Våre data tyder på at ARID1A
kan spille en viktig rolle i magekreft og kan tjene som en verdifull prognostisk markør og potensielt mål for genterapi i behandling av magekreft

Citation. Wang Dd, Chen Yb, Pan K, Wang W, Chen Sp, Chen Jg , et al. (2012) Redusert uttrykk av ARID1A
Gene er assosiert med dårlig prognose i Primær Gastric Cancer. PLoS ONE syv (7): e40364. doi: 10,1371 /journal.pone.0040364

Redaktør: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore

mottatt: 19. januar 2012; Akseptert: 6 juni 2012; Publisert: 13.07.2012

Copyright: © 2012 Dandan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (30973398) og Guangdong Natural Science Foundation (925.100.890). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den fjerde vanligste kreftformen i verden og den nest vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall hvert år (10,4% av kreftdødsfall) [1]. Behandling av mavekreft inkluderer en kombinasjon av kirurgi, kjemoterapi eller strålebehandling. Imidlertid nesten 60% av pasientene påvirket etter for magekreft, selv etter en kurativ reseksjon alene eller etter adjuvant terapi [2]. Det har lenge vært kjent at magekreft resultat av en kombinasjon av miljøfaktorer og akkumulering av generaliserte og spesifikke genetiske forandringer. Mange av de genetiske eller epigenetiske forandringer forbundet med magekreft, inkludert tap av heterozygositet, mikro og kromosom ustabilitet og hypermethylation, har blitt rapportert [3]. Forstå disse endringene og de molekylære mekanismene som er involvert i magekreftutvikling vil være avgjørende for å bedre diagnostikk, behandling og prognose prediksjon av denne sykdommen.

eukaryotically konservert SWI /SNF kromatin-remodeling kompleks spiller viktige roller i en rekke cellulære prosesser, herunder differensiering, spredning og DNA-reparasjon [4]. Tap av SWI /SNF-subenheter har blitt rapportert i de fleste tumorer, og et stort antall eksperimentelle observasjoner tyder på at dette komplekset er kritisk for tumor suppresjon [5]. Kompleksene inneholder syv eller flere ikke-katalytisk subenheter som antagelig hjelpe modulere målretting og aktivitet av ATPase [6]. En subenhet av dette kompleks, hSNF5 /Ini1 /BAF47, er blitt identifisert som en tumor suppressor [7], [8]. Den andre ikke-katalytisk subenhet, P270 /ARID1A /BAF250a (adenin-tymin AT-rik interaktiv domene-inneholdende protein 1A), har vist seg å være essensiell for normal cellesyklus-stans [9]. Knockdown av ARID1A
i en leukemi cellelinje gir resistens mot Fas-mediert apoptose [10].

Nylig ARID1A
mutasjoner og tap av BAF250a protein har vist seg å korrelerer sterkt med eggstokkreft klart cellekreft og livmor lavgradig endometrioid kreft [11] - [13]. Disse observasjonene tyder på at ARID1A
er en potensiell kandidat tumor suppressor genet. Imidlertid, den kliniske betydning av en slik differensial ekspresjon og funksjon av ARID1A proteinet forblir udefinert på grunn av mangel på studier med friske humane tumorprøver. I denne studien analyserte vi ARID1A
uttrykk nivået i magekreft ved hjelp av sanntids kvantitativ RT-PCR, western blotting og immunhistokjemi. I mellomtiden har vi identifisert forholdet mellom ARID1A
uttrykk og clinicopathological funksjoner og evaluert sin prognostisk verdi i post-reseksjon overlevelse av mage kreftpasienter. Videre vurderte vi den funksjonelle rollen ARID1A
i tumorigenesis av primær magekreft ved å undersøke in vitro spredning og kolonidannelse i mage cellelinjer.

Resultater

ARID1A
mRNA uttrykk analysert ved real-time kvantitativ RT-PCR

mRNA nivået av ARID1A
ble bestemt av sanntids kvantitative RT-PCR-analyser i 66 paret kreft og de samsvar tilstøtende normale mageslimhinnen vev. ARID1A
uttrykk nivået var signifikant lavere i 43 (65,15%) tumorbærende vev sammenlignet med de tilstøtende ikke-tumorvev ( P
= 0,0029, figur 1).

ARID1A Protein Expression analysert ved Western blotting

Western blotting ble utført på 25 mage kreftprøver og tilsvarende tilstøtende ikke-kreft mageslimhinnen vev fra de 66 parvise prøver. Resultatene viste en ARID1A bånd ved den forventede størrelse på 242 kDa og mengden av protein som er tilstede ARID1A ble videre målt ved densitometri. I samsvar med de kvantitative real-time PCR resultater, ble en reduksjon i ARID1A uttrykk sett i 13 (52%) av mage tumorvev sammenlignet med matchede tilstøtende ikke-tumorvev ( P
= 0,0015, figur 2A og figur 2B). Likeledes ARID1A protein uttrykk ble bemerkelsesverdig redusert i mage kreft cellelinjer, SGC7901, AGS, spesielt i MGC803, sammenlignet med normal mage cellelinje GES1 (figur 2C).

Immunhistokjemisk analyse av ARID1A Expression i Gastric Cancer Tissue Prøver og sitt forhold til clinicOpathological Parametere

for ytterligere å undersøke clinicopathological og prognostiske roller ARID1A uttrykk, vi utførte immunhistokjemiske analyser av de 224 parafininnstøpte magekreft vevsblokker. Samlet, 115 av 224 (51,3%) tilfeller viste negativ ARID1A uttrykk i kreftvevet (figur 3B), mens 109 (48,7%) tilfeller viste positiv farging (figur 3C & D). Normal gastrisk mucosa viste den sterkeste ARID1A positiv farging (figur 3A). Sammenhenger mellom uttrykket av ARID1A og ulike clinicopathological parametere er angitt i tabell 1. Dataene viste at tap av ARID1A uttrykk var signifikant korrelert med dybden av tumorinfiltrasjon (T scenen, P
= 0,001) og tumor Karakter ( P
= 0,006), men ikke med alder, kjønn, tumorstørrelse, fjernmetastaser (M scenen), og tumor locus eller lokale lymfeknutemetastase (N scenen).

Expression av ARID1A og klinisk utfall

De fem-års overlevelse priser hos pasienter med positiv og negativ ARID1A uttrykk var 68,8% og 52,2%, henholdsvis. Den totale overlevelsen av pasienter med negativ ARID1A uttrykk var betydelig dårligere enn for ARID1A-positive pasienter ( P
= 0,003, log-rank test, figur 4). Univariate Cox regresjonsanalyser viste at dybden av tumor infiltrasjon, lokal lymfeknutemetastase, fjern metastase, tumorstørrelse og ARID1A ekspresjon var signifikant assosiert med total overlevelse (tabell 2). Videre bekreftet en multivariat Cox regresjonsanalyse dybden av tumorinfiltrasjon, lokale lymfeknutemetastase, fjernmetastaser og ARID1A uttrykk som uavhengige prediktorer av total overlevelse av magekreftpasienter (tabell 2).

The Role of ARID1A
i celleproliferasjon og kolonidannelse i MGC803 og GES1 cellelinjer

for å evaluere effekten av ARID1A
på celleproliferasjon, ARID1A
ekspresjonsvektor og kontroll vektor ble transfektert inn i henholdsvis MGC803 celler. ARID1A
uttrykk i transfekterte celler ble oppdaget av vestlige blotting (figur 5A). Den cellevekst analysen viste at cellevekst i ARID1A
-transfected magekreftceller var betydelig lavere enn kontrollvektor transfektert mage kreftceller (figur 5C). I mellomtiden, effektiviteten av kolonidannelse var signifikant ( P
= 0,0379) hemmet i ARID1A
-transfected magekreftceller sammenlignet med kontrollvektor transfektert mage kreftceller (Figur 5D). For å bekrefte spredning undertrykkelse funksjon av ARID1A
videre, vi forstummet ARID1A
uttrykk i GES1 cellelinje med siRNA. ARID1A
uttrykk i transfekterte celler ble oppdaget av vestlige blotting (figur 5B). Vi fant ut at å kneble uttrykk for ARID1A
i GES1 betydelig forbedret celleproliferasjon sammenlignet med mock siRNA behandling (figur 5E).

Diskusjoner

Til tross for store fremskritt innen diagnostikk og terapi, forblir magekreft en av de mest dødelige svulster med en sturen prognose etter radikal gastrektomi [14], [15]. Den kliniske resultatet av magekreft bestemmes av en rekke tumor egenskaper, for eksempel lokoregional tumorvekst og invasjon, differensiering karakter, angiogenese, fjern metastase og cellesyklusprogresjon, som er regulert av en rekke beslektede gener, inkludert onkogener og tumor suppressor gener. Derfor er identifisering av magekreft spesifikke biomarkører som er involvert i disse prosedyrene svært viktig for diagnose, behandling og prognose prediksjon i klinikken.

ARID1A
, en nylig identifisert tumor suppressor gen som koder for et medlem av SWI /SNF-komplekset, har en høy mutasjonsfrekvens i blærecancer, uterin endometrioid carcinom, eggstokk endometrioid og klar karsinom [11] - [13], [16], [17]. I eggstokkene klar cellekreft, er det rapportert at ARID1A
mutasjon er signifikant assosiert med ARID1A immunoreaktivitets [18]. Nylig exome sekvense studie viste at ARID1A
er også hyppig mutert i magekreft [19], [23]. Men så langt uttrykket, klinisk betydning og biologiske funksjoner av ARID1A
i magekreft har ikke blitt utforsket. Derfor, vurderte vi uttrykket for ARID1A
i magekreft ved sanntids-PCR, western blotting og immunhistokjemi, i tillegg til sin clinicopathological og prognostisk betydning i et stort human prøve. Videre bruker in vitro cellemodell, har vi også undersøkt tumor suppressor rollen ARID1A
i mage celler i detalj.

I denne studien har vi vist at ARID1A
ble uttrykt både lavere mRNA og protein nivå i mage kreft vev enn tilsvarende ikke-cancerous slimhinnen. Etter avtale med disse molekylærbiologiske funn, immunohisto- kjemi med en anti-ARID1A antistoff viste at ARID1A
ble helt stille på tribunen i 115 av 224 pasientmagekreft prøver, med positive uttrykk i en annen 109 pasienter. Vår observasjon er i overensstemmelse med en rekke studier avslørende at ARID1A
uttrykk er ofte tapt eller redusert i en rekke kreft vev og cellelinjer, slik som brystkreft, livmor endometrioid karsinom, eggstokkreft klart celle og endometrioid carcinoma [13,18,20 og 21].

Hittil årsakene til ARID1A
lyddemping er ikke fullstendig klarlagt. De eksisterende studier fokuserer på mutasjoner i ARID1A
, særlig i gynekologisk kreft. Det er rapportert at en tull eller Indel mutasjon av ARID1A
ble korrelert med tap eller reduksjon av protein ekspresjon i livmor endometrioid carcinom, eggstokk-carcinom og endometrioid klar karsinom [11] - [13], [18]. I en integrert genomisk etterforskningen, Mamo et al
. bare funnet en avkortet mutasjon av ARID1A
i T47D brystkreft cellelinje, uten mutasjon i 11 brystkreftprøver som viste DNA-kopi nummer tap på 1p36.11 locus ved siden av ARID1A
[22]. Åtte av ni prøver med DNA-kopi antall tap på 1p36.11 har også lav ARID1A protein uttrykk, noe som tyder på et samsvar mellom DNA-kopi antall tap og ARID1A
inaktivering. I exome sekvense studie av Wang et al
., Totalt 46 mutasjoner ble funnet i 32 av 109 (29%) magekreft prøver, med 39 (85%) avkuttede mutasjoner [19]. Tjuefire (75%) av de 32 magekreft prøver med ARID1A
mutasjoner viser enten tap av eller reduseres vesentlig protein uttrykk sammenliknet med de uten ARID1A
mutasjon. I kontrast, er det bare seks magekreft prøvene viser fraværende eller svak protein uttrykk i fravær av påvisbare ARID1A
mutasjon, noe som tyder på at andre mekanismer kan bidra til å ARID1A
inaktivering. Nylig, en annen exome sekvense forskning av Zang et al
. også viste ARID1A
mutasjoner i 8% av mage prøver, hvorav 75% går tapt eller redusert protein uttrykk [23]. Mer interessant, begge studiene viste høyere ARID1A
endringer i mage kreftprøver med mikro ustabilitet (MSI) enn de med mikro stabilitet (MSS). Videre mutasjon spekteret av ARID1A
er forskjellig mellom de to genetiske typer magekreft, med de fleste indels i MSI typen og flere single-neucliotide variasjoner i MSS type. MSI er definert som Indel mutasjoner innenfor nukleotid repetisjoner (kjent som mikro regioner) resulterte fra DNA misparringssystemet inaktive-indusert replikering feil [24]. Forslag som initierende genomiske hendelsene i magekreft, MSI fører ofte til opphopning av ytterligere kreftrelaterte genetiske ustabiliteter som allele tap og rammeskifte mutasjoner i gener som er involvert i regulering celleproliferasjon, apoptose og DNA reparasjon. Det har blitt rapportert at MSI forekommer i 25% til 50% av sporadiske magekreft, som definerer en unik genetisk type sykdom med forskjellige funksjoner clinicopathological [24]. I studiet av Wang et al
., Den Indel mutasjonsraten (78%) av ARID1A
i MSI magekreft er sammenlignbar med TGFBR2
i MSI colon kreft, et veletablert og funksjonelt validert driver genet inaktivert av MSI [25]. Disse data indikerer at mutasjon av ARID1A
sammen med MSI kan spille en viktig rolle i mage karsinogenese. Derfor må forholdet mellom ARID1A
endringer og MSI status i magekreft, samt sin clinicopathological betydning, videre etterforskning i fremtidig forskning.

I studien av Wang et al.
, uttrykk for ARID1A
ble bare påvist i en liten størrelse prøven (32 tilfeller), og det var ingen videre utforskning av klinisk betydning [19]. Her, i en større magekreft befolkningen (224 tilfeller), har vi funnet at tapet av ARID1A
uttrykk var signifikant korrelert med en høyere T stadium av magekreft, noe som tyder på at fravær av ARID1A
uttrykk kan fremme tumorvekst og invasjon. I tillegg har vi oppdaget lavere ARID1A immunoreaktivitets i dårlig differensierte mage kreft vev enn i godt differensiert seg, noe som tyder på at redusert ARID1A
uttrykk kan spille en rolle i tumor de-differensiering. I samsvar med våre funn, fant andre forskere også at redusert ARID1A
uttrykk signifikant assosiert med en høyere grad av brystkreft [22], samt en høyere FIGO stadium i eggstokkene klart cellekreft [21]. ARID1A fremmer dannelsen av BRG1 eller BRM-inneholdt SWI /SNF kromatin remodeling komplekser, som er avgjørende for normal cellesyklus arrest [9], [26].

En Kaplan-Meier overlevelsesanalyse viste en signifikant sammenheng mellom tap av ARID1A
uttrykk og dårligere klinisk resultat av mage kreftpasienter etter radikal operasjon. Cox hasardratio regresjonsanalyser videre demonstrert at ARID1A
uttrykk nivå var en uavhengig risikofaktor for å overleve, noe som tyder på at det kan tjene som en verdifull prognostisk biomarkør for mage kreftpasienter etter kirurgi og et potensielt mål for genterapi i behandling av magekreft. I eggstokkene klarcellet karsinom, ble det også rapportert at pasienter med positiv ARID1A
uttrykk hadde en lengre progresjonsfri overlevelse enn de med negative ARID1A
uttrykk [21]. Videre er tapet av ARID1A
ekspresjon signifikant korrelert med chemoresistance i ovarial klar celle karsinom, som også er assosiert med en dårlig prognose av kreft. Disse dataene tyder på at ARID1A
uttrykk og mutasjon undersøkelse kan være nyttig å lede klinisk ledelse. Til sammen våre observasjoner at tapet av ARID1A
uttrykk i magekreft er assosiert med flere ondartede fenotyper og en dårligere prognose tilsier at det kan spille en tumor suppressor rolle i magekreftutvikling.

videre etterforsket den funksjonelle rollen ARID1A
i mage cellelinjer. Gjenopprette ARID1A
uttrykk i magekreftceller betydelig hemmet celledeling og kolonidannelse. Dempe uttrykk for ARID1A
i mage epitelceller forbedret cellevekstraten betydelig. Resultatene indikerte at ARID1A
kan spille en import rolle i å hemme tumorcellevekst. Nylig, funksjonelle analyser av ARID1A
i mage kreft cellelinjer av Zang et al
. antydet at ARID1A
utøve tumor-suppressor aktivitet [23]. Guan et al
. demonstrert at gjenoppretting uttrykk for villtype er tilstrekkelig til å undertrykke spredning og tumorigenecity av xenografter med menneskelige eggstokkreft cellelinjer husing ARID1A
ARID1A
mutasjoner, mens RNA interferens-mediert ARID1A
stanse øker cellulær proliferasjon og tumorigenicity i to ikke-transform menneskelige eggstokkene epiteliale cellelinjer, IOSE-80PC og OSE4 [27]. Disse dataene, sammen med våre, tyder på at tap av ARID1A
kan spille en viktig rolle i prosessen med kreftutvikling.

I konklusjonen har vi vist tap av ARID1A
ekspresjon i magekreft og dens korrelasjon med en mer ondartet fenotype og dårligere prognose i et stort antall kliniske prøver. I tillegg viste vi at ARID1A
kan hemme tumorcellevekst og kolonidannelse in vitro. Så langt vi kjenner til, data generert i denne studien representerer den første rapporten korrelere tilstedeværelse av ARID1A
med clinicopathological egenskaper og total overlevelse av mage kreftpasienter. Tatt sammen med resultatene av Wang et al.
Og Zang et al
. [19], [23], vi bekreftet videre at ARID1A
kan tjene som en kandidat tumor suppressor og prognostisk biomarkør i magekreftutvikling.

Materialer og metoder

Etikk Statement

undersøkelsen ble godkjent av etikkomiteen av Sun Yat-sen-universitetet Cancer Center og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient involvert i studien.

Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og kultur betingelser

de magekreft cellelinjer, SGC7901, AGS, MGC803, og mage epiteliale slimhinnen cellelinje GES1 ble hentet fra Committee of Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 medium som følger med 10% varme-deaktivert føtalt bovint serum (FBS). Cellene ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet kammer som inneholder 5% CO _2.

Menneske vevsprøve s

Det er totalt 66 paret kreft og matchet tilstøtende noncancerous mageslimhinnen vev ble samlet inn fra mage kreftpasienter som gjennomgår gastrektomi ved Sun Yat-sen-universitetet Cancer Center mellom 2009 og 2011, og diagnosen ble bekreftet ved patologisk undersøkelse. Den 25 paret kreft og tilsvarende tilstøtende noncancerous mageslimhinnen vev som brukes til å påvise ARID1A protein uttrykk i western blotting ble valgt ut fra de 66 parvise prøver. Etter kirurgisk reseksjon, ble friskt vev umiddelbart immerged i RNAlater (Ambion, Inc., USA) for å unngå RNA-degradering, lagret ved 4 ° C over natten for å tillate grundig gjennomtrengning av RNAlater inn i vevet og deretter frosset ved -80 ° C inntil RNA og protein ekstraksjon ble utført. En annen 224 parafininnstøpte primære magekarsinom prøvene som hadde blitt samlet inn mellom 2003 og 2005, ble hentet fra Sun Yat-sen-universitetet Cancer Center. Ingen av disse pasientene hadde fått strålebehandling eller kjemoterapi før operasjonen. Oppfølgingsdata for mage kreftpasienter i denne studien er tilgjengelige og fullstendig. Postoperativ oppfølging skjedde ved vår poliklinikk og inkludert klinisk og laboratorieundersøkelser hver 3. måned for de første 2 årene, hver 6. måned i løpet av tredje til femte år, årlig for ytterligere 5 år eller inntil pasienten død, avhengig av hva som skjedde først. Den histopatologiske type og stadium av magekreft ble bestemt i henhold til kriteriene i Verdens helseorganisasjon klassifisering og TNM scenen satt ut av Unionen for International Cancer Control.

Utvinning av Total RNA og Real-time kvantitativ PCR

Total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) i henhold til produsentens protokoll. Totalt RNA-konsentrasjonen ble bestemt ved å måle absorbansen ved 260 nm ved anvendelse av en NANO DROP spektrofotometer (ND-1000, Thermo Scientific, USA). Revers transkripsjon (RT) for å syntetisere den første streng av cDNA ble utført med 2 ug av total RNA behandlet med M-MLV revers transkriptase (Promega, USA) i henhold til produsentens anbefalinger. Den resulterende cDNA ble deretter utsatt for sanntids kvantitativ PCR for vurdering av relativ mRNA nivåer av ARID1A Hotell og GAPDH plakater (glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase, som en intern kontroll) med følgende primere: ARID1A
frem: 5'-CTTCAACCTCAGTCAGCTCCCA-3 ', og omvendt: 5'-GGTCACCCACCTCATACTCCTTT-3'; GAPDH
frem: 5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 ', og omvendt: 5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'. Gen-spesifikk amplifikasjon ble utført ved bruk av en ABI 7900HT real-time PCR System (Life Technologies, Carlsbad, California, USA) med en 15 pl PCR-blanding inneholdende 0,5 mL av cDNA, 7,5 pl av 2 x SYBR grønn masterblanding (Invitrogen, Carlsbad , California, USA), og 200 nM av passende oligonukleotidprimere. Blandingen ble forvarmet ved 95 ° C (10 min) og så forsterket ved 95 ° C (30 sek) og 60 ° C (1 min) i 45 sykluser. Oppløsningen kurve ble målt ved 95 ° C i 15 sek, 60 ° C i 15 sekunder og 95 ° C i 15 sek. CT (terskel syklus) verdien av hver prøve ble beregnet ut fra terskel sykluser med instrumentets programvare (SDS 2.3), og den relative uttrykk for ARID1A
mRNA var normalisert til GAPDH
verdi . Data ble analysert ved hjelp av sammenlignende terskel syklus (2 ^{-ΔCT) -metoden.}

Western blotting analyse

homogenismagekreft prøver, inkludert svulst og nontumor vev, samt cellelinjer , ble lysert i RIPA-lyseringsbuffer, og lysatene ble høstet ved sentrifugering (12.000 rpm) ved 4 ° C i 30 minutter. Omtrent 50 ug proteinprøver ble deretter separert ved elektroforese i en 12% natrium-dodecylsulfat-polyakrylamidgel og overført til et polyvinylidenfluorid membran. Etter blokkering av ikke-spesifikke bindingsseter i 60 min med 5% ikke-fettholdig melk, ble membranene inkubert over natten ved 4 ° C med et mus monoklonalt antistoff mot ARID1A (Abgent primært antistoff Company, USA, ved en 1:1000 fortynning) . Membranene ble deretter vasket tre ganger med TBST (tris-bufret saltvann med Tween-20) i 10 minutter og probet med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert kanin-anti-muse-IgG-antistoff (Immunology Consultants Laboratory, USA, ved en 1: 2000 fortynning) ved 37 ° C i 1 time. Etter tre vasker ble membranene utviklet av en forbedret chemiluminescence system (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA). Bandet intensitet ble målt ved densitometri bruke Kvantum One-programvaren (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA, USA). Protein nivåer ble normalisert til at av GAPDH oppdaget ved hjelp av mus anti-human GAPDH monoklonalt antistoff (Shanghai Kangchen, Kina, på en 1:10000 fortynning).

Immunohistochemistry Analyse

De vevsdelene var deparaffinized med dimetylbenzen og rehydrert ved 100%, 95%, 90%, 80% og 70% etanol. Etter tre vaskinger i PBS (fosfatbufret saltløsning), ble objektglassene kokt i antigen gjenfinning buffer inneholdende 0,01 M natrium-citrat-saltsyre (pH = 6,0) i 15 minutter i en mikrobølgeovn. Etter skylling med PBS, ble vevssnittene inkubert med primært antistoff, og objektglassene ble deretter skylt i 3% peroksidase bråkjøling oppløsning (Invitrogen) for å blokkere endogen peroksidase. Snittene ble deretter inkubert med et muse-monoklonalt antistoff mot ARID1A (Abgent primært antistoff Company, USA, ved en 1:300 fortynning) ved 4 ° C over natten og deretter inkubert med pepperrot peroksidase (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM Detection Kit) ved værelses temperatur i 30 minutter. Etter vasking i PBS, ble visualiseringen signal utviklet med 3, 3'-diaminobenzidin (DAB) løsning, og alle av objektglassene ble motfarget med hematoksylin. Som negative kontroller ble det tilstøtende seksjoner bearbeidet som beskrevet ovenfor, bortsett fra at de ble inkubert over natten ved 4 ° C i blokkeringsløsning uten det primære antistoff.

Den totale poengsum ARID1A farging ble beregnet som summen av prosentandelen av positive farget tumorceller og fargeintensitet. I korthet, ble prosentandelen av positiv farging scoret som 0 (0-9%, negativ), 1 (10% -25%, sporadiske), 2 (26% -50%, fokal) eller 3 (51% -100%, diffuse), og intensiteten som 0 (ingen farging), 1 (svak farging), 2 (moderat farging) og 3 (mørke flekker). Den totale farging poengsum ble beregnet med verdien av prosent positivitet poengsum × fargeintensitet poengsum, som varierte fra 0 til 9. uttrykk nivå ARID1A ble definert som følgende: "-" (negativ, 0 poeng), "+" (svakt positive, score 1-3), "++" (positiv, score 4-6), "+++" (sterkt positiv, score 7-9). Basert på ARID1A uttrykk nivåer, ble magekreftpasienter delt inn i to grupper:. Negativ ARID1A uttrykk gruppe (ARID1A-) og positiv ARID1A uttrykk gruppe (ARID1A +, ARID1A ++ eller ARID1A +++)

Expression Plasmid og Forbigående trans

En eukaryot uttrykk plasmid pCMV6-Entry inneholder full-lengde av menneskelig ARID1A
cDNA ble innhentet fra Asbio Technology Company (Guangzhou, Kina). Tom vektor ble anvendt som negativ kontroll. MGC803 celler ble dyrket i 6-brønns plater inntil de nådde 85-90% konfluens, og deretter forbigående transfeksjoner ble utført ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Førti-åtte timer etter transfeksjon ble genekspresjon undersøkt ved western blotting analyse. Og så, celleproliferasjon og kolonidannelse ble utført.

RNA oligonukleotider og Cell transfections

For knockdown av ARID1A
uttrykk, de sirnas ble syntetisert ved GenePharma Company (Shanghai, Kina). SiRNA sekvenser var som følger: siRNA- ARID1A
, fornuft: 5'GCCCUAACAUGGCCAAUAUTT3 ', anti: 5'AUAUUGGCCAUGUUAGGGCTT3'. Den negative kontrollen (NC), følelse: 5'UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3 ', anti: 5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3'. 400 pmol siRNA- ARID1A
eller NC ble transfektert inn 2 × 10 ^{5 GES1 celler ved hjelp Lipofectamine RNAi MAX reagens (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens protokoll. Etter det ble celleproliferasjon deretter utført.}

Proliferation Assay

Cell vekst på MGC803 eller GES1 celler ble oppdaget av MTS celleproliferasjon analysen. Celler ble sådd i en 96-brønns plate ved en densitet på 5 x 10 ^{2-celler per brønn. Celleveksttakten ble oppdaget ved hjelp av celledeling MTS kit i henhold til produsentens instruksjoner (Promega, USA). Hvert forsøk ble utført in triplo.}

Colony Forming Assay

I kolonidannelsesbestemmelsen, ARID1A
-expressing MGC803 celler eller kontroll MGC803-celler ble sådd ut i en 6-brønns plate ved en tetthet på 5 x 10 ^{2-celler per brønn. Etter 10 dager med kultur, overlevende kolonier (> 50 celler per koloni) ble telt med krystallfiolett (0,5%) farging. Koloni-dannende effektivitet (CFE%) ble definert som forholdet av antall kolonier dannet i kulturen til antall celler inokulert. Forsøket ble gjort i tre eksemplarer.}

Statistical Analysis

Forskjeller i mRNA og protein uttrykk mellom tumorprøver og sammenkoblede vevsprøver tilstøtende ikke-tumor ble evaluert med sammenkoblede-samples t-test. Den χ ^{2 test ble benyttet for å analysere forholdet mellom ARID1A uttrykk og ulike clinicopathological parametere. Overlevelseskurver ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og sammenlignet med den log-rank test. Den Cox proporsjonal hazard regresjonsmodell ble brukt for univariate og multivariate analyser for å studere effektene av de clinicopathological variabler og ARID1A uttrykk på overlevelse. De to-tailed uparede Student t
test ble brukt for å vurdere forskjeller i cellevekst og kolonidannelse. Statistiske analyser ble utført med den Statistiske Package for Social Sciences, versjon 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), og en tosidig P
verdi mindre enn 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant.}

• PLoS ONE: Avvikende Trender i Siste populasjonsbasert overlevelse i spiserør og mage Cancer
• PLoS ONE: Identifikasjon av HSA-MIR-335 som en prognostisk signatur i Gastric Cancer