PLoS ONE: Identifikasjon av HSA-MIR-335 som en prognostisk signatur i Gastric Cancer

Abstract

Bakgrunn

Magekreft (GC) er en av de vanligste kreftformen og primære årsaken til død hos kinesiske kreftpasienter. Gjentakelse er en viktig faktor som fører til behandlingssvikt og lavt nivå på 5-års overlevelse i GC pasienter etter kirurgisk reseksjon. Derfor, identifisering av biomarkører med potensial i å forutsi tilbakefall risiko er nøkkelen problemet med prognosen i GC pasienter.

Pasienter og metoder

Totalt 74 GC pasienter ble valgt for systematisk analyse, bestående av 31 pasienter med tilbakefall og 43 pasienter uten tilbakefall. For det første ble mirnas microarray og bioinformatikk metoder som brukes for å karakterisere differensial uttrykt mirnas fra primærtumorprøver. Følgende, brukte vi en ROC metode for å velge signatur med beste sensitivitet og spesifisitet. Endelig validert vi signaturen i GC prøver (frosne friske og blodprøver) ved hjelp av kvantitativ PCR.

Resultater

Vi har identifisert 12 differensial mirnas inkludert 7 oppregulert og 5 nedregulert mirnas i tilbakefall gruppe. Ved hjelp av ROC metode, vi videre konstatert HSA-MIR-335 som en signatur for å gjenkjenne tilbakefall og ikke-tilbakefall tilfeller i opplærings prøvene. Videre validert vi denne signaturen ved hjelp av kvantitativ PCR-metoden i 64 testprøver med konsistent resultat med treningssett. En høy frekvens tilbakefall og dårlig overlevelse ble observert i GC tilfeller med høyt nivå av HSA-MIR-335 ( P
< 0,001). I tillegg vurderte vi at HSA-MIR-335 var involvert i regulering av målgener i flere onkogene signalveier, slik som p53, MAPK, TGF-β, Wnt, erbB, mTOR, Toll-like receptor og fokal heft.

Konklusjon

Våre resultater tyder på at HSA-MIR-335 har potensial til å gjenkjenne tilbakefall risiko og forholder seg til prognosen for GC pasienter

Citation. Yan Z, Xiong Y, Xu W, Gao J, Cheng Y, Wang Z, et al. (2012) Identifisering av HSA-MIR-335 som en prognostisk signatur i magekreft. PLoS ONE syv (7): e40037. doi: 10,1371 /journal.pone.0040037

Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, ​​Spania

mottatt: 21 februar 2012; Godkjent: 30 mai 2012; Publisert: 03.07.2012

Copyright: © 2012 Yan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Foreløpig er kirurgi fortsatt den viktigste alternativet for behandling magekreft (GC), men selv etter å ha utført kurativ reseksjon, vil ca 40-65% av GC pasienter opplever et tilbakefall av sykdommen muligens omfatter lokale tilbakefall, peritoneal spredning eller hematogenous metastase [1], [2]. Av denne grunn, den 5-års overlevelse av GC pasientene var fortsatt i et lavt nivå. En stor utfordring for å forbedre kliniske utfall er å bedre forstå molekylære mekanismer og gjenkjenne robuste signaturer for prognosen for GC.

Flere risikofaktorer, inkludert patologisk serosa tilstand, margin status, endringer svulst microvessel tetthet og genuttrykk relatert med gjentakelse er blitt rapportert [3], [4]. I tillegg har noen prediktiv eller diagnostiske metoder blitt brukt til å vurdere gjentakelsesrisiko basert på genuttrykk profilering eller et sett av kliniske variabler [5] - [8]. Imidlertid kan disse flere observasjoner inkludert flere gen eller protein endringer hemme deres klinisk anvendelse. Pålitelig og praktisk molekylære markører for kliniske utøvere er nødvendig for prognosen i GC.

En nylig oppdaget av miRNAs er høyt konservert i genomene til virvelløse dyr, virveldyr og planter. De tjener viktige funksjoner i mange biologiske prosesser, [9], inkludert utviklings timing, mønster og embryogenese, differensiering, organogenese, og apoptose [10]. Gitt sin flere viktige biologiske funksjoner, er det ikke overraskende at den unormale mirnas uttrykk vil føre til sykdom og til og med kreft [11].

mirnas har blitt presentert som effektive potensielle biomarkører for å spore vev opprinnelse i maligne svulster ukjent primær opprinnelse [12]; mirnas ekspresjonsprofiler er i stand til å reflektere den utviklingsmessige avstamning og differensiert tilstand av tumorene [11]. Systematisk analyse av stabilitet mirnas samt optimaliserte forhold for uttrykk analyse ved hjelp av formalinfiksert parafin-embedded og blodprøver har vært rapportert tidligere [13] - [15], belyse deres uventede diagnostisk potensial. Det er et begrenset antall mirnas [16] i det humane genom som er kjent for å regulere omtrent 30% av gener [17]. Disse egenskapene mirnas kan gi oss en enkel metode for å forutsi tilbakefall risiko for kreftpasienter.

I denne studien har vi identifisert en miRNA (HSA-MIR-335) som har potensial til å forutsi tilbakefall risiko for GC basert på microarray og kliniske data for en liten størrelse prøven i kinesiske GC pasienter. Våre resultater viste at HSA-MIR-335 kan være fungere som en klinisk prognostisk signatur for GC.

Metoder

kliniske prøver

Denne studien er godkjent av etikkomiteen Wuhan General Hospital i Guangzhou Command, PLA. Alle mage kreftpasienter og ikke-kreftpasienter med fordøyelsessykdommer gitt skriftlig informert samtykke i vår studie.

Pasienter som gjennomgår gastrektomi for potensielt kureres GC i Wuhan General Hospital i Guangzhou militær kommando var pasienter i denne studien. Kvalifisering for oppføring i denne studien inkluderte histologisk bekreftet adenokarsinom i magen eller gastroøsofageal krysset. Alle pasientene hadde fått fullstendige reseksjoner inkludert et forsøk på fullstendig fjerning av svulster med inkludering av store negative marginer og utvidet retroperitoneal lymphadenectomy (D2 type). Informasjon om clinicopathologic, terapeutisk, og resultatparametre av pasienter fra mai 2005 til februar 2012 ble samlet retrospektivt. Kreft iscenesettelse ble utført i henhold til den femte utgaven av det amerikanske Joint Commission on Cancer TNM kriterier.

Tilbakefall ble definert som enhver kreft tilbakefall inkludert lymfeknute, rest magen, lokale, peritoneal og hematogene metastaser. Alle pasienter som opplevde tilbakefall av kreft ble diagnostisert klinisk eller radiografisk, og bekreftet ved biopsi via øvre gastrointestinal endoskop eller perkutan punktering. Den radiografisk standard for tilbakefall diagnose inkludert CT eller MR av bryst, mage, bekken, hode og bein skanner, eller andre diagnostiske tester som ble brukt bare under spesielle omstendigheter. Alle prøvene ble oppnådd fra kirurgiske prøver fra pasienter med gastrisk adenokarsinom, og alle pasienter gav skriftlig samtykke til bruk av disse vev for forskningsformål. Vi valgte prøver (inkludert frosne friske og blodprøver) fra 74 pasienter med og uten GC tilbakefall.

miRNA microarray

miRNA microarray analyse ble utført som beskrevet i detalj på nettstedet til CapitalBio ( http://www.capitalbio.com) og også i henhold til Hua prosedyre [18]. I korthet, ble 50-100 ug av total-RNA som brukes til å ekstrahere mirnas ved hjelp av en miRNA isolasjonskit AM1560 (Ambion, USA). Fluoresceinmerkede mirnas ble brukt for hybridisering på Affymetrix miRNA Chip inneholder 1075 sonder. Fluorescens signalet ble skannet av Genechip Scanner 3000 7G (Affymetrix, USA). Rådata ble normalisert og analysert i Genechip Command Console 1.1 programvare (Affymetrix, USA).

RNA Utvinning fra Frozen Frisk og blodprøver

RNA ble ekstrahert fra frosne ferske GC vev ved hjelp av en standard Trizol protokoll (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). For blodprøver, ble miRNA ekstrahert ved hjelp av miRNease kit (Qiagen). I korte trekk, ble 700 pl av QIAzol reagens tilsatt til 200 ul plasmaprøve og inkubert i 5 minutter ved romtemperatur. Deretter ble 140 ul kloroform tilsatt, vortex-blandet i 15 sekunder og inkubert i 3 minutter ved romtemperatur. Dette ble etterfulgt av en sentrifugering av 14 000 rpm ved 4 ° C i 15 min. Den øvre, vandig fase ble fjernet, og 1,5 ganger av sitt volum tilsatt i 100% etanol. Hver 700 ul av blandingen ble plassert på en kolonne og sentrifugert ved 13000 rpm ved romtemperatur i 15 sek. Etter, ble 500 ul buffer RPL tilsatt til kolonnen, og sentrifugert ved 13000 rpm ved romtemperatur i 2 min. Kolonnen ble deretter sentrifugert ved 13000 rpm ved værelsestemperatur for å tørke den. Det følgende var elueringstrinnet med 20 ul av nuklease-fritt vann. Eluert RNA ble lagret ved -70 ° C.

Sanntids Kvantitativ PCR

Moden miRNA sekvenser ble kjøpt fra Sanger Institute miRBase Sequence Database (http://microrna.sanger.ac .uk /sekvenser /). Stammesløyfe revers transkripsjon (RT) primere ble utformet i henhold til Chen [19]. RT Reaksjonsbetingelsene anvendt involverte inkubasjoner ved 16 ° C i 30 min; 37 ° C i 30 minutter og deretter 72 ° C i 10 min. Den termiske sykluser protokollen for PCR involverte en innledende denatureringstrinn ved 95 ° C i 5 minutter etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 30 s, 57 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 sek. De smeltekurver for hver PCR ble omhyggelig analysert for å bestemme hvilken som helst ikke-spesifikk amplifikasjon. Uttrykket av hver miRNA ble beregnet ved hjelp av to ^{-ΔΔ C
_{T formel og normalisert til U6 snRNA uttrykk [20].}}

Unsupervised Algoritme

SAM [21] ble brukt til å utføre uten tilsyn clustering beregningen. Cutoff for signifikans ble bestemt av en stemmeparameter delta, valgt av brukeren, basert på falske positive og representert ved q verdi. Vi valgte en fold endring større enn 2, og q = 0 som utvalgskriterier for differensial uttrykk for miRNAs.

ROC og Kaplan-Meier overlevelses Curve Analyse

ROC kurven analyse ble utført ved bruk av de MedCalc programvarepakker (verison 8.2.1.0; Mariakerke, Belgia). AUC-kurver gitt et mål på den totale ytelsen til en diagnostisk test. Forholdet mellom miRNA signalintensiteter og Ct-verdien av hver miRNA ble anvendt for beregning ROC i prøver. Survival analyser ble også utført av MedCalc programvarepakken.

Statistical Analysis

De kliniske data ble analysert ved hjelp av Chi-Square test. Den kumulative overlevelseskurve ble sammenlignet med log-rank test. For alle analyser, en forskjell med P
. ≪ 0,05 ble ansett som statistisk signifikant

miRNA Målrettet Gene Tippe og Signal Pathway Analyser

Vi utnyttet en miRNA mål gen prediksjon database TargetScan (http://www.targetscan.org) for å velge plausible mål av differensial uttrykt miRNAs. En integrert genet ontologi database molekylær merknad system (MAS3.0, http://www.capitalbio.com) ble brukt for å undersøke miRNA målrettede gener og deres engasjement i ulike signalveier.

Resultater

Kliniske Kjennetegn på GC pasienter

totalt 74 pasienter med /uten tilbakefall ble valgt for systematisk analyse. 31 pasienter hadde regelmessig GC som ble påvist patologisk ved biopsi på anastomose nettsteder via endoskopi. 43 pasienter uten tilbakefall ble valgt som kontrollgruppe med kamper i kjønn, alder ved diagnose, TNM staging, behandling og antallet involverte lymfeknute (tabell 1).

Det var ingen signifikant forskjell i Sex ( P
= 0,469), alder ( P
= 0,502), Tumor plassering ( P
= 0,299), Differensiering ( P
= 0,511) , lymfeknute reseksjon ( P
= 0,217) og status for adjuvant kjemoterapi ( P
= 0,214). Det var signifikant forskjell i UICC scenen ( P
= 0,108) og overlevelse /dødsrate bemerket (8/23 i tilbakefall gruppe vs. 34/9 i ikke-gjentakelse gruppe, P
<0,001), med median overlevelse på 18,9 måneder i tilbakefall vs. 43,9 måneder i ikke-gjentakelse gruppe henholdsvis ( P
. < 0,001) (tabell 1)

miRNA Expression Profiler Associated med GC regelmessighet

Vi brukte en mirnas microarray chip for å måle mirnas uttrykk nivåer på 10 GC prøver med /uten tilbakefall (5/5) som treningssett. Når man sammenligner miRNA uttrykk mellom gruppene, 7 oppregulert og 5 nedregulert mirnas ble funnet som var statistisk signifikante i GC tilbakevendende gruppe (tabell 2). Disse 12 mirnas kan brukes til å diskriminere mellom GC med og uten tilbakefall basert på en hierarkisk klyngeanalyse (figur 1).

HSA-MIR-335 er den beste Signatur for å klassifisere GC med og uten tilbakefall i Training Set

Vi brukte ROC metode for å analysere sensitivitet og spesifisitet av kandidat biomarkører basert på miRNA microarray data. Vi fikk 2 mirnas HSA-MIR-335 og HSA-MIR-128B med beste sensitivitet og spesifisitet i klassifisering GC prøver med og uten tilbakefall (figur 2, Tabell 3). Kombinert med FC verdi (FC _{HSA-MIR-335 = 4,675; FC HSA-MIR-128b = 1,453) for hver biomarkør, velger vi HSA-MIR-335 for videre studier}

Validering av signatur i testprøver av real-time PCR

uttrykket nivå av HSA-MIR-335 ble oppdaget av real-time PCR på 64 test GC prøvene sammenlignet med matchet nærliggende vev som kontroll. Resultatene viste at i 26 tilfeller med tilbakefall, 21 tilfeller (21/26, 80,8%) var høyt uttrykt av HSA-MIR-335; og i 38 tilfeller uten tilbakefall, 29 tilfeller (29/38, 76,3%) var lavt uttrykt av HSA-MIR-335 (figur 3). De samme resultatene ble observert i blodprøver ved hjelp av en blandet blodprøve fra 20 ikke-kreftpasienter med fordøyelses sykdommer som kontroll: I 26 tilfeller med tilbakefall, 19 tilfeller (19/26, 73,1%) var høyt uttrykt av HSA-MIR -335; og i 38 tilfeller uten tilbakefall, 30 tilfeller (30/38, 78,9%) var lavt uttrykt av HSA-MIR-335 (figur 3). Det var 11 tilfeller (11/64, 17,2%) ikke passet i uttrykket nivået av HSA-MIR-335 i sammenligning av resultatene mellom frosne friske og blodprøver.

I tillegg har vi oppdaget uttrykket nivå HSA-MIR-128b i 64 GC blodprøver ved hjelp av real-time PCR. Resultatene viste at i 26 tilfeller med tilbakefall, 18 saker (18/26, 69,2%) var høyt uttrykt av HSA-MIR-128b; og i 38 tilfeller uten tilbakefall, 27 tilfeller (27/38, 71,1%) var lavt uttrykt av HSA-MIR-128b. FC verdi av HSA-MIR-128b og HSA-MIR-335 var 1,647 og 3,589 sammenlignet tilbakefall med ikke-gjentakelse prøver, henholdsvis (figur 4A). Vi har også analysert sensitivitet og spesifisitet av HSA-MIR-335, HSA-MIR-128b og HSA-MIR-335 /128b (kombinert med MIR-335 og MIR-128b som en signatur) basert på sanntids PCR data. Resultatene viste at HSA-MIR-335 var mer sensitiv og spesifikk med en AUC-verdi på 0,88 enn HSA-MIR-128b (AUC = 0,79) og HSA-MIR-335 /128b (AUC = 0,84) i klassifisere tilbakefall og ikke- tilbakefall prøver (figur 4B, tabell 3).

HSA-MIR-335 som et sykdomsutvikling Signatur for å forutsi gjentakelsesrisiko i GC pasienter

De 74 GC pasientene ble delt inn i to grupper, inkludert 31 pasienter med tilbakefall som en gruppe og 43 pasienter uten tilbakefall som en gruppe. De pasientene som opplevde en gjentakelse av GC hadde en betydelig redusert median overlevelse ( P
< 0,001; figur 5A). Vi oppdaget uttrykket nivåer av HSA-MIR-335 i alle 74 GC prøver. En betydelig forskjell er observert i to grupper som representerer høyt uttrykte av HSA-MIR-335 gruppe og lav-uttrykte av HSA-MIR-335 var som følger: MIR-335 (+) og MIR-375 (-). GC pasienter (n = 35) med MIR-335 (+) hadde betydelig redusert median overlevelse sammenlignet med de (n = 39) med MIR-375 (-) ( P
< 0,001; figur 5B).

signalveien og Gene Ontologi Analyser av HSA-MIR-335 Målrettet Gener

for å undersøke mulige reguleringsmekanismer av HSA-MIR-335 i ferd med GC tilbakefall, vi utnyttet en bioinformatikk database å velge plausible målene for denne miRNA. Totalt 255 gener ble spådd som målgener av HSA-MIR-335. Signalveien analyser viste at de fleste av de målrettede genene som ble regulert av HSA-MIR-335 var involvert i de samme reaksjonsveier, slik som p53, MAPK, TGF-β, Wnt, erbB, mTOR, Toll-like receptor, fokal adhesjon ( tabell 4, figur 6). Vi foreslo at disse flere pathway endringer kan være involvert i kliniske patologiske funksjoner og pasientenes utfall av GC. I mellomtiden brukte vi en integrert gen ontologi database for å kommentere den molekylære funksjon av miRNA målrettede gener. Resultatene viste at gener reguleres av HSA-MIR-335 deltok i de fleste av de viktige biologiske prosessen forbundet med kreft hos mennesker (tabell 5).

Diskusjoner

Tilbakefall er vanlig i GC pasienter etter kirurgi; Derfor er det viktig å identifisere tilfeller med en stor grad av tilbakefall risiko. Tradisjonell klinikk patologiske faktorer er ofte utilstrekkelig for prediksjon av tilbakefall hos individer og mange forskningsgrupper har forsøkt å identifisere biomarkører som bruker ny teknologi som kan skille disse høyrisiko tilfeller. En rekke nyere undersøkelser har dokumentert miRNA endringer som er involvert i initiering og progresjon av kreft hos mennesker. miRNA uttrykk profilering av humane tumorer har identifisert uttrykk signaturer i forbindelse med diagnostisering, staging, progresjon, prognose og behandlingsrespons.

I denne studien har vi analysert primære GC tilfeller for å forutsi tilbakefall av sykdommen og definert engangs tilfeller som de som er fri for GC i minst ett år etter kurativ reseksjon. Vi identifiserte HSA-MIR-335 som en plausibel prognose underskrift av GC basert på microarray data fra 10 GC prøvene som treningssett. Videre validert vi denne signaturen på 64 testprøver med mer enn et gjennomsnitt på 85% sensitivitet og spesifisitet. Overlevelsesanalyser Resultatene viste at pasienter med høyt uttrykk nivåer av HSA-MIR-335 hadde redusert total overlevelsesrate i forhold til de med lave nivåer av HSA-MIR-335. Disse resultatene indikerer at denne signaturen hadde potensial til å forutsi tilbakefall av GC.

Microarray teknologien har utviklet seg betydelig og blitt en omfattende og nyttig metode for å hjelpe oss bedre forstår kreft [22]. Det er nå mye brukt til å studere de funksjonelle rollene mirnas i mange typer kreft [23], med flere betydelige miRNA effekter på onkogener og tumorsuppressorgener identifisert. Av de 12 mirnas identifisert i denne studien, HSA-MIR-373 var en av de nedregulert mirnas i tilbakevendende gruppe. Dette kan være et onkogen fungerer gjennom velkjente p53 bane som er involvert i karsinogenese [24]. Noen mirnas, slik som HSA-MIR-19a og HSA-MIR-32, ligger i kreft-assosiert genomiske regioner, noe som kan være involvert i maligniteter via sletting, forsterkning, eller epigenetiske modifikasjoner mekanismer [25]. I tillegg HSA-MIR-429 var oppregulert i tilbakevendende tilfeller og gruppert på kromosom 1, som bekrefter at enkelte mirnas som HSA-MIR-200b er gruppert med HSA-MIR-429 og i stand til å co-regulere deres målrettede gener [26 ].

til nå miRNA utpekt i denne studien å forutsi risikoen for GC tilbakefall er ikke godt karakterisert. HSA-MIR-335, som er transkribert fra det genomiske region kromosom 7q32.2, er blitt rapportert å Differential uttrykt i benigne og maligne tumorer [27]. Viktigere er det også vist at MIR-335 regulerer RB1 og kontroller celleproliferasjon i et p53-avhengig måte [28]; deltar i utviklingen av brystcancer [29]; regulerer vekst og invasjon av ondartede celler [30]. Den nyeste forskningen rapporterer at MIR-335 kan fungere som en metastase suppressor i GC ved å målrette Bcl-2 og SP1, og kan videreutvikles som en potensiell prognostisk faktor [31]. For å oppsummere synspunktene ovenfor, er funksjonen av MIR-335 var kontroversielt. Våre resultater viser at HSA-MIR-335 var oppregulert i GC tilbakefall prøver og som er involvert i de fleste av de onkogene signaliseringsreaksjonsveier, slik som p53, MAPK, TGF-β, Wnt, erbB, mTOR, Toll-like receptor, fokal adhesjon . Disse flere signal pathway endringer, spesielt blant p53 vei, med rimelighet kunne påvirke kliniske utfall inkludert GC tilbakefall risiko [32]. Selv om prognostisk rolle HSA-MIR-335 i magekreft er ukjent, er våre funn oppmuntrende.

Blood er den mest tilgjengelige prøven i sykehus. Den kliniske betydningen av å identifisere biomarkører som kan lett oppdages like HSA-MIR-335 er åpenbart. I tillegg arkiv parafininnstøpte prøvene er også en av de lett tilgjengelige materialer i sykehus, som ofte er holdt med godt dokumentert clinicopathological data. De representerer gode kilder for prognostisk bruk i både grunnforskning og kliniske studier. mirnas varierer i størrelse 19 til 25 nt, og de er beskyttet av den RNA-indusert stanse kompleks, noe som kan gjøre dem mindre utsatt for RNA-degradering i forhold til mRNA i disse vev [33]. Dermed var vi i stand til å oppdage miRNA uttrykk i parafininnstøpte prøvene og fokusert på systematisk analyse ved hjelp av denne signaturen for relevant prognostisk verdi. PCR-basert klassifisering metode derfor ser ut til å gi oss en måte, ved hjelp av lett tilgjengelige kliniske prøver, å forutsi tilbakefall av sykdommen.

I sammendraget har vi identifisert en prognose relaterte miRNA som kan forutsi tilbakefall risiko for GC pasienter. Ved å kombinere denne signaturen med konvensjonelle clinicopathologic faktorer, bør vi være i stand til å forutsi pasientens sykdom utfallet mer nøyaktig. I tillegg identifisering av høyrisikopasienter ville føre til vurdering av ytterligere terapeutisk intervensjon og kan dermed informere legen for en bedre oppfølging program.

Takk

Vi takker Dr. Li Wang (National Institute of Environmental Health Sciences, USA) for innsikt kommentarer og manuskript redigering.

• PLoS ONE: Redusert uttrykk av ARID1A Gene er assosiert med dårlig prognose i Primær Gastric Cancer
• PLoS ONE: Klinisk Potential av DNA Metylering i Gastric Cancer: A Meta-Analysis