PLoS ONE: DNA Metylering i Exon en region og Complex Regulering av Twist1 Expression i Gastric Cancer Cells

Abstract

Twist1 overekspresjon er hyppig observert i ulike kreftformer, inkludert magekreft (GC). Selv om DNA metylering av Twist1
genet har blitt rapportert hos kreftceller, mekanismene bak transkripsjonen aktivering fortsatt usikre. I denne studien, vi først undersøkt epigenetiske forandringer av Twist1
bruker Twist1
transkripsjons-positive og -negative cellelinjer som er utledet fra vårt etablerte diffuse-type GC musemodell. Behandling med en DNA-demetylering middel 5-aza-dC reaktiveres Twist1 ekspresjon i Twist1 ekspresjons-negative GC-celler. Ifølge metylering spesifikk PCR og bisulfite sekvensering analyse, metylering ved CpG rike region innenfor Twist1
koding ekson 1, snarere enn dens promoter-regionen, var tett knyttet til transkripsjonen stanse av Twist1
ekspresjon i mus GC-celler. Kromatin immunoutfellingsstudier analyser viste at aktiv histone mark H3K4me3 ble beriket i Twist1 uttrykk-positive celler, og inaktive histon mark H3K9me3 ble beriket i Twist1 uttrykk-negative celler. Uttrykket nivåer av Suv39h1 Hotell og Suv39h2
, histone metyltransferaser for H3K9me3, ble omvendt korrelert med Twist1
uttrykk, og knockdown av Suv39h1
eller Suv39h2
indusert Twist1
uttrykk. Videre Sp1 transkripsjonsfaktor bundet til ekson 1 CpG rike regionen i Twist1 uttrykks-positive cellelinjer, og Twist1
uttrykk ble svekket av mithramycin, som som forstyrrer SP1 binding til CpG-rike regulatoriske sekvenser. Våre studier antydet at Twist1
transkripsjon i GC-celler kan bli regulert gjennom potensial samarbeid med DNA metylering, histon endring i kompleks med SP1 binding til CpG-rike regioner i ekson en region.

Citation: Sakamoto A, Akiyama Y, Shimada S, Zhu WG, Yuasa Y, Tanaka S (2015) DNA Metylering i Exon en region og Complex Regulering av Twist1 Expression i Gastric kreftceller. PLoS ONE 10 (12): e0145630. doi: 10,1371 /journal.pone.0145630

Redaktør: Tae-Young Roh, Pohang vitenskapelige og teknologiske universitet (POSTECH), Sør-Korea

mottatt: 21 september 2015; Godkjent: 06.12.2015; Publisert: 22.12.2015

Copyright: © 2015 Sakamoto et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grants-i-Aid for Scientific Research (C) (24590444) og (A) (25253081), og A3 Foresight sight~~POS=HEADCOMP Program (AA005) fra Japan Society for Promotion of Science (JSP), og praktisk forskning for Innovative Cancer Control (15Ack0106017h0002) fra Japan Direktoratet for medisinsk forskning og utvikling, AMED; https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html, https://kaken.nii.ac.jp/d/r/80262187.ja.html.

konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Forkortelser:. BS, bisulfite sekvensering; CGI, CpG island; Chip, kromatin immunpresipitering; DCKO, dobbel betinget knockout mus; DGC, diffus-type magekreft; GAPDH, glyseraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase; GC, magekreft; H3K4me3, histon H3 lysin 4 tri-metylering; H3K9me3, histon H3 lysin 9 tri-metylering; H3K27me3, histon H3 lysin 27 tri-metylering; MSP, metylering-spesifikke polymerase-kjedereaksjon; RT-PCR, revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon; QRT-PCR, kvantitativ RT-PCR; TSGs, tumorsuppressorgener; TSS, transkripsjon start stedet; 5-aza-DC, 5-aza-2'-deoxycitidine

Innledning

Twist1, fungerer som en grunnleggende helix-loop-helix transkripsjonsfaktor, bindes direkte til e-bokselementer (NCANNTGN ) på spesifikke målgener [1]. Twist1 er viden kjent for å være avgjørende for mesoderm formasjon under tidlig embryoutvikling av Drosophila og mus [2, 3]. I humane kreftformer, er ektopisk ekspresjon Twist1 rapportert å være assosiert med malign progresjon, invasjon epithelial-til-mechencymal overgang, metastase og stemness, noe som indikerer potensielle onkogene funksjoner av Twist1 [4-6]. Dermed er det svært viktig å avklare transkripsjonsregulerende mekanismer for Twist1 i kreftceller.

epigenetiske endringer, for eksempel DNA metylering og histon modifikasjon, er tett knyttet til genet Slå [7-9]. Selv om epigenetiske forandringer ved CGI (CpG øy) promoter region av tumorsuppressorgener (TSGs) er kjent for å være forbundet med deres geninaktivering [10], er mekanismene for epigenetisk regulering av onkogener dårlig forstått. Flere grupper har vist at Twist1
ble re-aktiveres ved behandling med en Demetyleringen medikament, 5-aza-2'-deoxycitidine (5-aza-dC), i kreftceller [11, 12]. Avvikende DNA metylering ved CGI arrangøren i menneskelig Twist1
har vært hyppig påvist i primærkreftformer inkludert av magekreft (GC) [11-14]. Likevel er det en rekke funn som DNA metylering på Twist1
promoter-regionen er ikke korrelert med uttrykk av genet i ulike kreft [12, 14]. Mens Twist1
metylering kan være en nyttig biomarkør for å forutsi de kliniske utfall som til tilbakefall og overlevelse hos pasienter med kreft [12, 13, 15], er det fortsatt kontroversielt hvorvidt Twist1
metylering ved promotorområdet fører til stanse av genet.

transkripsjonsregulering av gener er korrelert med lysin (K) metylering mønstre i histon-hale som består av tre forskjellige lysin metylering tilstander (mono-, di- og tri-). Tri-metylering av H3K4 (H3K4me3) er knyttet til genet aktivering, og at av H3K9me3 og H3K27me3 til genet undertrykkelse [7-9]. Selv om disse tre histon H3-methyaltion mønstre er knyttet til CGI metylering også, transkripsjonsregulerende mekanismer for Twist1
underliggende histone modifikasjon er dårlig forstått i kreftceller.

GC er den nest hyppigste dødsårsak av kreft i verden [16]. GC er klassifisert i to hoved histologiske typer; diffus og intestinal, som er to forskjellige reaksjonsveier karsinogene [17]. Diffuse-type magekreft (DGC) er kjent for å vise hyppig invasjon og metastasering, som resulterer i en dårlig prognose [18]. Tap av E-cadherin og p53 er blitt rapportert i diffust-type gastrisk karsinogenese [19-21]. Flere rapporter viste hyppig overekspresjon av Twist1 i menneskelige DGCs [22, 23].

Vi har tidligere utviklet en dobbel betinget knockout (DCKO) mus linje som til E-cadherin og p53, som er spesielt inaktivert i magen [ ,,,0],19]. Alle DCKO musene fatale DGCs innen et år, de fenotyper blir høy invasivitet og hyppige metastaser til lymfeknuter. Det er bemerkelsesverdig at genuttrykksmønster av DGCs i DCKO mus oppdaget på microarray analyse var veldig lik de menneskelige annet enn tarm de primære DGCs. Dermed er vår DCKO musemodell et kraftig verktøy for å undersøke rollen av genfunksjon i DGC karsinogenese og for å utvikle et terapeutisk strategi. I denne studien har vi etablert Twist1 uttrykk-positive og -negative DGC cellelinjer som er utledet fra DCKO mus. Som en konsekvens av analyse av epigenetiske forandringer, ble den felles reguleringsmekanisme for Twist1
klarlagt, og evaluert i både murine og humane DGCs i denne studien.

Materialer og Metoder

Etikk erklæringen

Alle in vivo
prosedyrene ble godkjent av Animal Care Committee of Tokyo Medical and Dental University (Permission nr 0160073A). Som for normale menneskelige mage slimhinner prøver, ble skriftlig informert samtykke innhentes fra alle fag, og studien ble godkjent av etikkomiteen i Tokyo Medical and Dental University (No.1115).

Cell kulturer og vevsprøver

Vi har tidligere etablert en E-cadherin /p53 DCKO ( Atp4b-Cre
^{+
; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
) musemodell [19]. Fra sin kreft vev, etablerte vi fem mus DGC cellelinjer og kalte dem MDGCs (Shimada S, upublisert observasjon). MDGC-1 og MDGC-3-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende høy glukose supplert med 10% føtalt bovint serum, og MDGC-7, MDGC-8 og MDGC-9 ble dyrket i Hams F12 supplert med 5% hesteserum. ble utført DNA-analyse for å detektere avkortet Cdh1 Hotell og Trp53
alleler (S1 Fig). Åtte mennesker GC cellelinjer (KATO-III, GCIY, AGS, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4 og HSC60) ble også brukt i denne studien. MKN7, MKN45, MKN74, GCIY og KATO-III ble kjøpt fra Riken cell bank (Tsukuba, Japan). NUGC4 og AGS celler ble hentet fra Human Science Research Resources Bank (Osaka, Japan) og ATCC (American Type Cell Collection). HSC60 celler ble hentet fra Dr. Kazuyoshi Yanagihara (National Cancer Research Center, Tokyo, Japan) [24]. KATO-III, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4, AGS og HSC60 celler ble dyrket i RPMI 1640, og GCIY ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium, begge supplert med 10% føtalt bovint serum. For de-metylering studier, murine og humane GC-celler ble behandlet daglig med 500nM 5-aza-deoksycytidin (5-aza-dC, Sigma, # A3656) i 72 timer. Vi har behandlet disse GC-celler med 100nM trichostatin A (TSA, Wako;È-11993) i 24 timer eller 100 nM mithramycin A (Wako;„-17101) i 24 timer}

Atten primære GC vev og tilsvarende. ikke-kreft gastriske slimhinner ble oppnådd fra 15 DCKO mus. Som for menneskelige mage vev, brukte vi tre ikke-kreft mage slimhinner fra GC pasienter. Vi har også fått fem normal mage slimhinner fra Atp4b-Cre
^{-
; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
mus som ble brukt som negative kontroller i vår tidligere studie [19]. I denne studien har vi kalt "normal mage slimhinner" hvis prøvene ble hentet fra kontroll mus, og «ikke-kreft mage slimhinner" hvis prøvene ble hentet fra DCKO mus og menneskelige GC pasientene i denne studien.}

revers transkripsjon (RT) -PCR og kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)

Total RNA ble isolert med en RNeasy Mini kit (Qiagen;˥34) og cDNA ble fremstilt fra RNA ved hjelp av et Superscript III kit (Invitrogen;´80044) i henhold til produsentens protokoller. Sluttpunkt RT-PCR utført med flere syklus tall 28-35 sykluser. Som en intern kontroll, glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase ( GAPDH
) ble amplifisert med 21 sykluser for å sikre cDNA kvalitet og kvantitet for hver RT-PCR. De amplifiserte produkter ble lastet til 2% agarosegel eller kvantifisert ved kvantitativ RT-PCR bruker LightCycler DNA Master SYBR Grønn I (Roche Diagnostics,/07516001). Forsterker programmer for PCR ble gjentatt i 40 sykluser for GAPDH og 45cycles for andre gener unntatt GAPDH. PCR-produktene ble klonet inn i pMD20 T-vektoren ved hjelp av en Mighty TA-kloningssett (Takara BIO INC;ɚ8), og deretter sekvensert direkte. Primersekvensene og PCR-produkt størrelser er vist i tabell S1.

Metylering Analyse

ekstraheres genom-DNA fra murine og humane cellelinjer GC ved fenol-kloroform-metoden, og deretter utføres bisulfitt modifikasjon og MSP prosedyren. Bisulfite behandling av DNA ble utført med EZ DNA Metylering-gull (ZYMO FORSKNING; # D5006), og deretter metylering spesifikke PCR (MSP) ble gjennomført. I korthet ble PCR reaksjonen utført i 35 sykluser i en 25 pl blanding som omfatter bisulfitt-modifisert DNA, 2,5 pl av 10 x PCR-buffer, 1,25 ul 25 mM dNTPs, 25 pmol /l av hver primer og en U av Jumpstart RedTaq polymerase (Sigma; # D0563). Betingelsene for PCR var som følger: 95 ° C i 5 minutter; 35 sykluser av 95 ° C for 1minutes, 53 ° C for 2 minutters, og 72 ° C for 1.5minutes; og en endelig forlengelse ved 72 ° C i 5 minutter. Som for mus GC vev, ble DNA ekstrahert fra formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vev. Bisulfite DNA ble forsterket med flanke PCR primere og deretter nestet MSP ble gjennomført [25, 26]. Primersekvensene og PCR-produktstørrelser er vist i S2 Tabell

Chromatin immunoprecipitation (chip) assay

chip Analysen ble utført ved hjelp av en chip-IT Express kit (Active Motif,Ȓ08). henhold til produsentens protokoll. Immunopresipitert DNA berikelse ble normalisert som til inngangen. Antistoffene som brukes i denne studien var anti-histon H3K4me3 (Active Motif,Ə15), anti-H3K9me3 (Active Motif,ƍ65), anti-H3K27me3 (Active Motif,Ƈ55), anti-H3K36me2 (Abcam; # ab9049) , anti-SP1 (Abcam; # ab13370), og anti-Histone H3 (Active Motif,Ƈ63) antistoffer. Normal kanin IgG (Cell Signaling Technology;Đ9s) ble brukt som en negativ kontroll for chip. Primersekvensene og PCR-produktstørrelser er vist i S2 tabell.

Pusse analyse ved hjelp av små interfererende RNA

siRNA-basert knockdown av Suv39h1 Hotell og Suv39h2
ble utført ved anvendelse av en elektroporering (Neon transfeksjon system, Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. MDGC celler ble transfektert med 50 nM siRNA av Suv39h1 (SASI_Hs02_00335192, Sigma), Suv39h2 (SASI_Hs01_00101226), eller negativ kontroll siRNA (Mission siRNA Universal negativ kontroll, Sigma). Etter 48 timer dyrking ble cellene høstet for RT-PCR, Western blot analyser, migrasjon, invasjon, og spredning analysen.

Western Blot analyse

GC cellene ble lysert med Pierce RIPA buffer (Thermo vitenskapelig;΃00). Proteinene ble separert på SDS-polyakrylamidgeler og deretter overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner, etterfulgt av inkubasjon med antistoffer oppløst i Tris-bufret saltvann (TBS) inneholdende 2% skummet melk og 10% Tween 20. De primære antistoffer som brukes i denne studien ble mus monoklonalt anti-Twist1 (1: 100, Santa Cruz Bio-teknologi; # sc-81417), kanin-polyklonalt anti-Sp1 (1: 200, Aktiv motiv,Ɔ58), og muse-monoklonalt anti-α-tubulin ( 1: 200, Santa Cruz, # sc-8035) antistoffer. De sekundære antistoff alkalisk fosfatase-konjugert anti-kanin-IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories;ª6518), og anti-mus IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories;ª6520). Blottene ble utviklet med ImmunoStar AP substrat (Bio-Rad Laboratories;ª5018)

Immunohistochemistry

FFPE- seksjoner (4 mikrometer) ble deparaffinized i xylen, rehydrert i graderte etanol løsninger og deretter Antigen henting. ble utført i 10 mM sitronsyrebuffer med mikrobølger. Immunhistokjemi ble utført ved anvendelse av anti-Twist1 antistoffer (Santa Cruz, 1:20) som tidligere beskrevet [19]. Uttrykk for Twist1 ble definert som positiv atom flekker i mer enn 10% av cellene, og intensiteten ble scoret som- (negativ), + (svak) og ++ (moderat til sterk) med tre etterforskere uavhengig.

Resultater

Twist1 uttrykk i murine og humane GC cellelinjer

fra DGC vev av DCKO mus, Twist1
transkripsjons-positive cellelinjer (MDGC-7, MDGC- 8 og MDGC-9) og negative cellelinjer (MDGC-1 og MDGC-3) ble opprettet (figur 1A og S2A figur), og ekspresjon av Twist1 protein ble bekreftet i hver cellelinje (figur 1B). Twist1 uttrykk ble forsterket på mRNA og protein nivå i Twist1 uttrykks-negative MDGC celler etter behandling med DNA demetylering agenten 5-aza-DC (fig 1C og 1D), mens uttrykket ikke ble endret etter behandling med histondeacetylase inhibitor TSA (S2B fig). I de åtte menneske GC cellelinjer undersøkt, Twist1
uttrykk ble nedregulert i fire cellelinjer (figur 1E, venstre), tre (KATO-III, GCIY og AGS) som demonstrerte re-aktivering av Twist1
uttrykk etter behandling med 5-aza-dC ved RT-PCR (eksempel figur 1E, til høyre). Som for Twist1
uttrykks-positive GC cellelinjer, etter fem-aza-dC behandling, 2.1- og 3.2-fold oppregulering av Twist1
ble påvist i henholdsvis MKN45 og MKN7,, ved QRT-PCR, mens Twist1 uttrykk ikke ble endret i MDGC-9 celler (figur 1F).

CGI metylering og uttrykk for Twist1
i GC cellelinjer

Twist1
har en tett CGI region fra promoteren til hele ekson 1, idet dette område sterkt konservert blant virveldyr, inkludert mus og human (S3 fig). For å klargjøre CGI i mus og menneske Twist1
utførte vi beregningsanalyse ved hjelp av UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/index.html) og MethPrimer (http: //www.urogene. org /methprimer /) som er mye brukt som identifikasjon av CGI og MSP primere [27]. Vi analyserte ca 1,4 kb regionen, inkludert arrangøren og hele exon 1. UCSC Genome Browser på mus og menneskelig analyse utstilt en CGI i regionen undersøkt (data ikke vist). Imidlertid antatte to CGI-områder ble detektert i regionen i både mus og menneske når vi brukte kriteriene for CGI med GC-innhold på 50% og følges /ventet CpG-forhold på 0,8 ved MethPrimer (Fig 2A og 2C). Disse to antatte CGI-regioner ble plassert på promoteren og ekson 1. Siden metylering ved promotorområdet har blitt rapportert i forskjellige humane cancere [12, 14], vi først undersøkt metylering status ved regionen i murine og humane cellelinjer GC av MSP. Imidlertid metyleringen status ved promoter-regionen i Twist1
ikke samsvarer med dets ekspresjon i alle GC cellelinjer undersøkt (region P1, figur 2A). For å bestemme kritisk denaturert regioner forbundet med Twist1 uttrykk i MDGC celler, vi videre utført MSP på CGI-regionen i ekson 1 (E1-1, E1-2 og E1-3), og spådde CpG shore språk ligger ca 1,6 kb fra TSS (transkripsjon start stedet, S1) (figur 2A). Som et resultat, CGI metylering ved området (E1-1 og E1-2) rundt TSS i Twist1
ekson 1 ble funnet å korrespondere til ekspresjon av genet i MDGC celler, selv om det ikke var noen korrelasjon mellom dem ved den forutsagte shore region (S1) og enden av ekson en region (E1-3) (figur 2B, til venstre) i MDGC celler. Ingen metylering ble oppdaget på noen CpG regioner i tre normal mage slimhinner uten Twist1 uttrykk fra Atp4b-Cre
^{-
; Cdh1
loxP /loxP
; Trp53
loxP /loxP
mus (Fig 2B). I human mage slimhinner, ingen Twist1
metylering ble også funnet i tre ikke-kreft mage slimhinner fra GC pasienter (fig 2D), hvorav den ene viste veldig svak Twist1
uttrykk (data ikke vist ). Vi undersøkte også ytterligere fire ikke-kreft gastrisk mucosa fra GC-pasienter, mens ingen metylering ble detektert ved E1-2 region i noen tilfeller (data ikke vist). Bisulfite sekvensering (BS) viste at CGI-regionen i exon 1 viste tett metylering i Twist1 uttrykks-negative MDGC-3 celler, men ikke i Twist1-positive MDGC-9 celler (BS-c, 2A og 2B, høyre), mens det var ingen forskjell i metylering mønsteret mellom dem på CpG kysten og promotorområdene (BS-a og BS-B, fig S4A). Blant de humane GC cellelinjer, KATO-III og GCIY uten Twist1
ekspresjon viste tett CGI metylering ved området av ekson 1 (E1-2) som er i overensstemmelse med de av mus Twist1
(fig 2C og 2D, venstre). Både metyleringen og unmethylation i E1-2-regionen ble påvist i MKN7 og MKN45 celler ved MSP og bisulfitt-sekvensering (figur 2D) som er basalt uttrykt Twist1 men deres ekspresjonsnivåer ble økt etter 5-aza-dC behandling (figur 1F). Dermed våre data tyder på at metylering i ekson en region av Twist1
påvist i denne studien er korrelert til sitt uttrykk.}

Twist1
metylering og uttrykk i DCKO mus GC vevsprøver

Vi undersøkte metylering status for Twist1
bruker 18 primære GC vev fra 15 DCKO mus. Fordi GC regionene var veldig liten og deres DNA fra FFPE-prøver viste lave konsentrasjoner, utførte vi nestet MSP [25, 26]. Twist1
ble betydelig metylert (9/18, 50%) i primær GCer sammenlignet med tilsvarende ikke-cancerous vev (1/10, 10%), å være statistisk signifikant forskjell (P < 0,05, tabell 1). Representative data med MSP er vist i figur 3A. Blant dem, 4 av 10 (40%) tilfellene var intramucosal og 5 av 8 (62,5%) ble invasiv GCer (tabell 1). I denne studien Twist1
metylering-positive tilfeller demonstrert unmethylated MSP band også, som på grunn av tilstedeværelsen av normal stromal /fibroblast og inflammatoriske celler i kreft vevssnitt, selv om vi ikke kunne nekte muligheten for delvis metylering som MKN45 og MKN7 og tumor heterogenitet.

Twist1 protein uttrykk ble påvist i 7 av 18 (38,9%) GCer sammenlignet med tilsvarende ikke-kreft mage slimhinner ved immunhistokjemi. Representative bilder er vist i figur 3B. Vi videre analysert sammenhengen mellom Twist1
uttrykk og metylering nivåer i disse tilfellene. Blant de 18 primære GC undersøkt, ni tilfeller viste sammenheng mellom Twist1
metylering og uttrykk (Fig 3C). Tre av fire tilfeller med Twist1 svakt uttrykk utstilt sin metylering, muligens at lav uttrykk for Twist1 kan være forårsaket av sin metylering. Men de resterende fem tilfeller viste ingen metylering og uttrykk (tabell 1).

Histone metylering er knyttet til regulering av Twist1
uttrykk

Vi neste undersøkt hvorvidt lysin metylering nivå av histon H3 bidrar til Twist1
uttrykk. Kromatin immunoutfellingsstudier (chip) ble utført på den predikerte CpG shore (CP1.3k), promoter (CP1), og eksoner 1 (CE1-1 og CE1-2) og 2 (CE2) regioner (figur 2A). På CP1 og CE1-2 regioner ble aktiv histon mark H3K4me3 beriket i Twist1 uttrykk-positive celler (MDGC-7 og MDGC-9), men inaktive histon mark H3K9me3 ble beriket i Twist1 uttrykk-negative celler (MDGC-en og MDGC -3) (figur 4A og 4B). Chip-analyser viste både H3K4me3 og H3K9me3 signaler i MDGC-en og MDGC-3 celler med 5-aza-dC behandling, noe som indikerer forhøyede H3K4me3 nivåene i disse cellene (fig 4C). Tvert imot ble H3K27me3 og H3K36me2 nivåer ikke er korrelert med Twist1 ekspresjon i noen MDGC celler ble undersøkt i dette studiet. Som for menneske GC cellelinjer, en tilsvarende region ligger fra arrangøren til ekson 1 viste H3K4me3 berikelse i Twist1
uttrykks-positive MKN45 celler, og H3K9me3 i Twist1
uttrykk-negative KATO-III celler (figur 2C og 4D).

Suv39h1 Hotell og Suv39h2
, en histon metyltransferase, regulerer H3K9me3

Det er mye histone metyltransferaser forbundet med H3K4, H3K9 og H3K27 [28]. Derfor, for å finne ut hvilke histone modifikasjon enzymer er ansvarlig for H3K4me3 eller H3K9me3 berikelse på Twist1
ekson en region i GC-celler, vi undersøkt ti H3K4me3 ( Mll1
, Mll2
, Mll3
, Mll4
, Setd1a
, Setd1b
, Ash1
, Ash1l
Smyd3 Hotell og Meisetz
), syv H3K9me3 ( Suv39h1
, Suv39h2
, G9a
, Setdb1
, Clld8
, Glp Hotell og Riz1
), og en H3K27me3 ( Ezh2
) knyttet gener. Representative data er vist i figur 5A. Blant dem, uttrykket nivåer av Suv39h1 Hotell og Suv39h2
ble omvendt korrelert med Twist1
uttrykk. Men uttrykket nivåer av resterende 16 histone methylatasferase gener ble undersøkt var ikke forbundet med Twist1
uttrykk i MDGC celler. Vi utførte siRNA-basert knockdown av Suv39h1
eller Suv39h2
i de respektive uttrykk-positive MDGC-1 og MDGC-3 celler ved elektroporering (Fig 5B). Knockdown av Suv39h1
eller Suv39h2
i disse cellelinjene ført til en økning av Twist1
uttrykk observerbar på RT-PCR (Fig 5B) og QRT-PCR (MDGC- 1, fig 5C)

Association of SP1 med transcriptional regulering av Twist1

det er enighet 5 '-. (G /T) GGGCGG (G /A) ( G /A) (C /T) -3-sekvensen er kjent som den bindende motivet av transkripsjonsfaktor SP1, og et forhold mellom CGI metylering og Sp1 binding i promoteren er blitt rapportert [29, 30]. Flere SP1 bindingssteder ble spådd i CpG rike region innenfor Twist1
exon 1 med TFBIND (http://tfbind.hgc.jp) og Jaspar (http://jaspar.binf.ku.dk) . Rollen til Sp1 i transkripsjon av Twist1
ble deretter undersøkt med henvisning til epigenetisk modifikasjon av genet. Vi oppdaget uttrykk for SP1 mRNA og protein i alle murine og humane GC cellene undersøkt, selv i Twist1 uttrykks-negative MDGC-en, MDGC-3, KATOIII og GCIY celler (figur 6a).

For å avgjøre hvorvidt ikke SP1 binder seg til de områder av Twist1
promoter og ekson 1 i GC-celler, utførte vi ChIP analysen av SP1 ved hjelp MDGC celler (figur 2A). SP1 bundet til regioner av Twist1
promoter (CP1) og ekson 1 (CE1-2) i Twist1 uttrykk-positive cellelinjer (MDGC-7 og MDGC-9) (figur 6B). I kontrast, Twist1 uttrykks-negative cellelinjer (MDGC-en og MDGC-3) viste ikke målbare nivåer av SP1 bindende signaler på CP1 og CE1-2 regioner. Sp1 ble ikke bundet til noen områder av den forutsagte CpG shore (CP1.3k) og exon 2 (CE2) regioner i disse Twist1 ekspresjon-positive og -negative MDGC celler. Demetylering med 5-aza-dC økte SP1 binding på Twist1
promoter og ekson 1 regionene i Twist1 uttrykk-negative MDGC-1 og MDGC-3 celler (figur 6B). Mitramycin A er kjent for å interferere med Sp1 binding til CpG-rikt regulatoriske sekvenser [31, 32]. Det ble bemerket at Twist1
ekspresjon ble nedregulert etter behandling med mitramycin A i uttrykket-positive celler (GC MDGC-7, MDGC-9, MKN7 og MKN45-celler) (figur 6C og S6 Fig). Mitramycin A viste ingen effekt på SP1 uttrykk i disse cellene (data ikke vist). Oppregulering av Twist1
av 5-aza-DC ble redusert med mitramycin En behandling i MDGC-3 celler (P = 0,04, Fig 6D).

Diskusjoner

mekanismene bak epigenetisk regulering av onkogen er dårlig forstått. Forholdet mellom metylering status på Twist1
promoter regioner og uttrykk for Twist1
er kontroversielt, og det er nesten ingen av rapporter om endret histone modifikasjon i Twist1
uttrykk. Dermed er det fortsatt usikkert hvorvidt epigenetiske endringene er knyttet til Twist1
aktivering i kreftceller. Etter hvert som nye funn i denne studien belyses vi Twist1
reguleringsmekanisme underliggende fundamentale epigenetisk maskiner som DNA metylering, histoner modifikasjon og SP1 handle på konsert med Twist1 uttrykk i GC-celler.

Det er allment kjent at DNA-metylering ved CGI promoterregionen er kritisk for genet Slå, og avvikende CGI metylering resulterer i tap av ekspresjon av ulike TSGs [10]. Twist1 ble reaktivert i både murine og humane celler med GC-5-aza-dC behandling i denne studien, noe som indikerer at transkripsjonen aktivering av Twist1 blir også modulert av DNA-metylering. CGI metylering av Twist1
promoter-regionen har blitt funnet i ulike kreftformer som mage, bryst, colorectal og lunge seg [11, 12, 14], de fleste som viste ingen sammenheng mellom Twist1
metylering og uttrykk. Vi observerte at CGI metylering i Twist1
ekson en annen enn i promotorområdet samsvarer med sin genekspresjon i muse GC celler. Som for menneske GC cellelinjer, Twist1
uttrykks-negative cellelinjer var fullt denaturert, men dens uttrykk-positive cellelinjer utstilt både metylering og unmethylation av Twist1
, som alle oppregulert Twist1
uttrykk etter 5-aza-dC behandling (figur 1F). Disse data indikerer at MKN45 og MKN7 celler viste delvis metylering av Twist1
, og halvparten nivåer av Twist1
ekspresjon ble basalt påvist i disse cellene, som ble uttrykt fra unmethylated DNA-allelet. Nylige rapporter antydet at CpG shore metylering er relatert til genuttrykk [7, 33]. Men metylering status ved spådd CpG shore nettstedet regionen ble ikke korrelert med Twist1
uttrykk. Våre data tyder på at Twist1
er epigenetiske brakt til taushet av DNA metylering i murine og humane GC cellelinjer.

Ifølge beregnings analyse av mus og menneskelig CGIer fra arrangøren til hele kodende region i Twist1
genet, to antatte CGI regioner ble plassert på promoter og ekson 1 av MethPrimer analyse. Her observerte vi at CGI metylering ved exon 1, snarere enn dens promoter-regionen, ble korrelert med Twist1
uttrykk i GC-celler. Slike distinkte metylering mønstre forbundet med genet Slå har blitt rapportert i flere gener [26, 34, 35]. For eksempel SOX2 Hotell og AP2α
utstilt antatte to CGIer på promoter og ekson 1, og metylering ved ekson en region har vist seg å være signifikant korrelert til sin genekspresjon i GCer og bryst -kreft [34, 35]. Det ble rapportert at CGI metylering rundt det translasjonelle startsete i retinsyrereseptor beta (RAR-ß) genet dramatisk samsvarer med dets ekspresjon i murine lunge kreft sammenlignet med metylering ved promotorområdet som ligger i samme CGI [26]. Dermed våre data tyder på at CGI metylering ved ekson en region i Twist1
er viktig å dens genet Slå i GC-celler. Det er imidlertid ikke kjent en mekanisme av denne avvik metylering mellom promotoren og ekson 1 regioner. Flere transkripsjonsfaktor bindingsseter, som SP1 elementer, og histone modifikasjon har blitt rapportert å beskytte CGI metylering [36, 37]. Det er viktig å undersøke disse elementene og epigenetisk maskiner i CGI regioner av Twist1
videre.

I primær GCer fra DCKO mus, 50% av GCer utstilt Twist1
metylering av nestet MSP. Våre DCKO mus viser parietalcellen relaterte atypisk foci i magen, og intramucosal DGCs sammensatt av dårlig differensierte celler og signetringceller ofte oppdages ved 6 måneder. Derfor har vi tidligere foreslått at våre DGCs i DCKO mus utviklet gjennom parietalcellen avstamning [19]. Twist1
ble metylert i 40% av intramucosal kreft, mens hyppigheten av metylering i ikke-kreft mage slimhinner inkludert atypisk foci var sjeldne (10%), noe som indikerer at Twist1
metylering er en tidlig hendelse i DGC karsinogenese i vår mus modell. Blant de 18 primær GCer undersøkt, fem tilfeller var begge Twist1
methylation- og uttrykk-negative.

• PLoS ONE: Statiner dempe Helicobacter pylori CagA Trans og redusere forekomst av magekreft: In Vitro og populasjonsbasert kasus-kontrollstudier
• PLoS ONE: Endoskopisk reseksjon Sammenlignet med Gastrectomy å behandle tidlig magekreft: en systematisk oversikt og meta-analyse