PLoS ONE: Zic1 Arrangøren Hypermethylation i Plasma DNA er en potensiell biomarkør for magekreft og intraepitelial Neoplasia

Abstract

Magekreft (GC) er fortsatt en av de vanligste fordøyelses kreft over hele verden; Men de fleste pasienter presentere på et avansert stadium ved førstegangsdiagnose. Zic1
er en roman kandidat tumor suppressor gen som er epigenetiske forstummet i GC. I denne studien undersøkte vi Zic1
promoter metylering i plasma DNA som en roman molekylær markør for tidlig diagnose og oppfølging av GC. Metylering-spesifikk polymerasekjedereaksjon (MSP) analyse ble utført for å påvise Zic1
promoter metylering i plasma DNA fra 20 friske forsøkspersoner, 50 gastriske intraepitelial neoplasi hos pasienter, og 104 GC pasienter. Zic1
promoter metylering rente i plasmaprøver fra friske kontrollgruppen var 0%, men den nådde 54,0% i intraepitelial neoplasi gruppen og 60,6% i GC-gruppen. De to sistnevnte verdier var signifikant høyere enn det som finnes i det friske kontrollgruppen (p 0,05), med et 100% spesifisitet for intraepitelial neoplasi og GC diagnose. Den positive prediktive verdi av plasma Zic1
promoter metylering for diagnostisering av intraepitelial neoplasi og GC var 100%. Metylering status i GC gruppen var ikke signifikant assosiert med tumorstørrelse, tumor differensiering, lymfeknutemetastase, TNM staging, eller tumorinvasjon (p > 0,05). Vurdering av betydningen av påvisning av carcinomaoppfinnelse-embryonale antigen (CEA) nivå og Zic1
promoter metylering sats for GC diagnose avdekket at følsomheten til Zic1
promoter metylering var betydelig høyere enn for CEA nivå som en markør, og at den kombinerte målingen av disse to indekser (parallell testing) forbedret følsomhet. Til sammen våre resultater tyder på at Zic1
promoter metylering rente i plasma-avledet DNA er av stor betydning for tidlig screening av GC og overvåking av tumorigenesis. Zic1
promoter metylering kan tjene som en roman non-invasiv plasma biomarkør for tidlig deteksjon av GC og for risikovurdering i høyrisikogrupper. Den kombinerte måling av Zic1
promoter metylering hastighet og CEA nivå (parallell testing) kan forsterke dagens retningslinjer for tidlig diagnostisering av GC

Citation. Chen X, Lin Z, Xue M , Si J, Chen S (2015) Zic1
Arrangøren Hypermethylation i Plasma DNA er en potensiell biomarkør for magekreft og intraepitelial neoplasi. PLoS ONE 10 (7): e0133906. doi: 10,1371 /journal.pone.0133906

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN

mottatt: 10 april 2015; Godkjent: 02.07.2015; Publisert: 24.07.2015

Copyright: © 2015 Chen et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer

Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Natural Science Foundation National of China (81302070, 81372623) (http://www.nsfc.gov.cn), Zhejiang Provincial Medisinsk og helse generell forskningsplan (2014KYB121) (http://www.zjwst.gov.cn/), Zhejiang Provincial Department of Education forskningsplan (Y201327398) (http://www.zjedu.gov.cn), og Zhejiang-provinsen nøkkelen vitenskap og teknologi, innovasjon team (2013TD13) (http://www.zjkjt.gov.cn/). Den Funder Shujie Chen utviklet og designet forsøkene for dette manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft (GC) er en av de mest vanlige kreftformer fordøyelseskanal og den tredje ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall [1]. Flertallet av GC pasienter til stede på et avansert stadium ved første diagnose. Globalt GC står for nesten 952 000 nye tilfeller årlig i henhold til Globocan 2012 [2]. I Japan er det fem-års overlevelse for tidlig GC (EGC) 86% mot 32% for avansert GC, som rapportert av den amerikanske seer program [3].

Aberrant DNA metylering er en viktig epigenetisk endring og en tidlig hendelse i kreftutvikling [4]. Nylig, flere tumorsuppressorgener (TSGs), inkludert FAM5C
, Mylk
, p16 Hotell og E-cadherin
, har blitt rapportert å være metylert i serum /plasma fra GC pasienter [5-7]. I tillegg hypermethylation av TSGs en tendens til å bli styrket med progresjon av forstadier til kreft [8-9]. Derfor kan påvisning av metylert DNA i serum /plasma være en lovende metode for tidlig diagnose av GC. Intraepitelial neoplasi (IN) er en potensielt forstadier lesjon som overfører en høy risiko for GC; således, er det screening av Hos pasienter avgjørende for diagnose og prognose av GC. Få rapporter om hypermethylated DNA-analyser av blodprøver fra mage intraepitelial neoplasi (GIN) pasienter er tilgjengelig til dags dato.

Økende bevis indikerer at Zic1 product: ( Zic
familiemedlem 1 , odd-paret Drosophila homolog) deltar i utviklingen av flere kreftformer [10-13]. Vi har tidligere oppdaget at Zic1
, en roman TSG er forstummet via promoter hypermethylation både GC celler og vev [14]. Vi har også vist at Zic1
er involvert i hemming av GC celle overlevelse og nedskrivning av celle migrasjon [15].

I denne studien har vi bestemt tidlig diagnostikk og prediktiv potensialer av Zic1
hypermethylation i plasma hos GC pasienter. Vi målte arrangøren metylering status for Zic1
i plasma fra pasienter med GC eller GIN og normal kontroll (NC) fag. Foreningen av Zic1
arrangøren metylering med clinicopathological parametere ble også vurdert. I tillegg klassifisert vi høyverdig I og T1 GC som EGC og plasserte GC og gin pasienter i en GC pluss i gruppe (GPI). Da vi analyserte Zic1
hypermethylation priser i både EGC og GPI grupper. Videre den kombinerte evalueringen av carcinomaoppfinnelse-embryonale antigen (CEA) nivå og Zic1
promoter metylering for GC diagnosen ble vurdert ved hjelp av plasma fra GC og gin pasienter.

Materialer og metoder

Kliniske prøver

Plasmaprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble oppnådd preoperativt på Sir Run Run Shaw Hospital, Hangzhou, Zhejiang, Kina, fra november 2012 til april 2015. Alle pasientene i vår studie gjennomgikk gastroendoscopy og ble gruppert ifølge histopatologi diagnose. Plasmaprøver ble samlet inn fra GC og gin pasienter som var naive til helbredende behandlinger, for eksempel cellegift, strålebehandling og kirurgisk fjerning. Eksklusjonskriterier inkluderte gastrointestinale sykdommer med andre årsaker og sykdommer i andre organer. Pasienter med gastrisk metastaser fra andre tumorer ble også ekskludert.

nummerert prøvene i henhold til den rekkefølge i hvilken de ble oppsamlet og deretter utført metylering-spesifikke polymerase kjedereaksjon (MSP) for å vurdere prøvene i numerisk rekkefølge. Prøvene ble videre gruppert i henhold til patologi resultater. Plasmaprøver ble samlet inn fra 104 GC pasienter med en gjennomsnittsalder på 59,8 år som ble diagnostisert i henhold til Verdens helseorganisasjon kriterier [16]. Femti GIN pasienter med en gjennomsnittsalder på 58,0 år ble diagnostisert med gastroskopi. Blodprøver ble også samlet inn fra 20 friske frivillige i NC gruppen med en gjennomsnittsalder på 38,5 år.

Etikk uttalelse

Vårt prosjekt fått godkjenning fra Klinisk forskningsetiske komité for Institute of Gastroenterology av Zhejiang University. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient før prøvetaking. De personer som deltok i denne studien ga skriftlig informert samtykke (som beskrevet i PLoS
samtykkeskjema) for å publisere disse tilfelle detaljer.

DNA og bisulfite modifikasjon

DNA ble ekstrahert fra plasmaprøver ved hjelp av en QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). DNA-konsentrasjoner ble målt ved hjelp av spektroskopi ved en bølgelengde på 260 nm. DNA var sulfitt-behandlet med en Zymo DNA Modification Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA). Den modifiserte DNA ble lagret ved -20 ° C inntil bruk.

MSP analyser

Zic1
promoter metylering ble undersøkt ved å utføre MSP-analyse ved hjelp av ovennevnte sulfitt-modifiserte gratis plasma DNA som mal. MSP ble utført i 40 sykluser ved en glødetemperatur på 56 ° C som tidligere beskrevet [14]. Metyleringen-spesifikke primere ble ZIC1-MF (5'-GGATTTTTTGTTTCGTAATC) og ZIC1-MR (5'-CCCGTTAACCACGTTAAACG), og de unmethylated-spesifikke primere ble ZIC1-UF (5'-GGGATTTTTTGTTTTGTAATT) og ZIC1-UR (5' CCCATTAACCACATTAAACA). PCR-protokollen er inkludert innledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, annealing ved 56 ° C i 40 s, primer-forlengelse ved 72 ° C i 40 s, og endelig forlengelse ved 72 ° C i 7 min. PCR-produktene ble elektroforese på 1,5% agarosegel, farget med Gel Red, og visualisert ved UV-belysning.

Serum CEA testing

serumprøver ble sendt til det kliniske laboratoriet av Sir Run Run Shaw Hospital for testing, og en CEA konsentrasjon av > 5 ng /ml ble ansett som unormal.

Statistiske analyser

De metylering frekvenser og CEA nivåer i plasmaprøvene ble sammenliknet med Fishers eksakte test. Sammenhengen mellom clinicopathological egenskaper og DNA hypermethylation ble analysert ved hjelp av chi-kvadrat test. Den diagnostiske verdien av kombinasjonen av Zic1
promoter metylering og plasma CEA nivået ble evaluert i henhold til arealet under mottaker drift karakteristikk (AUC). Følsomhet, spesifisitet og positiv og negativ prediktiv verdi for patologisk diagnose ble beregnet med 95% konfidensintervall for Zic1
promoter metylering eller Zic1
arrangøren metylering kombinert med CEA nivå. Positive og negative sannsynligheten forhold ble også beregnet. For alle testene, en cut-off verdien av p < 0,05 ble brukt for å bestemme statistisk signifikans. Alle statistiske analyser ble utført ved bruk av SPSS 19,0 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL).

Resultater

Metylering status i plasma

For å vurdere endringer i Zic1
promoter metylering i GC, vi først oppdaget metylering status for denne promoter i 104 pasienter med GC, 50 med GIN, 31 med EGC og 20 norsk sokkel og utført sammenligninger mellom gruppene. De metylering priser av Zic1
promoter i plasmaprøvene var 0% i NC-gruppen (0%), økende til 54,0% i GIN konsernet og 60,6% i GC-gruppen (p < 0,001 for både gIN og GC vs. NC), med 100% spesifisitet for GPI diagnose (20/20) (fig 1). De positive og negative prediktive verdier og positive og negative sannsynlighetsforhold for diagnostisering IN og GC var 100% (90/90), 23,8% (20/84), uendelig og 0,42 hhv. Representant MSP analyseresultatene for Zic1
promoter metylering er vist i figur 2.

Association of clinicopathological funksjoner med Zic1
promoter metylering i plasma hos GC pasienter

Vi korrelert de clinicopathological funksjoner med Zic1
promoter metylering rente i plasma av GC pasienter for å identifisere eventuelle assosiasjoner. Resultatene viste ingen markerte assosiasjoner mellom Zic1
promoter metylering rente og kliniske parametre, inkludert tumor størrelse, differensiering klasse, lymfeknute status, tumorinvasjon dybde og TNM stadium (p > 0,05) (tabell 1) .

kombinert bestemmelse av Zic1
hypermethylation og CEA nivå

betydningen av den kombinerte fastsettelsen av Zic1
hypermethylation hastighet og CEA nivå for diagnose og tidlig forutsigelse av GC ble analysert. Vi målte CEA nivå i 9 sokkelen 24 GIN pasienter og 71 GC pasienter før behandling. Følsomheten til CEA nivået i GC, IN, og EGC gruppene var 22,5% (16/71), 16,7% (4/24) og 10,5% (2/19), henholdsvis. I alle tre av gruppene, følsomheten av Zic1
promoter metylering var signifikant høyere enn den for CEA nivå (p 0,05).

Kombinert bestemmelse av Zic1
hypermethylation og CEA nivå i GC-gruppen.

i GC gruppen, sensitivitet og spesifisitet av den kombinerte fastsettelsen av Zic1
promoter metylering hastighet og CEA nivå (tandem testing) var 16,9 % og 90,9%, henholdsvis (tabell 2). Sensitiviteten av den kombinerte analysen av disse to parametre (parallell testing) var 69,0% (tabell 2), som er høyere enn følsomheten som oppnås ved testing av hver parameter alene. ROC-kurve analyse ble utført for å vurdere betydningen av DNA-metylering hastighet og CEA nivå for GC diagnose. AUC for Zic1
arrangøren metylering testing alene var 0,610 (S1 figur) og at for samlet vurdering av Zic1
promoter metylering og CEA nivå (tandem testing) var 0,539 (S2 fig) . Spesielt når Zic1
promoter metylering og CEA nivå ble analysert parallelt, økte AUC til 0,633 (fig 3). Basert på resultatene ovenfor, den kombinerte bestemmelsen av Zic1
promoter metylering hastighet og CEA-nivå (parallell testing) for GC diagnose ble funnet å være synergistisk sammenlignet med bruk av hver fremgangsmåte alene.

kombinert bestemmelse av Zic1
hypermethylation og CEA nivå i GPI gruppe.

i GPI gruppen, sensitivitet og spesifisitet av den kombinerte fastsettelsen av Zic1
promoter metylering hastighet og CEA-nivå (tandem testing) var 15,8% og 100,0%, henholdsvis (tabell 3). Den kombinerte vurdering av disse to parametrene (parallell testing) hadde den høyeste sensitivitet på 65,3%, med en positiv prediktiv verdi nådde 98,4% (tabell 3). ROC-kurve analyse ble utført for å vurdere betydningen av DNA-metylering hastighet og CEA nivå for GPI diagnose. AUC for Zic1
arrangøren metylering testing alene var 0,792 (S3 figur), og at for den kombinerte vurderingen av Zic1
promoter metylering hastighet og CEA nivå (parallell testing) var 0,771 (Fig 4). Derfor påvisning av Zic1
arrangøren metylering kan være et mer effektivt alternativ for GPI diagnose.

Diskusjoner

Nylig har mange gener er funnet å være metylert i GC vev , inkludert E-cadherin
, RASSF1A
, p16
, GSTP1
, SOCS1
, SFRP1
og PTEN product: [17]. Rapporterte metylering frekvenser har variert fra 56% til 96% [17]. DNA metylering har også blitt observert i blodprøver fra GC pasienter. Flere TSGs har blitt funnet å være metylert i blodprøver fra GC pasienter, inkludert p16
, E-cadherin
, og RAR
, med deteksjon priser på 37% til 48%, henholdsvis [18-21].

Zic1
er abnormt nedregulert i visse typer kreft, som tyder på sin funksjon som en TSG. Vår tidligere arbeid har avdekket at Zic1
promoter er ofte metylert i primær magekarsinom vev, med en høy oppklaringsprosenten på 94,6%, men ikke i normale mage vev [14]. Våre resultater har avdekket at Zic1
er en roman kandidat TSG som er nedregulert via promoter hypermethylation i GC. Men til vår beste kunnskap, har ingen studier undersøkt plasma Zic1
promoter metylering i GC eller GIN.

I denne studien, må vi først viste at avvikende metylering av Zic1
arrangøren kunne påvises i plasma fra GC og gin pasienter ved frekvenser på 60,6% og 54,0%, henholdsvis, som var betydelig høyere enn for norsk sokkel. Disse resultatene er i samsvar med tidligere studier [14]. Fra et diagnostisk synspunkt, Zic1
arrangøren metylering utstilt høy spesifisitet for å diskriminere norsk sokkel fra GC og gin pasienter (100%). Våre resultater viste også at påvisning av Zic1
arrangøren metylering hastighet hadde en høy positiv prediktiv verdi og en positiv sannsynlighet forhold og AUC for GC og GIN diagnose, noe som tyder på at Zic1
arrangøren metylering vurdering har potensiell verktøy for diagnostisering og tidlig prediksjon av GC.

Mange tidligere studier har fokusert på perifert blod DNA metylering i GC heller enn GIN pasienter, med bare en håndfull studier som fokuserer på DNA metylering i GIN. Utviklingen av endoskopiske teknikker har tillatt for tilgjengeligheten av mer effektive og mindre invasive behandlinger for EGC og gin pasienter. Samlet, screening for GIN bidrar til overvåking av GC og reduksjon av GC-relaterte dødsfall. Et interessant aspekt ved denne studien er at vi viste avvikende Zic1
promoter metylering i plasma fra GIN pasienter, med en treffprosent som var betydelig høyere enn for NC fag (p < 0,001). I fremtiden påvisning av hypermethylation av Zic1
arrangøren kan potensielt brukes som et forvarsel eller å screene for GC i høyrisikogrupper.

Vi vurderte også Zic1
promoter metylering i plasma fra pasienter GC i forbindelse med forskjellige clinicopathological parametere. Ingen statistisk ble observert signifikante sammenhenger mellom Zic1
promoter metylering og de ulike kliniske parametere, inkludert tumorstørrelse, differensiering klasse, lymfeknute status, tumorinvasjon dybde og TNM stadium; Men i vår tidligere studie [15], Zic1
metylering har vist seg å være involvert i GC invasivitet. I denne studien, ble de fleste av GC pasienter diagnostisert og behandlet på et tidlig stadium, noe som kan ha påvirket de endelige resultatene. Validering i en større befolkning kan gi innsikt i disse ulike resultater. Enten noen sammenheng mellom avvikende Zic1
promoter metylering og GC kliniske kjennetegn krever avklaring av videre analyse.

CEA er en klassisk svulst markør som vanligvis vurderes i klinikken. Denne markøren er ansett for å være den mest hyppig til stede i sen GC pasienter; Imidlertid har mange undersøkelser indikert at DNA-metylering kan påvises som begynner i de tidlige stadier av GC. I vår nåværende studie, ble en ROC-kurven generert for å vurdere betydningen av den kombinerte påvisning av Zic1
promoter metylering hastighet og CEA nivå (parallell testing) for diagnostisering av GC, avsløre at deres samlede deteksjon produsert mer signifikante resultater enn deteksjonen av hver parameter alene. Derfor foreslår vi at den samlede måling av Zic1
promoter metylering hastighet og CEA nivå kan forbedre diagnostisering av GC.

I konklusjonen, har våre resultater viser at måling av Zic1
promoter metylering i plasma-avledet DNA er av betydning for tidlig deteksjon av GC og for risikovurdering i høyrisikogrupper. Den kombinerte måling av Zic1
promoter metylering hastighet og CEA nivå (parallell testing) kan forsterke de gjeldende retningslinjer for tidlig diagnose av GC; imidlertid videre studier med større utvalgsstørrelser og klinisk validering nødvendig.

Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Påvisning av Zic1
promoter metylering i magekreft (GC) plasmaprøver.
En ROC-kurven for å vurdere betydningen av Zic1
promoter metylering testing for GC diagnose.
Doi : 10,1371 /journal.pone.0133906.s001 plakater (TIF)
S2 fig. Kombinert påvisning av Zic1
promoter metylering og CEA-nivå (tandem testing) i magekreft (GC) plasmaprøver.
En ROC-kurve for å vurdere betydningen av den kombinerte påvisning av de to parametre (tandem testing .) for GC diagnose
doi: 10,1371 /journal.pone.0133906.s002 plakater (TIF)
S3 fig. Påvisning av Zic1
promoter metylering i mage intraepitelial neoplasi (GPI) plasmaprøver.
En ROC-kurven for å vurdere betydningen av Zic1
promoter metylering testing for GPI diagnose.
doi: 10,1371 /journal.pone.0133906.s003 plakater (TIF)

• PLoS ONE: Regulerings B cellefunksjon hemmes av røyk og fedme i H. pylori-infisert Fag og er korrelert med økt risiko for magekreft
• PLoS ONE: Exosomal mirnas fra peritoneum Lavage Fluid som Potensielle Prognostiske Biomarkører av Peritoneal metastaser i Gastric Cancer