Abstract
Bakgrunn
For å forbedre utfallet av pasienter som lider av magekreft, en bedre forståelse av de underliggende genetiske og epigenetiske hendelser i denne malignitet er påkrevd. Selv CpG island methylator fenotype (CIMP) og mikro ustabilitet (MSI) har vist seg å spille sentrale roller i magekreft patogenesen, er fortsatt ukjent den kliniske betydningen av disse hendelsene på overlevelses utfall hos pasienter med magekreft.
Denne studien inkluderte en pasient kohort med patologisk bekreftet magekreft som hadde kirurgiske reseksjoner. En kohort av 68 gastrisk cancer ble analysert. CIMP og MSI statusene ble bestemt ved å analysere promoter CpG island metylering status av 28 gener /loci, og genomisk ustabilitet på 10 mikro markører, henholdsvis. En Cox proporsjonal farer modell ble utført for multivariat analyse inkludert alder, stadium, tumor differensiering, KRAS Resultater Ved multivariat analyse ble lenger OS signifikant korrelert med lavere patologisk stadium ( P CIMP og /eller MLH1 Citation. Shigeyasu K, Nagasaka T, Mori Y, Yokomichi N, Kawai T, Fuji T, et al. (2015) Klinisk Betydningen av MLH1 Metylering og CpG Island Methylator Phenotype prognostiske markører hos pasienter med magekreft. PLoS ONE 10 (6): e0130409. doi: 10,1371 /journal.pone.0130409 Redaktør: Hassan Ashktorab, Howard University, USA mottatt: 18 februar 2015; Godkjent: 20 mai 2015; Publisert: 29 juni 2015 Copyright: © 2015 Shigeyasu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av KAKENHI tilskudd 19390351 og 20590572 til TN, og med tilskudd R01 CA72851 og 181572 fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, og midler fra Baylor Research Institute til AG: konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer Innledning Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den nest største årsaken til kreft. -relaterte dødsfall, med ca 700 000 bekreftede dødelighet årlig over hele verden, selv om forekomsten har gradvis redusert [1-3]. Magekreft er vanligvis diagnostisert på et avansert stadium, som er den primære årsaken til dens dårlig prognose [4]. For å forbedre utfallet av magekreft, er identifikasjon av genetiske eller epigenetiske hendelser i utviklingen av magekreft nødvendig. Den viktigste epigenetisk begivenhet i utviklingen av kreft er metylering av promotor CpG regioner av nøkkel tumorsuppressorgener. CpG-øyer er nesten 1-kb lange sekvenser av DNA med høy guanin-cytosin innhold i promoter-regioner av genene [5]. I motsetning til normale celler, blir CpG øyer i tumorsuppressorgener i kreftceller ofte hypermethylated, fører til et CpG øy methylator fenotypen (CIMP) [6,7]. Epigenetisk stanse av tumorrelaterte gener på grunn av CpG øy metylering har nylig blitt rapportert i magekreft. Avvikende CpG island metylering av > 100 vekst-regulatoriske gener i magekreft har så langt blitt rapportert [8-24], men er fortsatt den kliniske betydningen av CIMP i magekreft uutforsket og dårlig forstått I kontrast. , mismatch reparasjon (MMR) mangel på magekreft er også en viktig genetisk begivenhet. Genomisk ustabilitet i antall mikro repetisjoner (eller mikro) kalles mikro ustabilitet (MSI). MSI er en funksjon forårsaket av en defekt DNA MMR-systemet. Funksjonell inaktivering av MMR gener, for eksempel MLH1 I lys av dette gapet i kunnskap, i denne studien, utforsket vi betydningen av CIMP og MMR mangel på magekreft og bestemt deres bidrag som prognostisk markører hos pasienter med magekreft. Materialer og metoder Vevsprøver Denne studien inkluderte en kohort av pasienter med patologisk bekreftet magekreft som hadde gjennomgått kirurgisk reseksjon ved Okayama-universitetet Hospital (Okayama, Japan) 1998-2004. I alt 68 magekreft vev og deres matchede normale gastriske mucosa ble analysert. Alle normale mageslimhinnen vev ble oppnådd fra steder nær, men i det minste 5 cm fra den opprinnelige tumor. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke og studien ble godkjent av den etiske komiteen av Okayama universitetssykehus. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke for bruk av sine data for fremtidige analyser. Alle mage kreft og normal mageslimhinnen var friske frosne vevsprøver, der DNA ble ekstrahert ved hjelp av en QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). MSI analyse ble utført ved undersøkelse av 2 mononukleotid gjentar (BAT25 og BAT26), 12 dinukleotidpolyfosfater repetisjoner (D17S250, D18S35, D18S58, D18S69, D2S123, D4S1559, D4S2381, D4S470, D5S107, D5S346, og D8S87, TP53), og ett tetranukleotid gjentar, MYCL, som beskrevet tidligere [ ,,,0],31]. Svulster som viser allele skift i ≥5 av 15 markører ble klassifisert som MSI-H (heretter referert til som "MSI"), og resten ble klassifisert som mikro stabil (MSS). på grunn hyppig hypermethylation av flere gener er en av de karakteristiske trekk ved svulster med CIMP, vi undersøkt metylering status for 28 promoter CpG island relaterte loci ( APC Direkte sekvensering ble utført for å identifisere KRAS JMP programvare (ver 10.0, SAS Institute Inc .) ble anvendt for å utføre statistisk analyse. T-test ble brukt for å sammenligne kontinuerlige variabler, og Fishers eksakte test ble brukt til å analysere kategoriske variabler. Total overlevelse (OS) ble målt fra driften dato til dato for død. Kaplan-Meier metoden og log-rang statistikk for forskjeller mellom ulike prognostiske faktorer ble brukt til å estimere OS distribusjoner. Cox proporsjonal fare modeller ble brukt til å beregne hazard ratio (HR) med tilhørende 95% konfidensintervall (KI). Univariate eller multivariat logistisk regresjonsanalyse ble utført for å bestemme forskjellene i HR mellom hver gruppe. Alle rapporterte P Study befolkningen I denne studien undersøkte vi 68 pasienter med magekreft. I promoter CPGs av MLH1 28 CpG loci inkludert APC Overlevelsesutfall i pasienter basert på MLH1 3 ' overlapp~~POS=TRUNC forholdet mellom CIMP og MLH1 3 ' på samme måte, de 5-årige OS priser ble analysert for de CIMP høye og CIMP lave grupper, og hastigheten var noe høyere i CIMP-high-gruppen enn i CIMP-low-gruppen, men forskjellen var ikke signifikant ( log-rank P Bidrag av mismatch reparasjon mangel og CIMP status til overlevelse De fem års overlevelse ble analysert og sammenlignet blant disse gruppene; CIMP-high / MLH1 3 ' forholdet mellom MLH1 Den overlappende forholdet mellom MLH1 5 ' multivariat analyse for å overleve utfallet predictors En Cox modell, inkludert alder, stadium, differensiering, KRAS DNA metylering i kreftceller har blitt et tema for intens etterforskning. Inaktivering av tumorsuppressorgener av CpG metylering av promotorområdene akselererer carcinogenese på grunn av avvikende cellesyklusregulering og proliferasjon [15]. Noen kandidat abnorme metylerte gener i magekreft er rapportert. RASSF1A Samtidig CpG metylering i flere gener har blitt definert som CIMP i tykk- og endetarmskreft (CRC) og magekreft [15,40,53- 57], og har blitt vist å korrelere med hypermethylation av tumorsuppressorgener. Men bevisene for CIMP i magekreft ikke like overbevisende som er tilfellet for CRC [58,59]. I magekreft, har CIMP-high blitt beskrevet hos 41% [40] og 31% [54] svulster. Pasienter med CIMP-høy magekreft har vesentlig kortere overlevelse enn de med CIMP-lav magekreft [54,60]. En annen rapport viste at CIMP var assosiert med bedre overlevelse i magekreft [54]. Den siste meta-analyse har fokusert på den sterke forholdet mellom CIMP med H. pylori, EBV, og MSI, men CIMP kunne ikke vise en prognostisk potensial for magekreft [61]. I motsetning til ustabilitet på mikro gjentar innen ulike vekstregulerende gener er definert som MSI. En standard panel, slik som NCI-panelet, er anbefalt, inkludert mononukleotid (BAT26 og BAT25) og dinukleotid (D2S123, D5S346, og D17S250) gjentas [62]. Tre nivåer av MSI kan identifiseres: høyt nivå MSI (MSI-H), lav-nivå MSI (MSI-L), og MSS. MSI-H fenotype i magekreft ble rapportert å utgjøre 5% -50% MSI positive svulster [17]. MSI er en funksjon forårsaket av en defekt DNA MMR-systemet. Funksjonell inaktivering av MMR gener, for eksempel MLH1 Som beskrevet ovenfor, CIMP og MMR-mangel status er viktige funksjoner i magekreft og kan reflektere overlevelse forskjeller hos pasienter som lider av denne malignitet. Signifikant korrelasjon mellom CIMP og MSI har blitt rapportert i GC [61]. Imidlertid data om de synergistiske virkningene av disse parameterne er mangelvare, og det kreves multivariat analyse av disse genetiske og epigenetiske parametere. I vår studie, CACNA1G Men CIMP og MMR-mangel er avhengige av hverandre. MSI-forbundet sporadiske CRC oppstår gjennom en prosess som involverer CIMP [66,71]; Derfor bør utføres integrert statistisk analyse av CIMP og MMR mangel. For eksempel, i duodenal adenokarsinomer, CIMP / MLH1 I konklusjonen, tyder våre data på at stratifisering av pasienter med CIMP basert på MLH1
mutasjonsstatus, og kombinert CIMP / MLH1
metylering status i forhold til total overlevelse (OS).
= 0,0088), bedre tumor differensiering ( P
= 0,0267) og CIMP høy og MLH1 3 '
metylert status ( P
= 0,0312). Lagdeling av CIMP status med hensyn til MLH1
metylering status ytterligere aktivert prediksjon av magekreft prognose.
Konklusjoner
metylering status kan ha et potensial til å bli prognostiske biomarkører for pasienter med magekreft
eller MSH2
, av arrangøren metylering er ansvarlig for MSI-høy (MSI-H) fenotype i magekreft. I en tidligere studie, magekreft med MSI-H viste en høyere frekvens av antrum beliggenhet, intestinal subtype, lavere forekomst av lymfeknutemetastaser, og bedret overlevelse, sammenlignet med mikro stabil (MSS) eller MSI-L mage kreft [17,25 -30]. Det gjenstår imidlertid den kliniske betydningen av MMR-mangel i magekreft ukjent.
MSI analyse
Natriumbisulfitt modifikasjon og CIMP analyser
, CACNA1G
, CHFR
, COX2
, DAPK
, DCC
, HPP1
, MGMT-Mp-regionen
, MGMT-Eh omegn, MINT1
, MINT2
, MINT31
, MLH1 5 '
, MLH1 3 '
, P14
, p16
, RASSF1A
, RASSF2A-region1
, RASSF2A-region2
, RASSF3
, RASSF5
, RASSF6
, RUNX3
, SFRP2-region1
, SFRP2- region2
, UNC5C
, 3OST2
, FOXL2
), og de tilsvarende primer sekvenser er oppført i S1 tabell. Genomisk DNA var bisulfite-modifisert for å konvertere alle unmethylated cytosinrester til uraciler. I korte trekk, ble 0,5-2,0 ug DNA denaturert i NaOH, behandlet med natriumbisulfitt, og renset ved hjelp av veiviseren DNA Opprydding System (Promega). Metyleringen status for hvert CIMP relaterte locus ble evaluert ved kombinert bisulfitt restriksjonsanalyse (Cobra). Polymerase kjedereaksjon (PCR) for Cobra ble utført på en bisulfitt-modifiserte templat-DNA i en 25 pl PCR-blanding inneholdende 12,5 pl HotStarTaq Master Mix (Qiagen), 0,5 umol /L av hver PCR-primer, og omtrent 25 ng av sulfitt-modifiserte DNA. PCR-produktene ble spaltet ved tilsetning av restriksjonsenzym ved 37 ° C i 12 timer. Spaltet DNA ble separert på 3% agarosegel i 1 x Tris-acetat-EDTA-buffer og farget med etidiumbromid. Normalt humant kolon-DNA behandlet med SSSI metylase (New England Biolabs) ble anvendt som en positiv kontroll for metylerte alleler, og DNA fra normale lymfocytter ble anvendt som en kontroll for unmethylated alleler. Vann ble anvendt som en negativ kontroll PCR for å overvåke PCR-forurensning. CIMP-high ble definert som ikke mindre enn 10 av metylering av disse loci.
KRAS
mutasjon analyserer
ekson 2 (kodon 12/13) mutasjoner. PCR for KRAS
genet ble utført i en 25-ul PCR blanding som inneholder 12,5 mL av HotStarTaq Master Mix kit med primere. Den QIAquick PCR Purification kit ble brukt til å rense PCR-produkter, og de var direkte sekvensert på en ABI 310 DNA-sekvens [32].
Statistiske analyser
verdier er tosidig, og P
< 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans.
Resultater
genet, spredning av CpG metylering innenfor sin 3 'region ble bestemt å være et kritisk for MLH1 uttrykk [33]. En beskrivelse av pasientmateriale og diverse clinicopathological funksjoner basert på kjønn, alder, stadium, tumor differensiering, MSI status, KRAS
mutasjon, og MLH1 3 '
metylering er vist i tabell 1. disse statusene ble sammenlignet mellom de CIMP høye og CIMP lave grupper. Av disse parametrene, MSI status og MLH1 3 '
metylering status viste bemerkelsesverdige forskjeller mellom de 2 gruppene (tabell 1).
Metylering status
, CACNA1G
, CHFR
, COX2
, DAPK
, DCC
, HPP1
, MGMT-Mp omegn, MGMT-Eh omegn, MINT1
, MINT2
, MINT31
, MLH1 5 '
, MLH1 3'
, P14
, p16
, RASSF1A
, RASSF2A-region1
, RASSF2A-region2
, RASSF3
, RASSF5
, RASSF6
, RUNX3
, SFRP2 -region1
, SFRP2-region2
, UNC5C
, 3OST2 Hotell og FOXL2
ble analysert for å bestemme CIMP status for hver magekreft . Metylering spektrum av disse loci er vist i flis kart (Fig 1a). I disse loci, CACNA1G
, CHFR
, DCC
, HPP1
, MINT1
, MINT2
, MINT31
, MLH1 5 '
, MLH1 3'
, p16
, RASSF2A-region1
, RASSF2A-region2
, RUNX3
, SFRP2-region2
, UNC5C
, 3OST2
, og FOXL2
ble betydelig metylert i CIMP-high-gruppen (tabell 2).
metylering og CIMP status i mage kreft
metylering status ble analysert. 10 pasienter var i CIMP-high / MLH1 3 '
denaturert, en pasient var i CIMP-low / MLH1 3'
denaturert, 20 pasienter var i CIMP høy / MLH1 3 '
ikke-metylert og 37 pasienter var i CIMP-low / MLH1 3'
ikke-denaturert grupper (fig 1b). Kaplan-Meier overlevelseskurver ble generert i henhold til MLH1 3 '
metylering status. De fem-års OS prisene ble bestemt for MLH1 3 '
denaturert og ikke-denaturert grupper. De fem-års OS priser var betydelig høyere i MLH1 3 '
metylert gruppe sammenlignet med ikke-metylert gruppe. (Log-rank P
= 0,0257; fig 1c)
= 0,0688, fig. 1 d)
metylert, CIMP-low / MLH1 3'
denaturert, CIMP høy / MLH1 3 '
ikke-metylert og CIMP-low / MLH1 3 '
ikke-denaturert grupper. Vi merket oss at den samlede overlevelse var høyere i den kombinerte CIMP-high / MLH1 3 '
denaturert gruppen, sammenlignet med de andre gruppene der forskjellene var ikke statistisk signifikant (log-rank P
= 0,0706, fig. 1e)
metylering og MSI
metylering og 3 '
metylering status ble analysert. 10 pasienter ble klassifisert som MLH1 5 '
metylert / 3'
denaturert, 8 pasienter som MLH1 5 '
metylert / 3'
ikke- denaturert, en pasient som MLH1 5 '
ikke-denaturert / 3'
denaturert, og 49 pasienter som 5 '
ikke-denaturert / 3
non-metylert (fig 2a). I MLH1 3 '
denaturert gruppe, mer enn 80% av pasientene viste MSI. I motsetning til i MLH1 3 '
ikke-denaturert gruppe, nesten alle tilfeller viste MSS (fig 2b). Kaplan-Meier overlevelseskurver ble generert i henhold til MLH1 5 '
metylering status. De fem-års overlevelse ble analysert for MLH1 5 '
denaturert og ikke-denaturert grupper, og hastigheten var noe høyere i MLH1 5'
metylert gruppen enn i ikke- metylert gruppe, men forskjellene var ikke signifikante (log-rank P
= 0,1009; fig 2c). Kaplan-Meier overlevelseskurver ble generert ifølge MSI status. De fem-års overlevelse ble analysert for MSI og MSS grupper, og hastigheten var noe høyere i MSI-gruppen enn i MSS gruppen, men forskjellene var ikke signifikante (log-rank P
= 0,1316; fig 2d).
mutasjonsstatus, og CIMP / MLH1 3 '
metylering status i forhold til OS ble brukt til å utføre multivariabel analyse (tabell 3). Bare scenen ( P
= 0,0088), differensiering ( P
= 0,0267), og CIMP / MLH1
metylering status ( P
= 0,0312) var statistisk signifikant prediktor for OS. Hazard ratio var betydelig lavere i CIMP-high / MLH1 3 '
denaturert gruppe.
Diskusjoner
, p14ARF
, og MGMT product: [34-38]; CHRNA3
, DOK1
, og GNMT product: [39]; p16
, hMLH1
, MINT1
, MINT2
, MINT12
, MINT25
, og MINT31 product: [40]; APC
, CDH1
, MHL1
, CDKN2A
, CDKN2B
, og RUNX3 product: [17 ]; CDH1 product: [41]; DKK3 product: [42]; PTEN product: [43]; MGMT product: [44]; TFPI2 product: [22]; CACNA2D3 product: [45]; PCDH10 product: [46]; SOX2 product: [47]; MAL product: [48]; og COX2 product: [49] ble tidligere rapportert å være hypermethylated i magekreft. Metylering av p16
promoter CpG øyer er en markør for malignt potensial av dysplasi i magen [50]. Metylering av MGMT
er assosiert med avansert stadium og dårlig prognose [44]. Avvikende DNA metylering i disse genene kan fremme utvikling av magekreft. Men presise genet målene for hypermethylation for kreftutvikling er fortsatt ukjent [51,52].
eller MSH2
, ved mutasjonsinaktivering og formidler metylering er ansvarlig for MSI-H fenotype i magekreft. Spesielt, i likhet med CRC, metylering av MLH1
er forbundet med MSI-H fenotype [15,40,63,64] fordi MLH1
metylering forut for tap av protein ekspresjon. Leite M et al. rapportert at MLH1
promoter hypermethylation ble observert hos 78,7% (70/89) av de analyserte MSI tilfeller [65]. Metylering av 3 'regionen av er MLH1
arrangøren, som er nær sin transkripsjonen start hotellet (TSS), som kreves for genet demping. 5'-enden av promoteren er også utsatt for metylering, men dette er ikke funksjonelt viktig med mindre metylering strekker seg til det kritiske 3'-region [66,67]. MSI status er ansvarlig for mutasjon av gener som regulerer cellesyklus og apoptotisk signalering, inkludert TGFβRII
, IGFIIR
, TCF4
, RIZ
, BAX
, CASPASE5
, FAS
, BCL10
, og APAF1 product: [17,25] og gener å opprettholde genomisk integritet , inkludert MSH6
, MSH3
, MED1
, RAD50
, BLM
, ATR
, og MRE11 product: [17,68]. Gastric kreft med MSI-H viser en høyere frekvens av antrum beliggenhet, intestinal subtype, lavere forekomst av lymfeknutemetastaser, og bedre overlevelse i forhold til de av magekreft med MSS eller MSI-L [17,25-30].
, CHFR
, DCC
, HPP1
, MINT1
, MINT2
, MINT31
, MLH1 5 '
, MLH1 3'
, p16
, RASSF2A-region1
, RASSF2A-region2
, RUNX3
, SFRP2-region2
, UNC5C
, 3OST2
, og FOXL2
ble betydelig metylert i CIMP-high-gruppe. Spesielt rapporterte vi promoter metylering av FOXL2
i magekreft. FOXL2
er et gen som koder for en gaffelhodetranskripsjonsfaktor og er avgjørende for eggstokkfunksjon [69]. FOXL2
regulerer cellesyklusen ved å indusere G1 rest og beskytter cellene mot oksidativ skade ved å fremme oksydert DNA-reparasjon og ved å øke mengden av det anti-oxidant middel glutation [69]. FOXL2
undertrykker spredning, invasjon og fremmer apoptose av livmorhalskreftceller [70]. Arrangøren metylering av FOXL2
kan ha en betydelig rolle i tumordannelse i magekreft. I kontrast, MLH1 3 '
metylering var nødvendig for MMR-mangel og viste MSI. MLH1 3 '
metylering gruppe hadde en tendens til en god prognose i Kaplan-Meier overlevelsesestimat.
metylering status viste en signifikant prognostisk verdi i både OS og time-to-gjentakelse (TTR) i multivariat analyse [72]. Pasienter med CIMP-høy / MLH1
-unmethylated svulster hadde den verste OS og TTR [72]. I vår multivariat analyse av pasienter med magekreft, bare CIMP-high / MLH1 3 '
denaturert gruppen hadde en god prognose. Grunnen til god prognose i CIMP-high / MLH1 3 '
metylert gruppen er fortsatt ukjent. Dette fenomenet kan være på grunn av synergistisk inaktivering av vitale gener på grunn av mutasjon og formidler metylering. For ytterligere å bekrefte våre funn, utførte vi en uavhengig validering av resultatene fra i pasientdata som sendes inn til Kreft Genome Atlas database (TCGA). [73-75] CIMP-high / MLH1
hyper-metylert gruppen viste hyppigere lymfeknutemetastase (p = 0,0009), avansert sykdom stadium (p = 0,0078; S1 File), og litt bedre Sykdomsfri overlevelse (S2 File). På den annen side kan CIMP /MSI status ikke viser vesentlig verdi som prognostisk markør (S2 tabell). Dette resultatet viser at MLH1
har den viktigste rollen blant MMR gener i kreftutvikling av GC. Videre undersøkelser er nødvendig for å belyse forholdet mellom CIMP status og MMR mangel. Denne tilnærmingen vil føre til en ny strategi for behandling av magekreft.
metylering status kan gjøre det mulig prediksjon av magekreft prognose. Den CIMP-high / MLH1 3 '
metylert gruppen hadde god prognose, men andre grupper kan kreve intensiv behandling for forbedring av overlevelse, som må godkjennes i fremtidige studier.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fil. Forholdet mellom CIMP og MLH1
metylering i Gastric kreftpasienter i TCGA database.
Vi undersøkte metylering status for 17 promoter CpG island relaterte loci ( APC
, CACNA1G
, CHFR
, DAPK
, DCC
, MGMT
, MINT