PLoS ONE: Aberrant CCR4 Expression er involvert i tumorinvasjon av Lymph Node-Negativ Menneskelig Gastric Cancer

Abstract

Cellular chemotaxis er den mest kjente funksjon kjemokinreseptorer som er nært knyttet til tumormetastaser. Faktisk kunne positivt uttrykk for kjemokinreseptorer også identifiseres selv i noen pasienter uten metastatiske svulster, mens den kliniske relevansen av disse dataene ikke er fullt etablert. Våre studier ble designet for å avklare CCR4 uttrykk profiler og å utforske dens potensielle rolle i histologisk node-negative (pN0) magekreft (GC). Immunhistokjemi (IHC) eller immunohistofluorescence (IHF) analyse ble utført på prøver hentet fra 108 pasienter med pN0 GC. Vi fant ut at CCR4 var abnormt over-uttrykt inpN0 GC vev, med ulike uttrykk mønstre på kreftceller og blir assosiert med T-stage ( P
= 0,002). Matrigel in vitro
invasjon assay viste at over-ekspresjon av CCR4 i GC-cellelinjer betydelig forbedret invasiv kapasiteten til disse cellene. Resultater fra sanntids RT-PCR og gelatinzymography viste en signifikant økning i matriks-metalloproteinase (MMP) -9 produksjon indusert ved tvungen ekspresjon av CCR4 i GC-cellelinjer. Våre data tyder på at avvikende CCR4 uttrykket er involvert i tumorinvasjon av pN0 GC og, tenkes, antagonister av CCR4 kan være nyttige kandidater for å kontrollere tidlige hendelser i tumorprogresjon

Citation. Yang Y, Du L, Yang X, Qu A, Zhang X, Zhou C, et al. (2015) Aberrant CCR4 Expression er involvert i tumorinvasjon av Lymph Node-Negativ Menneskelig Gastric Cancer. PLoS ONE 10 (3): e0120059. doi: 10,1371 /journal.pone.0120059

Academic Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, TAIWAN

mottatt: 29 september 2014; Godkjent: 03.02.2015; Publisert: 19 mars 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Data Tilgjengelighet: Forfatterne bekrefte at deres data er innenfor manuskript og sin nåværende saksdokumenter fil

Finansiering:. Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation National of China (Grant Nos 81271916 og 81301506), Forskningsfondet for doktorgradsutdanningen av høyere utdanning i Kina (nr 20120131110055), Uavhengig Innovation Foundation of Shandong University (IIFSDU, 2012TS174), Shandong Technological Development Project (STDP, 2013GSF11859), Natural Science Foundation i Shandong (Grant No. ZR2013HM104) og National Key Clinical medisinsk Spesialiteter Foundation

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

i likhet med de fleste av kreft, magekreft (GC) er en høyt. aggressiv kreft som har en tendens til å invadere omkringliggende vev og metastaserer til fjerne organer. Selv om pasienter med lymfeknute negativ magekreft har bedre resultater enn de med knutemetastaser [1, 2], noen av dem fortsatt led av lokale residiv eller fjernmetastaser etter kurativ reseksjon [3-5]. Identifisere effektive faktorer eller viktige molekyler assosiere med sykdomsprogresjon i iscenesatte node-negative magekreftpasienter er nødvendig, med tanke på at disse pasientene kan ha nytte av adjuvant behandling.

Chemotaxis spiller en nøkkelrolle i metastase, regi motiliteten metastatiske celler gjennom graderinger av chemoattractants. Spesielt de kjemokinreseptorer mekle organspesifikk metastasering av svulster ved å samhandle med sine matchende chemokiner på målorganene [6]. Gastric kreftceller kan uttrykke ulike kjemokinreseptorer som chemokin reseptor 4 (CXCR4) og chemokin reseptor 7 (CCR7), og co-opt disse molekylene for metastase [7-12]. Andre roller kjemokinreseptorer i kreft progresjon bortsett chemotaxis er sjelden avdekket. CCR4, en C-C-type kjemokinreseptor, er tidligere blitt fokusert på dets biologiske funksjon i immunpatogenese av hematologiske tumorer [13]. Til dags dato har relativt liten oppmerksomhet er betalt til rollen CCR4 i å fremme metastasering av noen solide tumorer, inkludert magekreft [14-17]. Vår gruppe har vist at lymfocytt-rike GCer tendens til å være mer hyppig positiv for CCR4, og funnet en ny rolle CCR4 i tumor-indusert immunsuppresjon [18], noe som indikerer forskjellige uttrykk profiler av CCR4 i GC vev og flerfunksjonelle rollene til dette molekylet i GC progresjon.

det er vel kjent at invasjonen er første skritt som fører til kreft metastasering. Bevis har vist at noen kjemokin reseptorer, så som CXCR4 [19] og CCR7 [20], fremme B-celle kronisk lymfocytisk leukemi celle invasjon ved oppregulering av MMP-9. Nylig, Yu et al. viste at CXCR4 kunne fremme celle migrasjon og invasjon gjennom induserende uttrykk for MMP-9 og MMP-13 i muntlig plateepitelkarsinom [21]. Li og kolleger fant at CCR7 var involvert i menneskets tykktarm kreft invasjon via oppregulering av MMP-9 [22]. Det er ikke klart, men om CCR4 kan også fremme kreft celle invasjon.

Gitt den brede distribusjonen av kjemokinreseptorer innenfor svulster andtheir potensielle roller i tumorinvasjon og metastase, vi hypotese at pN0 magekreftpasienter bære viss chemokine reseptorer kan være mer sannsynlig å oppleve ytterligere progresjon. For å teste vår hypotese, undersøkte vi uttrykket profiler av CCR4 i magekreftceller av pN0 pasienter og dens rolle i magekreft celle invasjon.

Materialer og metoder

Pasienter og prøver

Vevsprøver ble innhentet fra 108 pasienter (75 menn og 33 kvinner, i alderen 35-71 år, gjennomsnittsalder 62 år) med pN0 magekreft gjennomgår kurativ reseksjon av primærtumor i Qilu Hospital of Shandong University (Jinan, Kina). Vi brukte over matchet tilstøtende normale mage vev og vev fra 56 mage dysplasi pasienter (36 menn og 20 kvinner, i alderen 35-68 år, gjennomsnittsalder 48 år) som kontroller. Alle histopatologiske diagnoser og ondartede klassifikasjoner ble bestemt av senior patologer ved diagnosetidspunktet, ifølge Verdens helseorganisasjon International Histologisk klassifikasjon av svulster [23], og den postoperative patologisk iscenesettelsen ble bestemt på grunnlag av International Union Against Cancer (UICC) [24 ]. Studien ble godkjent av etikkomiteen av Qilu Hospital og skriftlig informert samtykke fra alle pasienter ble også oppnådd.

Immunohistochemistry og immunohistofluorescence

IHC eller IHF ble utført på parafinsnitt ved hjelp av antistoffer mot humant CCR4 (LS-A351, LifeSpanBioSciences, Seattle, WA, USA) og Anti-pan Cytokeratin (CK) antistoff (ab80826; Abcam, Cambridge, MA, USA), å følge instruksjonene fra hver produsent. Fluorescent antistoffer inkluderer geit anti-kanin TRITC konjugerte antistoffer (E031320, Amyjet Scientific, Inc. Wuhan, Kina), geit anti-mus FITC-konjugerte antistoffer (E0312400, Amyjet Scientific, Inc. Wuhan, Kina). Prøvene ble visualisert og observert under et fluorescens mikroskop (IX81, Olympus, Tokyo, Japan), og IHC resultatene ble analysert som tidligere rapportert [18]

Cellekultur

human mage. kreft cellelinjer SGC-7901 og BGC-823 ble kjøpt fra Culture Collection av den kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina) og vedlikeholdes i RPMI-1640 (HyClone, Logan, UT, USA) supplert med 10% FBS (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ved 37 ℃ i en fuktet atmosfære av 5% CO _2.

Transient overuttrykk av CCR4 i SGC-7901 og BGC-823 celler

Forbigående transfeksjon av plasmidet EGFP-CCR4 (CCR4) eller et EGFP ekspresjonsvektor (MOCK) i gastriske cellelinjer ble utført ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) som tidligere rapportert [18]. Og transfeksjonseffektiviteter ble bestemt ved fluorescens mikroskop, i sanntid revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) og strømningscytometri (FCM), respektivt.

Kvantifisering av mRNA ved hjelp av RT-PCR og sanntids RT -PCR

Total RNA ble isolert fra celler ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og revers transkriptase reaksjoner ble utført med kit i henhold til produsentens protokoll (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland ). For RT-PCR, ble primere og PCR-forhold for amplifisering av CCR4 anvendt som tidligere beskrevet [25]. Og human glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) (forover-primer, 5'-GGTGGTCTC-CTCTGACTTCAACAG-3 ', revers primer, 5'-GTTGTTGTAGCCA-AATTCGTTGT-3') ble usedas en intern standard. For real time RT-PCR, ble primere for CCR4, MMP-9 og GAPDH og forsterkningsbetingelsene brukes som tidligere rapportert [18, 25, 26].

FCM analyse

Cellene ble høstet inkubert med en fysoerytrin (PE) konjugert anti-CCR4 monoklonalt antistoff (FAB1567P, R &D Systems) eller med en mus IgG2b-PE isotypekontrollantistoff (IC0041P, R &D Systems) i henhold til produsentens instruksjoner. FCM-analyse ble så utført ved hjelp av en FACSCalibur (Becton Dickinson, Heidelberg, Tyskland) for å analysere CCR4 uttrykk på SGC-7901 og BGC-823 celler, henholdsvis.

Matrigel invasjonen analysene

in vitro
invasjonen analysen ble utført ved hjelp av 24 cellekultur inserts inneholder 8-mikrometer membraner (BD Biosciences, San Jose, California). Hver membran ble belagt med Matrigel (30 ug, Becton Dickinson, San Jose, CA) og inkubert i 30 min. Deretter ble 0,2 ml transfektert eller paren GC-celler ble resuspendert i serumfritt RPMI-1640 med en konsentrasjon på 1,5 x 10 ^{5 /ml og anbragt i det øvre kammer, og 0,6 ml RPMI-1640 medium inneholdende 10% FBS var tilsatt til basolateral kammeret. Etter 24 timers inkubering ved 37 ℃ med 5% CO _{2, ble cellene fiksert og farget med 0,2% eosin Y Antallet celler som hadde migrert til basalsiden av membranen ble kvantifisert under et lysmikroskop ved 200 x forstørrelse.}}

Celleviabilitet assay

celler ble sådd ut i 96-brønners plater ved 5 x 10 ^{3 celler /brønn og dyrket i angitte tidspunkter. Celleviabilitet ble evaluert med CCK8 (Beyotime, Haimen, Kina) etter produsentens anvisninger. Absorbansen ble målt ved 450 nm bølgelengde. Hvert tidspunkt ble gjentatt i tre brønner og analysen ble independentlyperformed for tre ganger.}

Gelatin zymografi

Supernatanter ble samlet opp ved sentrifugering etter 24 timer etter transfeksjon og løst på en SDS-PAGE-gel innehold 0,1% (vekt /volum) gelatin. Etter elektroforese ble proteinene renaturert ved vasking av gelen to ganger i 40 min i 2.5% Triton X-100, etterfulgt av en inkubasjon i 18 timer ved 37 ° C i en blanding inneholdende Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), CaCl _{2 5mMm og NaCl 200 mM. Deretter ble gelen ble kort renset i destillert vann og farget med 0,25% Coomassie Brilliant Blue R250 /45% metanol /10% eddiksyre i 4 timer og deretter avfarget i 45% metanol, 8% eddiksyre. Geler ble deretter skannet og fotografert med Kodark systemer.}

Statistisk analyse

Data fra minst tre uavhengige eksperimenter ble analysert og uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Forholdet mellom CCR4 ekspresjon og T-fasen ble analysert ved hjelp av chi-kvadrattesten. Andre data ble analysert ved Student t-test eller ANOVA der det er hensiktsmessig. Et P
-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle analyser ble gjort ved hjelp av statistisk programvare (versjon 13.0, SPSS, Inc., Chicago, IL).

Resultater

Over-uttrykk for CCR4 med distinkte uttrykk mønstre i pN0 magekreft vev tidlig

CCR4 uttrykk i kreftceller ble oppdaget ved variable nivåer. Blant 108 parafininnstøpte vev, for 29 tilfeller (26,9%) viste negative uttrykk (-), 30 tilfeller (27,8%) viste svak ekspresjon (+), 35 tilfeller (32,4%) viste moderat ekspresjon (++), og 14 tilfeller (13,0%) viste en sterk ekspresjon (+++) (fig. 1A-D). Alle tilstøtende normale mage vev viste negativ farging for CCR4, og bare 2 (3,6%) tilfeller av mage dysplasi viste svak uttrykk for membran CCR4 (Fig. 1E og F).

Både membran og cytoplasma uttrykk for CCR4 var hyppigst observert i godt differensiert tumor reder av intestinal-type, mens de mindre differensierte celler en tendens til å vise et cytoplasmatisk mønster av CCR4 ekspresjon i diffust typen magekreft (fig. 2). Et interessant fenomen er at cellene med svært invasiv potensial, for eksempel muskel invasjon, vaskulær penetrering og nerve invasjon, vises også en cytoplasmatisk CCR4 uttrykk mønster (Fig. 3).

CCR4 over-uttrykk fremmer magekreftcelle invasjon

i typiske seksjoner, ble det også vist at ekspresjonsnivået av CCR4 hadde en tendens til å øke med dybden av tumorinvasjon (fig. 3). IHC analyse tydelig viste at over-uttrykk for CCR4 var positivt assosiert med T scenen ( P
= 0,002), vaskulær invasjon ( P
= 0,001) og perinevral invasjon (P = 0,002) i pN0 GC (tabell 1).

Vi har rapportert at nivåene av CCR4 protein var ganske lav i noen mage cellelinjer [18], og dermed for å få ytterligere innsikt i CCR4-mediert tumorinvasjon, over- ekspresjon av CCR4 i gastriske cellelinjer ble utført som vi tidligere beskrevet [18]. Høye transfeksjonseffektiviteter ble bestemt ved sanntids RT-PCR, FCM og fluorescens mikroskopi, henholdsvis (fig. 4A-C). Den EGFP ble uttrykt i kjernen, cytoplasma og membranen av vektorkontrollcellene, som har blitt transfektert med plasmid MOCK; og det fluoriserende fusjonsproteinet ble lokalisert i cytoplasma og membranen av CCR4 plasmid transfekterte celler. Matrigel invasjon assay viste at antallet av EGFP-CCR4-transfekterte magecancerceller som passerer gjennom matrigel var betydelig høyere enn de av mock-transfekterte magecancerceller (Fig. 4D). Den CCK8 analysen indikerte at overekspresjon av CCR4 hadde ingen effekt på magekreft celleproliferasjon (S1 figur).

CCR4 regulerte MMP-9 produksjonen i magekreftceller

For å teste de mulige mekanismene bak CCR4-mediert tumorinvasjon, vurderte vi effekten av CCR4 på MMP-9-ekspresjon og aktivitet. Real time RT-PCR-analyse (Fig. 5A) viste at EGFP-CCR4-transfektert mage kreftceller uttrykt høyere nivåer av MMP-9 mRNA forhold til mock-transfekterte celler i 24 timer etter transfeksjon. Gelatin zymografi analyse (Fig. 5B) viste at utskillelsen og aktiviteten til MMP-9 var signifikant oppregulert i supernatantene av EGFP-CCR4-transfekterte celler sammenliknet med mock-transfekterte celler ved 48 timer etter transfeksjon, med eller uten tilsetning av eksogene CCL22.

Diskusjoner

interaksjoner mellom kjemokinreseptorer av kreftceller og deres matchende chemokiner representerer viktige skritt i tumormetastaser. Men resultatene av vår nåværende studyshowed at et visst antall av magekreftpasienter uten lymfatisk metastaser var også positivt for CCR4 farging. I motsetning til de fleste tidligere studier på funksjoner av kjemotaksi mediert av noen kjemokinreseptorer, denne forskning viste en ny, invasiv oppførsel av CCR4.

chemokin-reseptorer tilhører en familie av syv-transmembran G-protein-koblede reseptorer som er membranen proteiner, og de funksjonelle konsekvenser av chemokin-reseptor-aktivitet er generelt antatt å være avhengig av stimulering av ekstracellulære ligander [27]. Imidlertid histologiske prøver av denne studien viste at det var forskjellige uttrykk mønstre for CCR4. CCR4 i ikke-neoplastiske celler viste negativ farging, med bare svak membranfarging i mage dysplasi lesjoner. Membran og cytoplasma uttrykk for CCR4 oftest dukket opp i moderat til godt differensiert tumor reir, mens uttrykk i mindre differensierte celler tendens til å være begrenset primært til cytoplasma. Og mer intriguingly, som vist på typiske seksjoner, tumorceller som oppviser høye invasive kapasiteter, som muskel invasjon, vaskulær gjennomtrengning og nerve invasjon, viser ofte en økt cytoplasmisk ekspresjon av CCR4. Våre data tyder på en nær sammenheng mellom cytoplasmatiske CCR4 uttrykk mønster og aggressiv atferd av mage kreftceller. Dette funnet er i strid med vanlig antagelse at det ekstracellulære domene av en kjemokinreseptor nødvendigvis er påkrevet i tumormetastase ved interaksjon med dets ligand. Lignende fenomener har blitt observert med kjemokinreseptoren CXCR4, hvis kjernefysiske lokalisering var assosiert med utviklingen av ulike svulster [28-30]. Disse data indictate at magekreftceller kan invadere nærliggende vev via CCR4 i en ligand-uavhengig måte. Den andre hypotese var at CCR4 internalisering forårsaket av dets ligand kan representere en mekanisme som har utviklet seg i det cytoplasmatiske CCR4 uttrykksmønster. CCL22, blir CCR4 ligand produsert av humane magecancer vev [31], også kjent å causeCCR4 internalisering av membran til cytoplasma [32, 33], som tyder på cytoplasmatisk farge kan vise aktivert signale følgende CCR4-CCL22 ligering. Flere studier er nødvendig for å avsløre de nøyaktige mekanismene bak disse unormale mønstre av chemokin reseptor uttrykk involvert i tumorprogresjon. I tillegg er det langsomt forsterkende ekspresjon av CCR4 i premaligne vev, skjønt statistisk ubetydelig høyere enn i tumor tilstøtende normale vev, foreslo at CCR4 kan også delta i preneoplastiske stadier av tidlig tumorutvikling.

i vår tidligere studie fant vi at CCR4 ble overuttrykt i GC vev, men vi fant ikke signifikante forskjeller mellom pasienter med og uten lymfeknutemetastase [18]. Derfor hypotese vi at kjemokinreseptorer kan også spille en viktig rolle i kreftutvikling av pN0 pasienter. I denne studien, våre resultater viser en positiv sammenheng mellom CCR4 uttrykk og T-stadium, noe som var i samsvar med våre immunhistokjemi funn som CCR4 uttrykk tendens til å øke etter hvert som dybden av tumorinvasjon kommet. Effekten av CCR4 på magekreft celle invasjon ble delvis bekreftet av Transwell celleinvasjons analyser. Disse analyser ble utført under betingelser hvor det ikke eksogent CCR4 reseptor-ligand ble tilsatt. Det var mulig at forskjellige mekanismer kan finnes for å regulere tumorcelle-invasjon mediert av CCR4 i en ligand-uavhengig måte, i samsvar med fenomenet cytoplasmatiske mønster av CCR4 som var relatert til det meget inngripende oppførselen til tumorceller i GC vev. Vi har bekreftet at over-ekspresjon av CCR4 var nært knyttet til en høyere grad av tumor invasivitet og indikerer således at CCR4 over-ekspresjon kan gi metastatiske potensiale i GC-celler og ytterligere fremme tumorprogresjon. Vi antok også at autokrine CCR4 ligander ble også involvert i cellemotilitet in vitro
. Konsentrasjonene av CCL22 i kultur- supernatanten GC-cellelinjer transfektert med eller uten CCR4 var ganske lav som vi undersøkt (data ikke vist). Men muligheten kan ikke utelukkes at autokrint eller parakrint produksjon av CCL22 kan bidra til tumorinvasjon via CCL22 /CCR4 aksen in vivo
. CCL17 og CCL22, som høy affinitet CCR4 ligander, er produsert ved GC og andre kreft vev. Spesielt, CCL22, som fremstilles enten av kreftceller eller tumorassosierte makrofager, har blitt rapportert å være involvert i metastasen av flere typer kreft [15-17]. Dette antyder en mulig autokrint /parakrint sløyfe involverer CCL22 og CCR4 mellom ulike celletyper.

MMP-2 og MMP-9 er de mest berørte og godt karakteriserte MMP med sterk proteolytisk aktivitet i ekstracellulære matriks (ECM). Konsistens mellom sanntid RT-PCR tester og gelatin Zymografi eksperimenter viste tydelig at over-uttrykk for CCR4 i magekreftceller betydelig forbedret MMP-9 uttrykk og aktivitet. Disse eksperimentene ytterligere understreket og indikerte sin faktiske rolle i tumorinvasjon under visse betingelser, med eller uten stimulering av eksogene CCL22. Det antas at matrise MMP-9 degraderer type-IV-kollagen som er en viktig bestanddel av basalmembran og er relatert til cancercelleinvasjon og metastase hos pasienter med magekreft [34]. Her har vi gitt nye ledetråder om den underliggende mekanismen som CCR4 kan fremme magekreft celle invasjon av oppregulering av MMP-9. Lignende observasjoner er også gjort med hensyn til tumorinvasjon via noen kjemokin reseptorer så som CXCR4 og CCR7 [19, 20, 22]. Og MMP-2, hvis struktur var lik MMP-9, ble også rapportert å være assosiert med magekreft, [35]. Imidlertid fant vi MMP-9, men ikke MMP-2, var en viktig molekyl som er involvert i CCR4-mediert tumorinvasjon, noe som kan skyldes forskjellige co-regulatorer som interagerer med CCR4 i forskjellige mikromiljøer. Selv om MMP-2-ekspresjon i CCR4-transfekterte magecancerceller også ut til å være høyere enn det i mock-transfekterte celler, var forskjellen statistisk signifikant (data ikke vist). Celleviabilitet analyse viste at overekspresjon av CCR4 hadde ingen effekt på magekreft cellevekst in vitro
, som var i overensstemmelse med tidligere studier som viste CCR4 ligandene kunne ikke indusere celleproliferasjon [14], og dermed unngår muligens som kan påvirke invasjon indeks eller MMP-9 beløp. Disse analysene ble utført med eller uten eksogent CCL22, med betydelige forskjeller i MMP-9 uttrykk mellom CCR4 og mock transfekterte celler. Vi spekulere mulige mekanismer for økt MMP-9 uttrykk ved CCR4-overekspresjon kan være delvis på grunn av autokrint eller parakrint uttrykk for CCL22 in vivo
. Fremdeles andre MMP som kan være involvert i denne prosessen, og de nøyaktige signalveier forble å bli ytterligere utforsket i fremtiden.

I konklusjonen, vi rapporterte for første gang at CCR4 var abnormt over-uttrykt i pN0 magekreft og kan fremme tumorinvasjon. Videre våre data indikerte at CCR4-indusert produksjon av MMP-9 kan i det minste delvis ligger til grunn for den nye mekanismen for CCR4-mediert tumorinvasjon. Dermed kan antagonister av CCR4 være nyttige kandidater for å kontrollere tidlige hendelser i tumorprogresjon.

Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Overekspresjon av CCR4 hadde ingen effekt på magekreft cellevekst in vitro
.
Etter transfeksjon med CCR4 eller MOCK plasmid og stimulering med eller uten eksogent CCL22, SGC-7901 og BGC-823 celler ble reseeded i 96-brønns plate. Celler levedyktighet ble vurdert ved CCK8 analysen på angitte tidspunkter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0120059.s001 plakater (TIF)

• PLoS ONE: Overuttrykte av eukaryote Oversettelse Initiation Factor 5A2 (EIF5A2) korrelerer med Cell Aggressivitet og dårlig overlevelse i Gastric Cancer
• PLoS ONE: Survival of Riktig Lever Artery lymfeknutemetastase hos pasienter med magekreft: Konsekvenser for D2 Lymphadenectomy