Abstract
Carnosine, en naturlig forekommende dipeptide, har nylig blitt vist å ha anti-tumor aktivitet. Men den underliggende mekanisme uklart. I denne studien undersøkte vi effekten og mekanismen for karnosin på cellelevedyktigheten og proliferasjon av dyrkede humane magekreft SGC-7901-celler. Carnosine behandling fremkalte ikke celle apoptose eller nekrose, men redusert proliferativ kapasitet på SGC-7901 celler. Seahorse analyse viste SGC-7901 celler dyrket med pyruvat har aktiv mitokondriene, og er avhengig av mitokondrie oksidativ fosforylering mer enn glykolyse vei for generering av ATP. Karnosin markert redusert absoluttverdien av mitokondrial ATP-linked åndedrett, og redusert maksimalt oksygenforbruk og reserveluftkapasitet, som kan redusere mitokondriefunksjon korrelert med proliferativ potensial. Samtidig Carnosine også redusert ekstracellulært forsuring hastighet og glykolyse av SGC-7901 celler. Våre resultater antydet at Carnosine er en potensiell regulator av energi metabolisme av SGC-7901 celler både i anaerob og aerobic trasé, og gitt en ledetråd for preklinisk og klinisk evaluering av Carnosine for magekreft terapi
Citation. Shen Y, Yang J, Li J, Shi X, Ouyang L, Tian Y, et al. (2014) Carnosine Hemmer spredning av menneskelige magekreft SGC-7901 Cells gjennom Begge de mitokondrie respirasjon og glykolyse Pathways. PLoS ONE 9 (8): e104632. doi: 10,1371 /journal.pone.0104632
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 14 februar 2014; Godkjent: 15 juli 2014; Publisert: 12. august 2014
Copyright: © 2014 Shen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (81102427), og delvis støttet av Zhejiang Provincial vitenskapelige Foundations (Y2110322), Program for Zhejiang ledende team of S & T innovasjon (2010R50048) og Wenzhou Science and Technology Project (2010S0094 ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de mest vanlige ondartede sykdommer i verden. I de økonomisk utviklingsland, er magekreft den andre årsak til kreft-relaterte dødsfall [1], [2]. Til tross for den forbedring i kirurgisk og multimodal terapi, er den samlede 5 års overlevelse fremdeles lav (15% til 35%) på grunn av de høye gjentakelse priser, invasjon og metastase [3]. Derfor, i dag, for å finne mer effektive anti-tumor legemidler med færre bivirkninger er nødvendig.
L-Carnosine (β-alanyl-L-histidin) er en naturlig forekommende dipeptide som er syntetisert av endogen Carnosine syntetase. Det er vidt fordelt i hjernen hos pattedyr, skjelettmuskel, magesekk, nyrer, hjerte og hud [4], [5]. Så langt har ikke mye er kjent om dets fysiologiske funksjon, men flere mulige roller har vært vurdert, slik som nevrotransmitter, anti-inflammatorisk middel, frie radikaler, mobilt organisk pH-buffer og metallchelator [6], [7]. Det har blitt rapportert at karnosin er en potensiell terapeutisk middel for behandling av Alzheimers sykdom, slag, diabetes og andre sykdommer i sanseorganene [8], [9]. Bare nylig, ble det vist at karnosin kan også ha en anti-tumorigen effekter. For eksempel har karnosin blitt rapportert å ha evnen til å hemme ondartet gliom vekst [10], og denne effekten kan være mediert av en innflytelse på glykolytisk energimetabolismen, er det brukt karakterisert metabolske fenotypen observert i tumorceller, kjent som Warburg effekt [11 ], [12].
Nylig, har betydningen av mitokondrier som oksygen sensorer samt produsenter av ATP blitt et samlingspunkt for kreftforskning, og studier har vist et viktig fenomen som mitokondrie metabolisme, spesielt sitronsyre syklus aktivitet er viktig for rask spredning av flere cancercelletyper [13], [14]. Imidlertid, i tilfelle av humane magecancerceller, er lite informasjon tilgjengelig i hvilken grad glykolyse og mitokondriell oksidativ fosforylering (OXPHOS) bidrar til den cellulære energiproduksjon og hurtig spredning. Hvorvidt karnosin kan også hemme veksten av humane magecancerceller er ukjent. Og om den hemmende effekten av Carnosine på kreftcellene vekst er også knyttet til sin handling på mitokondrie respirasjon og OXPHOS er fortsatt uklart.
Nylig, Seahorse Biovitenskap XF96 ekstracellulær Flux Analyzer har blitt brukt til samtidig og kontinuerlig overvåke både aerobic og glykolytiske komponenter i celle bioenergi [15]. Derfor, i denne studien, utforsket vi effektene av Carnosine på veksten av menneskelige mage kreftceller og for ytterligere å karakterisere bioenergetisk profilen til cultured human magekreft celle SGC-7901 og rollene til Carnosine i SGC-7901 celler energiomsetningen med Seahorse Biovitenskap XF96 ekstracellulær Flux Analyzer og andre relaterte teknologier.
Materialer og metoder
Reagenser
L-Carnosine, natrium pyruvat, rotenon, karbonyl cyanid p-trifluormetoksyfenylamidoksim-hydrazone (FCCP), antimycin A, 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetra-tetrazoliumsaltet-bromid (MTT), metanol, melkesyre var fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Penicillin, streptomycin, L-glutamin, trypsin, Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), føtalt bovint serum var fra GIBCO-BRL (Grand Island, NY, USA). Annexin V-FITC /PI apoptose deteksjon kit, BCA Protein Assay Kit og ATP Assay Kit ble kjøpt fra Beyotime Institutt for bioteknologi ((Nanjing, Kina). XF analysemedium og XF kalibreringsløsning ble kjøpt fra Seahorse Bioscience.
menneskelig magekreft cellelinje SGC-7901 (SGC-7901), human lever leverkreft cellelinje (HepG2) og rotte C6 glioma cellelinje (C6) ble kjøpt fra Shanghai Institute cellen bank, Chinese Academy of Science (den opprinnelige kilden er American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, USA). Cellene ble dyrket i DMEM medium supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin, og holdt ved 37 ° C og 5% CO 2 i en fuktet inkubator. cellene ble trypsinert ved et forhold på 01:03 etter konfluens ved bruk av 0,25% trypsin. subdyrket celler ble sådd ut på 96-, 24- eller seks-brønns plater på tettheter av 2 × 10 3, 5 × 10 4, 2 × 10 5 eller 1 × 10 6 celler /brønn, henholdsvis. MTT-analysen reduksjon Cell metabolsk aktivitet ble overvåket ved kolorimetrisk MTT-assay som tidligere beskrevet [16]. I korthet ble cellene dyrket på 96-brønners plater, og det var 6 brønner i hver gruppe. På slutten av forsøkene ble cellene inkubert med 0,5 mg /ml MTT i 4 timer ved 37 ° C. Deretter ble supernatanten sjiktet fjernet, og 100 ul dimetylsulfoksid ble tilsatt til hver brønn. MTT metabolisme ble kvantifisert spektrofotometrisk ved 570 nm i en mikroplateleser Biorad. Resultatene ble uttrykt som prosentandelen av MTT-reduksjon, idet absorbansen kontrollceller som 100%. Celler ble sådd ut i seks-brønns plater ved tetthet på 100-200 celler per brønn, og deretter ble behandlet med karnosin (20 mM). Kloner ble tillatt å vokse i 14 dager i DMEM kulturmedium supplert med 10% FBS, 100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin. Celler ble deretter fiksert med 70% etanol og farget med Coomassie Brilliant Blue for analyse av kolonidannelse som tidligere beskrevet [17]. Celledød ble kvantifisert ved Annexin V-FITC-PI (propidiumjodid-) dobbel flekker, ved å bruke en Annexin V-FITC apoptose deteksjon kit i henhold til produsentens forslag. I korthet ble cellene sådd ut i 6-brønns plater i DMEM-medium. Celler ble behandlet med 20 mM karnosin i 48 timer, og deretter ble samlet og vasket to ganger i iskald PBS, resuspendert i bindingsbuffer ved en tetthet på 1 x 10 6 celler /ml. Celler ble inkubert samtidig med fluorescein-merket Annexin V og PI i 20 minutter og analysert ved strømningscytometri. Annexin V-FITC genererte signaler ble detektert med et FITC-signaldetektor (FL1, 525 nm). PI signaler ble overvåket ved hjelp av en detektor som er reservert for utslipp fykoerytrin (FL2, 575 nm). Data ble analysert ved hjelp av Cell quest programvare fra BD. For å måle oksygenforbruk rate (OCR) og ekstracellulære forsuring rate (ECAR) av celler i ulike forhold, en Seahorse XF96 ekstracellulære Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, Billerica, MA, USA) ble brukt. Dette instrumentet gir mulighet for sensitiv måling av glykolyse og flere parametere av mitokondriefunksjon, inkludert basal OCR, ekstra luftkapasitet, maksimal OCR, ATP bundet respirasjon og proton lekkasje fra heft intakte dyrkede celler. Etter grunnlinjemålinger ble OCR og ECAR målt etter sekvensiell tilsetning til hver brønn 20 pl oligomycin, FCCP og rotenon, for å nå arbeidskonsentrasjoner på 1 ug /ml, 1 uM og 1 jjM, respektivt. Alle analyser ble utført ved anvendelse av en seeding tetthet på 10000 celler /brønn i 200 ul DMEM i en XF96 cellekultur mikroplate (Seahorse Bioscience). Cellene ble byttet til ubufret DMEM supplert med 2 mM natriumpyruvat og 20 mM karnosin en time før starten av forsøket og holdt ved 37 ° C. OCR er rapportert i enheten av picomol per minutt og ECAR er rapportert i milli-pH-enheter (mph) per minutt. ATP-analysen ble utført i henhold til produsentens instruksjon. Kort beskrevet, ble høstet dyrkede celler lysert med en lyseringsbuffer, etterfulgt av sentrifugering ved 10.000 x g i 2 min, ved 4 ° C. Til slutt, i 6-brønners plater, ble nivået av ATP bestemmes ved å blande 20 ul av supernatanten med 100 ul av luciferase-reagens, som katalyseres lyset produksjon fra ATP og luciferin. Luminance ble målt av en monokromator mikroplateleser. Standardkurven ble også generert og proteinkonsentrasjonen i hver gruppe ble bestemt ved anvendelse av BCA-proteinanalysesettet. Total ATP-nivåer ble uttrykt som nmol /mg protein. Konsentrasjonen av melkesyre i den cellefrie supernatant ble målt ved hjelp av væskekromatografi (HPLC ) kombinert med en ultrafiolett-detektor ved hjelp av teknikken som er beskrevet tidligere. I korte trekk ble de preparerte analysates separert på Ecosil C-18 revers kolonne (3 mikrometer, 250 mm x 4,6 mm) med løsemiddel A og væske B [0,1 mol /l NH 4H 2PO 4 ( pH 3,4) fortynnet volum /volum i metanol 97:3] med en strømningshastighet på 0,5 ml /min. Temperaturen i kolonnen ble opprettholdt ved 25 ° C, og bølgelengden for UV-påvisning ble satt til 210 nm. Endringene i forhold mitokondriemembranpotensialet (Δ Ψ Absolutt mtDNA Kopier nummer ble målt ved å sammenligne PCR forsterkning av en mitokondriene fragment [menneske, NADH-ubiquinone oksidoreduktase kjeden 4 (ND4)] med en kjernefysisk amplicon (human, β-actin) fra DNA isolert ved hjelp av en Qiagen DNA mini kit. Primer sekvenser er som følger: human β-aktin (forover: 5'-ACCCACACTGTGCC CATCTAC-3 '; omvendt: 5'-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3'); menneskelig ND4 (frem: 5'-TCCTCCTATCCCTCAACCCC-3 '; omvendt: 5'-CACAATCTGATGTTTT GGTTAAAC-3'). DNA-templater ble fremstilt av områder som strekker seg over hvert fragment ved hjelp av PCR-amplifikasjon. Fortynninger fra 1 x 10 8 ned til 1 x 10 2 kopier av isolerte DNA ble brukt til å generere en standardkurve for kvantifisering. PCR veksling besto av et aktiveringstrinn ved 95 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av 40 sykluser på 5 sekunder ved 95 ° C og 30 sek ved 58 ° C. Alle PCR ble utført på en Bio-Rad CFX leder Real-Time PCR System (Applied biovitenskap). Alle data representerer tre eller flere uavhengige eksperimenter. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Statistiske analyser ble utført av SPSS 11.5 for Windows. Enveis ANOVA (analyse av varians), etterfulgt av LSD (minst signifikant forskjell) eller Dunnetts T3 post-hoc Resultater Effekt av Carnosine på SGC-7901 celler levedyktighet For å bestemme effekten av Carnosine på. human magekreft SGC-7901 celler levedyktighet, MTT reduksjon analysen ble brukt. Resultatene viste at karnosin behandling signifikant redusert cellelevedyktighet i en tids- og konsentrasjonsavhengig måte. Karnosin ved konsentrasjoner på 5 og 20 mM markert redusert cellelevedyktighet til 84,0% og 57,9% av kontrollen ved 24 timer, og til 73,5% og 45,9% av kontroll etter 48 timer, henholdsvis (fig. 1A). Imidlertid karnosin i en konsentrasjon på 1 mM påvirket ikke SGC-7901-celler levedyktigheten ved 24 eller 48 timer. Vi videre brukt flowcytometri for å analysere hvorvidt Carnosine kan føre til SGC-7901 celle nekrose eller apoptose. Overraskende nok viste resultatene at karnosin behandling i 48 timer, førte ikke til nekrotiske eller apoptotisk celledød i SGC-7901-celler (Fig. 1B). Fordi MTT reduksjon er også tolkes til å være en indikasjon på cellulær metabolsk aktivitet, og MTT-verdien av en cellepopulasjon er bestemt av både antallet levedyktige celler til stede og deres relative metabolske priser, slik at vi ved å beregne celletallet i et parallelt eksperiment med identisk behandlede SGC-7901 celler ved hjelp av celletelling plate. Vi har funnet at celletallet i karnosin behandlet i 48 timer gruppe var lik den i (fig. 1C) kontrollgruppe, og således indikerer at den reduserte cellelevedyktigheten indusert av karnosin behandling i 48 timer i SGC-7901-celler ble på grunn av metabolske forandringer men ikke på grunn av celledød eller celleproliferasjon. for å kontrollere om disse handlingene av Carnosine også finnes i andre kreftceller, HepG2 og C6 celler ble brukt. Resultatene viste at 20 mM karnosin behandling i 48 timer ikke indusere celledød (tabell. S1) eller proliferasjon, men kraftig redusert MTT-reduserende aktivitet både i HepG2 og C6-celler (Fig. S1). for å undersøke om choronic eksponering for Carnosine kan påvirke den proliferative kapasitet på SGC-7901 celler, ble cellene sådd ut ved en lav tetthet (100-200 celler /brønn) og anledning til å danne kolonier i 14 dager i DMEM supplert med 20 mM karnosin. Som vist på fig. 2, choronic eksponering for Carnosine redusert kolonier formasjon til 39,9% av kontroll. Vi undersøkte OCRs og ECAR i dyrkede SGC-7901 celler ved hjelp av en Seahorse XF-96 ekstracellulære fluks analysator, som tidligere beskrevet [18]. Basal cellular OCR og ECAR ble funnet å være 161,02 ± 29,58 pmol /min per 10 × 10 3 celler (initial legemer), og 39,31 ± 4,29 mph /min per 10 × 10 henholdsvis 3 celler (fig. 3A). ATP-bundet åndedrett (total basal minus den hastighet med oligomycin, hvor oligomycin er en inhibitor av ATP-syntese) var 96,15 ± 18,34 pmol /min per 10 x 10 3-celler, noe som indikerer at -60% av cellulær oksygen forbruket var relatert til ATP syntese. Samtidig ECAR ble øket til ~250% av grunnlinjen priser i nærvær av maksimal effektiv dose av oligomycin (1 pg /ml), noe som indikerer at cellene skiftet mitokondriell respirasjon til glykolyse. Rotenon (1 mm) redusert OCR til 55,78 ± 8,86 pmol /min per 10 × 10 3 celler (~35% av baseline priser). Den rotenon-resistent sats reflekterer ikke-mitokondrie respirasjon, som inkluderer underlaget oksidering og celleoverflaten oksygenforbruk [19]. Således utgjorde ikke-mitokondriell respirasjon for ~35%, mens mitokondriell respirasjon utgjorde ~65% av det totale cellulær respirasjon. Således, i dyrkede SGC-7901-celler ~92% (60% /65%) av mitokondriell respirasjon ble koblet til ATP-syntese, og ~8% av mitokondriell respirasjon ble redegjort for ved proton lekkasje (Fig. 3B). I nærvær av maksimal effektiv dose av FCCP (1 uM, en frakopling middel som tillater maksimal elektrontransport,), ble det observert en samtidig økning i OCR, og det ble økt til 204 ± 30,24 pmol /min per 10 x 10 3 celler. Vi vurderte også den relative bidraget fra glykolyse og OXPHOS i ATP produksjonsrate i SGC-7901 celler. Absolutte quantifications av både glycolytic hastighet og oligomycin sensitive oksygenforbruk hastighet ble målt i SGC-7901 celler. Det ekstracellulære surgjøring hastighet er hovedsakelig på grunn av laktat og bikarbonat produksjon og, når det er kalibrert som det protonproduksjonsrate, indikerer glykolytisk hastighet [15]. Således brukte vi oksamat å hemme laktat dehydrogenase, som konverterer pyruvat til laktat i løpet av det siste trinnet i glykolysen, for å beregne proton produksjonsmengden (fig. 3C). Det er en en-til-en forhold mellom laktatproduksjonshastigheten og ATP produksjonshastigheten fra glykolyse. Den oligomycin følsomme oksygenforbruk ble omdannet til ATP produksjon hastighet ved hjelp av et P /O-forhold på 2,3 [20]. Resultatene viste at SGC-7901-celler dyrket i DMEM (høy glukose) supplert med 2 mM pyruvat gjort minst 93% av deres ATP ved bruk av OXPHOS (Fig. 3D). Vi har undersøkt effekten av Carnosine på oksygenforbruk rente og ekstracellulære forsuring hastighet i dyrkede SGC-7901 celler. Resultatene i fig. 4 viste at behandling med 20 mM Carnosine for 48 timer redusert basal OCR og ECAR til 141,13 ± 27,06 pmol /min per 10 × 10 3 celler (~87% av kontroll), og 11,32 ± 2,49 mph /min per 10 x 10 3-celler (~27% av kontroll), henholdsvis (fig. 4A, B). ATP-linked åndedrett, proton lekkasje, og ikke-mitokondriell respirasjon var 81,03 ± 17,97, 7,15 ± 3,6 og 52,96 ± 8,40 pmol /min per 10 × 10 3 celler, henholdsvis (fig. 4C, D, E ). Dermed i karnosin behandlet SGC-7901-celler, utgjorde mitokondriell respirasjon for ~62% av den totale cellulær respirasjon, og ~92% (57% /62%) av mitokondriell respirasjon ble koblet til ATP-syntese, og ~8% av mitokondriell respirasjon ble utgjorde ved proton lekkasje. Derfor, redusert Carnosine behandling absoluttverdien av ATP-linked åndedrett, men det gjorde ikke påvirke den relative bidraget frekvensen av ATP-linked åndedrett, proton lekkasje, og ikke-mitokondriell respirasjon til total cellulær respirasjon. Videre fant vi også at Carnosine behandling markant redusert maksimal OCR og reserveluft kapasitet til 161,60 ± 28,46 pmol /min per 10 × 10 3 celler (~79% av kontroll) og 20,47 ± 6,92 pmol /min per 10 × 10 3-celler (~47% av kontroll) (fig. 4F, G). HepG2 og C6-celler ble også brukt for å ytterligere bekrefte effektene av karnosin på kreftceller energimetabolisme. Resultatene viste at 20 mM karnosin behandling i 48 timer markert redusert basal OCR og ECAR av HepG2 og C6-celler, respektivt. Karnosin tillegg også redusert ATP-bundet åndedrett i C6-celler, men ikke i HepG2-celler (Fig. S2). Imidlertid, 20 mM karnosin markert redusert det cellulære ATP-innholdet både i HepG2 og C6-celler, noe som indikerer at glykolyse inhibering var involvert i karnosin handling, i det minste i HepG2-celler (Fig. S2J). Fordi Carnosine er en mobil organisk pH buffer, den ekstracellulære forsuring rente analysert i nærvær av Carnosine bruker Seahorse XF96 ekstracellulær Flux Analyzer kan ikke gjenspeiler den reelle glykolyse rate. Så vi brukte også HPLC for å analysere den ekstracellulære melkesyre nivå for å kontrollere effekten av Carnosine på glykolyse i SGC-7901 celler. Våre resultater viste at karnosin behandling markert redusert den ekstracellulære melkesyre nivå til 84% av kontrollen (Fig. 5), som indikerer at karnosin har en potensiell inhiberende effekt på glykolyse i dyrkede SGC-7901-celler. Vi preges også effekten av Carnosine på endringer av ATP-innholdet og den relative bidraget fra glykolyse og OXPHOS til ATP kostnad i SGC-7901 celler dyrket i DMEM mangel på pyruvat. Vi målte cellulære ATP-konsentrasjonen i celler eksponert i 45 minutter til seks forhold: kjøretøyet, glykolyse inhibitor 2-DG, FCCP, rotenon, FCCP pluss rotenon, og 2-DG plus FCCP pluss rotenon. Vi fant at karnosin behandling i 48 timer betydelig redusert ATP-innholdet til 62% av kontrollen. 2-DG behandling merkbart redusert ATP-innhold med 48% og 34% i Carnosine fraværende og Carnosine nåværende gruppene sammenlignet med sine egne kjøretøygrupper, henholdsvis. FCCP og FCCP pluss rotenon hver også signifikant redusert ATP-innholdet med 15% og 18% i karnosin fraværende gruppe. Men disse stoffene påvirker ATP-innholdet i Carnosine stede gruppe. Rotenon påvirket ikke ATP-innholdet både i Carnosine fraværende eller tilstede grupper. 2-DG i kombinasjon med FCCP og rotenon i det vesentlige eliminert ATP-produksjon både i disse to gruppene (fig. 6). Dermed to-DG redusert ATP kreve mer enn FCCP eller rotenon gjorde både i Carnosine fraværende og presentere grupper. Disse dataene indikerer at ATP generasjonsskifter fra OXPHOS til glykolyse når mitokondriefunksjonen er nedsatt. ATP kostnad er ikke fullt ut opprettholdes etter hemming av enten glykolyse eller mitokondrienes funksjon i Carnosine fraværende gruppe, mens ATP kostnad opprettholdes etter hemming av mitokondrienes funksjon i Carnosine stede gruppe. Dermed endret Carnosine behandling den relative bidraget av OXPHOS og glykolyse i ATP produksjonsrate i SGC-7901 celler. for å undersøke hvorvidt å øke nivået av pyruvat kan reversere de inhiberende effekt av karnosin på mitokondriell respirasjon av SGC-7901-celler, ble cellene eksponert for forskjellige konsentrasjoner av pyruvat. Som vist i tabell. 1, øke nivået av pyruvat ikke kunne reversere inhiberende effekt av karnosin på SGC-7901-celler mitokondriell respirasjon. I tillegg MTT-analysen viste også at ved å øke nivået av pyruvat ikke kunne snu karnosin virkning på SGC-7901-celler mitokondriell metabolisme (fig. 7). Mitokondriell membranpotensialet (Δ Ψ For å løse tilsynelatende redusert mitokondrie respirasjon indusert av Carnosine, vi også kvantifisert den absolutte mitokondrie DNA (mtDNA) nummer, som er strengt regulert for å opprettholde cellulære energikrav [22]. Til vår overraskelse, resultatene viste at sammenlignet med kontrollceller, de absolutte mtDNA kopiere numre av Carnosine behandlet 7901 celler ble markert økt, og den gjennomsnittlige absolutte mtDNA kopiere tallene var 141,49 ± 7.42 i kontrollcellene og 360,0 ± 59,84 i Carnosine behandlede celler (fig. 8B). Diskusjoner Så vidt vi vet, er dette den første rapporten fra bioenergetisk profilen til dyrkede SGC-7901 celler behandlet med og uten Carnosine. Våre viktigste funnene er som følger. Først Carnosine redusert proliferativ kapasitet på SGC-7901 celler. For det andre celler dyrket i DMEM (høy glukose) supplert med 2 mM pyruvat laget ~93% av ATP ved hjelp OXPHOS. Tredje, Carnosine utøvde sin hemmende effekt på SGC-7901 celler spredning gjennom å hemme glykolyse, OXPHOS og mitokondrielle åndedrett av cellene, og disse handlingene av Carnosine ble også funnet i HepG2 og C6 celler. Dermed Carnosine bør vurderes sammen med den økende bevæpning av forbindelser i ulike stadier av narkotika utvikling som er rettet mot svulsten metabolisme, en av de viktigste kjennetegnene ved tumor [23]. På grunn av sitt brede spekter av aktivitet, Carnosine kan considerded som en terapeutisk faktor ved behandling av mange sykdommer. For eksempel har sink carnosin vært brukt for gastrisk helse og for tarmen reparasjon [24]. Nylig har studier viste transformerte celler har ikke vokse i MEM inneholdende høye konsentrasjoner av karnosin, og karnosin kan administreres som et medikament in vivo for å inhibere veksten av maligne celler [25]. Men det måtte bli spurt om Carnosine kan hindre vekst av menneskelige mage kreftceller i tillegg til ondartede celler som har blitt rapportert tidligere. I foreliggende studie har vi funnet at karnosin er også i stand til å hemme veksten av dyrkede SGC-7901-celler i en tids- og konsentrasjonsrelatert måte, og denne effekten ble ikke ledsaget av apoptose eller nekrose, men kan snarere skyldes redusert spredning. Men de detaljerte mekanismene bak hemmende effekt av Carnosine på SGC-7901 celler spredning er fortsatt uklart. Det er allment akseptert at metabolske endringer er en av kjennetegnene til kreft. Otto Warburg første beskrevet økt utnyttelse av anaerob metabolisme, i nærvær av tilstrekkelig oksygen ved kreftceller sammenlignet med deres normale motstykker: benevnes "Warburg-effekten" [26]. Men nylig har det blitt påpekt at molekylær målretting av OXPHOS kan ha effekt ved avansert melanom som har forhøyede nivåer av OXPHOS [14]. Dermed ulike typer svulster på sine ulike utviklingsstadier har sine egne metabolske egenskaper. Derfor er de terapeutiske strategier og mekanismer av forskjellige tumorer behandling basert på energisk metabolisme er forskjellige. I denne studien har vi først brukt en roman ekstracellulære flux teknologi for å vurdere flere parametre for mitokondriefunksjon og ekstracellulære forsuring hastighet parallelt med ATP konsentrasjon vilje til å utforske bioenergetisk karakterisering av menneskelige magekreft SGC-7901 celler. Vår Seahorse analyse viste SGC-7901 celler har aktiv mitokondriene, og er avhengig av mitokondrie OXPHOS flere enn glykolyse trasé for generering av ATP i kulturen tilstand med høy glukose og pyruvat, som tyder på at mitokondrie respirasjon kan være en potensiell terapeutisk mål i human magekreft. Men når cellene ble dyrket i DMEM mangel på pyruvat, de er avhengige av glykolyse mer enn det dyrket i DMEM som følger med 2 mM pyruvat, fordi inhibering av glykolyse av 2-DG som fører til et fall på -48 % cellulær ATP innhold. Dessuten, denne data tyder også på at SGC-7901 celler sannsynligvis mangler plastisitet i å bytte fra glykolysen til mitokondrie respirasjon når glycolytic ATP produksjonen er avskaffet i kulturen tilstand mangel på energi stoffer. På den annen side, Wu et al Bare nylig, ble det vist at Carnosine redusert spredning av malignt gliom med en innflytelse på glycolytic og ATP syntese [27]. I vår nåværende studie fant vi også at behandling med Carnosine var i stand til å redusere den ekstracellulære forsuring hastighet og melkesyre nivå, noe som indikerer at Carnosine har en hemmende effekt på glykolyse i SGC-7901 celler. Imidlertid, karnosin ikke fullt ut, men delvis hemmet glykolyse kapasitet av cellene, på grunn farmakologisk hemning av mitokondriell respirasjon av rotenon, eller frakoplet den mitokondrielle proton gradient fra ATP-produksjon ved FCCP, eller behandlet med rotenon og FCCP samtidig, cellene fortsatt var i stand å oppregulere glykolysen for å kompensere for ATP uttømming (fig. 6). Interessant, fant vi at Carnosine besitter også en roman rolle som regulator av mitokondriell respirasjon. Carnosine trykt basale nivåer mitokondriell respirasjon, og dette skyldes i hovedsak redusert ATP-linked respirasjon, noe som indikerer at mitokondrie ATP utgangs nedgang i Carnosine behandlet SGC-7901 celler.
kolonidannelse assay
Flowcytometriske Assay av celledød
ekstracellulær Flux Technology
Fastsettelse av ATP Produksjon
HPLC-analyse av ekstracellulær melkesyre
Mitokondriell membranpotensialet vurderings
m) ble vurdert ved hjelp av lipofile kationiske sonde JC-en 5,5 ', 6,6'-tetraklor-1,1', 3,3'-tetraetyl-benzamid azolocarbocyanine jodid (JC-1; molekylære prober). Fargestoffet JC-1 gjennomgår en reversibel endring i fluorescens utslipp fra grønn til grønn oransje som Δ Y
m øker. Celler med høy Δ Ψ
m skjema JC-1 aggregater og fluor rød; de med lav Δ Ψ
m inneholde monomere JC-1 og fluoresce grønt. Etter behandling med karnosin i 48 timer ble kulturmediet fjernet og cellene, dyrket på dekkglass, ble inkubert i mørket med JC-1 ved en sluttkonsentrasjon på 2 mM i 20 min. Cellene ble skylt med PBS to ganger og spent på 488 nm med et Olympus BX-51 fluorescens mikroskop.
MtDNA kopiantall måling
Statistical Analysis
test (hvor like varianser ikke ble antatt) ble påført for multiple sammenligninger, mens t-test var brukes til sammenligninger mellom to grupper. P
< 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
choronic behandlings med Carnosine hemmet SGC-7901 celler kolonier formasjon
bioenergetiske karakterisering av dyrkede SGC-7901 celler
carnosin endret bioenergetisk karakterisering av SGC- 7901 celler
carnosin redusert ekstracellulære melkesyre nivå i kultivert SGC-7901 celler
carnosin endret relative bidraget fra glykolyse og OXPHOS til ATP ladning i SGC-7901 celler dyrket i DMEM mangel på pyruvat
Effekt av pyruvat på hemmende virkning av Carnosine på SGC-7901 celler mitokondrienes funksjon
Effekter av karnosin på mitokondrie DNA-innhold og mitokondriemembranpotensialet i SGC-7901 celler
m) står for mesteparten av proton-drivkraft brukes til kjøring ATP syntese og har derfor en betydelig rolle i den maksimale ATP -generating kapasitet [21]. Derfor har vi også brukt den lipofile kationiske sonde JC-en til å utforske om Carnosine undertrykker OXPHOS via undertrykkelse av mitokondriemembranen potensial (Δ Ψ
m). Resultatene viste at Carnosine behandling i 48 timer ikke kan indusere en åpenbar endring av Δ Ψ
m i dyrkede SGC-7901-celler (fig. 8A).
. har rapportert at det var en effektiv kompenserende oppregulering av glykolyse etter administrasjon av oligomycin å blokkere oksidativ fosforylering, og denne reaksjon var i stand til å opprettholde ATP-nivået i de humane ikke-småcellet karsinom-cellelinjene H460 og A549 [15]. Våre resultater viste også at SGC-7901-celler har evnen til å øke glykolyse når mitokondriefunksjon er blokkert av oligomycin. I tillegg, når det mitokondriefunksjon ble undertrykt av rotenon, ble en effektiv kompenserende oppregulering av glykolyse accurred, og denne reaksjon var i stand til å opprettholde ATP-nivået i SGC-7901-celler. Men cellene kunne ikke oppregulere nok glykolysen kapasitet til å opprettholde ATP-nivå ved frakobling mitokondriell respirasjon fra ATP-syntese indusert av FCCP, (Fig. 6). Derfor SGC-7901 celler besitter betydelig glykolyse og mitokondriell respartion kapasitet, og det gjør cellene vokse under forskjellige forhold.
Hva kan gammel avføring fortelle oss om utviklingen av det menneskelige tarmmikrobiomet?
Eldre mikrobiotainformasjon representerer en viktig ressurs for å studere bakteriell evolusjon og utforske den biologiske spredningen av kroniske sykdommer gjennom historien. Et internasjonalt team
Tarmbakteriell profil kan forutsi tarmskader etter strålebehandling
Snarere som et fysisk fingeravtrykk, tarmmikrobielt mønster kan brukes til å identifisere visse sårbarheter hos pasienter som gjennomgår strålebehandling for prostata eller gynekologisk kreft, å forut
Mat påvirker selektivt tarmmikrober, finner studier
Mat kan spille en rolle i dannelsen av den mikrobielle floraen i tarmene hos mennesker. Dette har blitt vist gang på gang i flere studier og forskning. Nå har forskere fra San Diego State University v
