Stomach Health > magen Helse >  > Gastric Cancer > magekreft

PLoS ONE: Altered Expression of Hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1α) og Regulatory Gener i Gastric Cancer Tissues

Abstract

vevshypoksi induserer omprogrammering av cellemetabolismen og kan resultere i normal celle transformasjon og kreft progresjon. Hypoksi-induserbar faktor-1 alfa (HIF-1α), nøkkelen transkripsjonsfaktor, spiller en viktig rolle i magekreft utvikling og progresjon. Denne studien hadde som mål å undersøke den underliggende reguleringssignalveien i magekreft ved hjelp av magekreft vevsprøver. Integreringen av genuttrykk profil og transkripsjonsregulerende element database (TRED) ble forfulgt for å identifisere HIF-1α ↔ NFκB1 → BRCA1 → STAT3 ← STAT1 genet stier og deres regulerte gener. Dataene viste at det var 82 differensielt uttrykte gener som kan være regulert av disse fem transkripsjonsfaktorer i mage kreft vev og disse genene dannet 95 tereguleringer, hvorav sju gener (MMP1, TIMP1, TLR2, FCGR3A, IRF1, FAS, og TFF3 ) ble hub molekyler som er regulert i det minste ved to av disse fem transkripsjonsfaktorer samtidig og var assosiert med hypoksi, inflammasjon og immunlidelser. Real-Time PCR og Western blot viste økende av HIF-1α i mRNA og proteinnivåer samt TIMP1, TFF3 i mRNA nivåer i mage kreft vev. Dataene er den første studien som viser HIF-1a-regulert transkripsjonsfaktorer og tilhørende nettverks gener i magekreft. Videre studier med større utvalg og mer funksjonelle eksperimenter er nødvendig for å bekrefte disse data og deretter oversette til klinisk biomarkør oppdagelse og behandling strategi for magekreft

Citation. Wang J, Ni Z, Duan Z, Wang G Li F (2014) Altered uttrykk for Hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1α) og Regulatory Gener i Gastric Cancer vev. PLoS ONE 9 (6): e99835. doi: 10,1371 /journal.pone.0099835

Redaktør: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, USA

mottatt: 10 januar 2014; Godkjent: 19 mai 2014; Publisert: 13 juni 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (̭20108025 og̬71897), Specialized forskningsfond for doktorgradsutdanning av høyere utdanning i Kina (É10061120093), Kina Postdoktor Science Foundation (É10491311 ogÉ2T50285), grunnlaget for Jilin Provincial Health Department (É1Z049), Stiftelsen for Jilin-provinsen Science and Technology Department (É30522013JH ogÉ40414048GH) og Norman Bethune Program for Jilin University (É2219). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den fjerde vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i verden, noe som rammer ca 800.000 mennesker og 65.000 kreftrelaterte dødsfall årlig [1]. Tidligere studier har vist at avvikende cellenes stoffskifte er en viktig funksjon i løpet tumorigenesis og kreft progresjon [2], [3]. Spesielt, omprogrammering av energiomsetningen er tatt med som en voksende kjennetegn på kreft [4] og unormal energiomsetningen er synlig i ulike kreft hos mennesker, det vil si, vil kreftcellene omprogrammere sitt stoffskifte ved økning i glykolyse i stedet for mitokondriell oksidativ fosforylering å generere celle energi [5]. Vevshypoksi er en viktig drivkraft som fører til cellemetabolismen reprograming [6]. Under hypoksi miljø, er celle glykolyse induseres, og fører til økt celleproliferasjon og i sin tur danner en ond sirkel av hypoksi-spredning økende hypoksi som fremmer celletransformasjon og progresjon av kreft [7]. På gennivå, hypoksi-induserbar faktor-1 (HIF-1) er den primære oksygenfølsomme transkripsjonal aktivator og hjelper cellene for å tilpasse den lave oksygenspenning (hypoksi) [8]. HIF-1 er sammensatt av et konstitutivt uttrykt β-subenhet og en hypoksi-induserbar α-subenheten. Sistnevnte (HIF-1α) er kun stabilisert i henhold til hypoksiske betingelser og regulerer HIF-1 transkripsjonen aktivitet [9]. Til dags dato, er HIF-1α vist seg å aktivere flere mål gener som involverer i sentrale aspekter ved kreft biologi, inkludert erytropoiese, angiogenese, glukose metabolisme, celleproliferasjon /overlevelse og apoptose [10]. HIF-1α kan samhandle med ulike andre kreftrelaterte transkripsjonsfaktorer (TFS) og danner et kompleks TF-gentranskripsjon regulatoriske nettverk under kreftutvikling og progresjon. Således er en oppfatning ikke overraskende hevet at kreftcellene har differensial og patologiske transkripsjonsmønstre sammenlignet med normale celler [11]. Tidligere studier viste oppregulering av HIF-1α ekspresjon i magekreft vev og celler [12], [13], mens den nettopp liggende regulatoriske mekanismer gjenstår å bli definert. Derfor, i denne studien, vi utnyttet Affymatrix Exon Arrays å identifisere differensial genuttrykk profil i mage kreft vev, og utført real time PCR og Western blot analyser for å validere dataene. Vi videre konstruerte avvik TF-gentranskripsjon regulatoriske nettverk i forbindelse med HIF-1α uttrykk ved integrering av transkripsjonsregulerende element database (TRED) [14] og genuttrykk profil ved hjelp cytoscape programvare. Denne studien kan identifisere en systematisk utredning av de tilknyttede transkripsjons tereguleringer forbindelse med hypoksi og gi viktig informasjon for fremtidig biomarkører og romanen behandlingsstrategi for magekreft.

Diskusjon

Profilering av forskjellig Resultater og uttrykte gener i magekreft versus normalt vev

for å identifisere differensielt uttrykte gener i magekreft, vi utnyttet Affymatrix exon Arrays som inneholder 17.800 menneskelige gener å profilere fem par magekreft og normalt vev (pasientenes informasjon var viste i tabell S1). Vi fant til sammen 2546 differensielt uttrykte gener, hvorav 2422 ble oppregulert og 124 ble nedregulert (tabell S2). Nærmere bestemt, HIF-1α var signifikant høyt uttrykt i magekreft vev sammenlignet med de tilstøtende normale vev (p 0,01). Vi ytterligere validert microarray data ved å utføre kvantitativ real-time RT-PCR og Western blot i ytterligere 10 par av magekreft vs. normalt vev (pasientenes informasjon ble viste i tabell S1). Den HIF-1α mRNA uttrykk viste 2,55 ± 0.56 fold up-regulering i tumorvev vs. normale (p < 0,01); Western blot-analyse viste et klart skille mellom den relative protein tettheten av HIF-1α i kreftvev (0,41 ± 0,24) sammenlignet med normale (0,17 ± 0,15) med p < 0,01, kan resultatene ses på figur 1 og figur S1. Faktisk en tidligere studie viste at HIF-1α ble ubikvitært uttrykt i humane og musevev under hypoxi [15] og i magekreft vev [12], [13], overekspresjon av som ble assosiert med dårlig prognose av magekreftpasienter [12 ], [1. 3]. Dermed vi videre analysert HIF-1α overekspresjon-forbundet TFS og deres potensielle målgruppe gener i mage kreft vev.

Identifikasjon av HIF-1α overekspresjon-forbundet TFS og deres potensielle målgruppe gener i mage kreft vev

for å identifisere HIF-1α overekspresjon-forbundet TFS og deres potensielle målgruppe gener, transkripsjonsregulerende element database (TRED) gir et unikt verktøy for å analysere både cis
- og trans Z - regulatoriske elementer hos pattedyr, som bidrar til å bedre forstå de omfattende genet forskrifter og regulatoriske nettverk, spesielt på nivået av transkripsjons forskrifter. Dermed bruker integrering genuttrykk profil og forskrifter fra TRED, analyserte vi HIF-1α og fire andre HIF-1α-relaterte transkripsjonsfaktorer (dvs. NFκB1, BRCA1, STAT3, og STAT1) som var oppregulert i magekreft vev og funnet ut at de dannet disse TF-gennettverk med 82 gener, 79 av disse ble oppregulert og tre ble nedregulert (Tabell S3). Figur 2 viser den bi-klynger analyse av disse 82 differensielt uttrykte gener i mage kreft vev versus normalt vev.

Etter det ble Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery (DAVID) [16] søkt om funksjonell annotering av disse 82 differensielt uttrykte gener. Vi listet opp de fire sykdoms klasser som er forbundet med disse 82 avvikende gener (tabell 1), og fant at den viktigste klassen er kreft med 29 gener etterfulgt av infeksjon (18 gener), hjerte (25 gener) og immunsykdom (26 gener) .

Identifikasjon av magekreft relaterte transkripsjonsfaktor-genet (TF-genet) nettverk

Basert på transkripsjonen regulatorisk element database og genekspresjon profil, bygget vi transkripsjons regulatoriske nettverk knyttet til HIF- 1α ↔ NFκB1 → BRCA1 → STAT3 ← STAT1 med disse 82 gener i mage kreft vev. Våre data viser at disse 82 genene kan danne 95 forskjellige tereguleringer (figur 3A) og detaljert TF-genet tereguleringer informasjonen i Tabell S4.

For å bedre forstå regulatoriske nettverk, bygget vi en kort rammen av nettet (figur 3B). Transkripsjonsfaktorer HIF-1α ↔ NFκB1 → BRCA1 → STAT3 ← STAT1 var i stand til å danne rammen av regulatoriske nettverk der direkte regulert 21, 45, 2, 12 og 10 gener, henholdsvis. NFκB1 var direkte regulert av HIF-1α og det var sant at flertallet av de regulatoriske nettverk var direkte regulert av HIF-1α (21/82) og NFκB1 (45/82), de viktigste regulatorer knyttet til hypoksi og betennelse i kreft [ ,,,0],17]. Magekreft er karakterisert ved vevshypoksi og kronisk inflammasjon (for eksempel Helicobacter pylori-infeksjon
). I vår nåværende studie, HIF-1α var signifikant oppregulert i magekreft i forhold til de tilstøtende normalt vev (P < 0,01). Videre vår nåværende data viste at ekspresjon av mer enn 20 gener som er direkte regulert av HIF-1α ble endret i magekreft vev, inkludert NFκB1, nøkkelen regulator molekylet i betennelse og kreft [18] og målretting av NFkB kan være nyttige i chemoprevention av ulike kreft hos mennesker [19].

nedstrøms regulerings veien nettverket er i hovedsak regulert av STAT3 (12/82) og STAT1 (10/82), medlemmer av signal svinger og aktivator av transkripsjon familie ( statistikk). STATISTIKK signal med Jak er en kanonisk sti gener som er involvert i mange fysiologiske prosesser ved å overføre signaler fra cellemembranen til kjernen [20] for å regulere. For å regulere parakrint cytokin signalering og endringer i metastaser, utøver STAT3 både tumor indre og ytre effekter [21]. Målretting av Jak-STAT3 signalveien er ansett som en potensiell terapeutisk strategi, spesielt i sammenheng av tumor inflammasjon og immunitet [21]. Kontinuerlig deregulering av gener ved vedvarende aktivert NFkB og STAT3 i svulstens mikromiljø er to viktige aspekter for betennelse og ondartet progresjon [17]. En tidligere studie viste en samarbeid effekt av STAT3 og HIF-1α på aktivering av gener under hypoksi miljø i nyrecellekreft celler [22]. Den spesifikke mekanisme for Jak-STAT-aktivering, forblir særlig STAT3 i magekreft skal bestemmes, selv om vår nåværende data viste signifikant høyere nivå av JAK1, STAT3 og STAT1 ekspresjon i magekreft vev.

Funksjon analyse av navet -genes

En gitt transkripsjon faktor kan regulere dusinvis, om ikke hundrevis, av målgener, mens ett gen kan være regulert av flere forskjellige TFS i gennettverk. Dermed antok vi at hub gener reguleres av flere transkripsjonsfaktorer samtidig i magekreft, som kan ha synergieffekter på menneskers kreftutvikling. I denne studien har vi identifisert sju gener (inkludert MMP1, TIMP1, TLR2, FCGR3A, IRF1, FAS, og TFF3) som kan være direkte regulert av minst to viktige transkripsjonsfaktorer, de fleste av dem er hub noder som linking med NFκB1 og STATISTIKK pathway (figur 4). Siden transkripsjonsfaktorer regulerer målgener gjennom en transkripsjon-avhengig måte å modulere sin mRNA uttrykk, her utførte vi QRT-PCR for å undersøke uttrykk for TIMP1 og TFF3 mRNA, to målgener av HIF-a Den relative uttrykk for TIMP1 og TFF3 mRNA var 1,58 ± 0,25 og 2,16 ± 0.59 fold oppregulert i ti svulst vs. normalt vev, henholdsvis (figur 1).

i tillegg, familien til matriksmetalloproteinaser (MMP) er den viktigste ekstracellulære matrise ombygging enzymer, aktiviteten som er resultatet av interaksjonen mellom tumorceller og tumormikromiljø, og er strengt kontrollert av transkripsjonen aktivering, inkludert en kompleks proteolytisk kaskade aktivering så vel som endogent system av vev inhibitorer av metalloproteinaser (TIMPs) [23]. MMP1 har blitt rapportert å være involvert i magekreft celle invasjon [24]. Videre er TLR2 medlem av toll-like reseptorer og spiller en fundamental rolle i patogen anerkjennelse og aktivering av medfødt immunitet ved aktivering av NFkB. TLR2 kan fungere som en pådriver for å gi de infiserte eller skadde celler en ny sjanse til å utvikle seg til kreftceller og ukontrollert celledeling [25]. I mellomtiden faller Fc-fragment av IgG, lav affinitet IIIa-reseptoren (FCGR3A, også kjent som CD16a) til Fc-gamma-reseptor-familien (FCGR). FCGR3A
polymorfisme var forbundet med følsomhet for visse autoimmune sykdommer og FCGR3A har en viktig rolle i å fjerne immunkomplekser fra kropps og deltar også i cytotoksiske responser overfor svulstceller og infeksiøse agens [26]. Interferon regulerende faktor (IRF) -1 er også en immun aktivt molekyl og inflammatorisk prosess regulator, ble aktivering av IRF-1 og NF-kB funnet å være aktivert samtidig ved melanom [27]. I tillegg polymorfismer av trekløver faktor 3 ( TFF3
) promoter var assosiert med magekreft følsomhet [28] og TFF3 ble regulert av både HIF-1 og NFkB [29]. Overekspresjon av TFF3 var en selvstendig indikator for total overlevelse av magekreftpasienter [30]. Igjen, FAS (også kjent som TNFSF6 /CD95 /APO-1) tilhører tumor nekrose faktor reseptor super (del 6) og spiller en viktig rolle i reguleringen av ytre apoptose vei [31]. Redusert FAS uttrykket var forbundet med økt risiko for kreft ved nedregulering av FAS-mediert apoptose [32]. Men våre nåværende data viste en motstridende høyt uttrykk nivå av FAS i mage kreft vev annonsen videre studier er nødvendig for å bekrefte det. Samlet sett må endres uttrykket av disse genene i mage kreft vev ytterligere bekreftelse som biomarkører for magekreft diagnose og prognose. Disse genene er avgjørende i betennelser og immunrelaterte sykdommer, som kan videre vise til betydningen av Helicobacter
pylori infeksjon i magekreft utvikling og progresjon.

Materialer og metoder

Tissue eksemplarer

i alt 15 mage kreftpasienter ble rekruttert for kreft og fjernt normal samling vev fra det første sykehuset av Jilin universitet, Changchun, Kina. Denne studien ble godkjent av etikkomiteen av College for medisinske basalfag, Jilin universitet, ble hver pasient samtykket i et skriftlig informert samtykke skjema. Dataene ble analysert anonymt. Alle vev ble tatt fra kirurgi plass og hurtigfrosset og lagret i flytende nitrogen i løpet av 10 min etter reseksjon. Den TNM og histologiske klassifikasjon ble utført i henhold til Verdens helseorganisasjon (WHO) kriterier.

RNA isolering og microarray hybridisering og skanning

Tissue RNA ble isolert ved hjelp Trizol (Invitrogen, CA, USA) og ytterligere renset ved hjelp av RNeasy Mini kit (Qiagen, Düsseldorf, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA-konsentrasjonen ble deretter bestemt ved anvendelse av UV2800 ultrafiolett spektrofotometer (UNIC, NY, USA) med A260 /A280-forhold mellom 1.8~2.0 og RNA-konsentrasjonen ble variert fra 100 ng /pl til 1 pg /pl.

Genechip Humant exon 1.0 ST (Affymetrix, CA, USA) ble brukt til å profilere differensielt uttrykte gener i mage kreft vev kontra vanlig de i henhold til protokoll levert av Affymetrix (P /N 900223). I korthet, ble 1 pg RNA-templat som brukes til å reversely transkribert inn i cDNA og cDNA-prøver ble spaltet inn i cDNA-fragmenter med endonukleaser og deretter merket med DNA-merkingsreagens tilgjengelig fra Affymetrix. Etter dette ble de merkede cDNA-prøvene anvendt som prober for å hybridisere til oppstillings chips ved inkubering ved 45 ° C og rotert ved 60 rpm i 17 timer. Etter vasket og farget chips etter hybridisering ble flisen skannet ved hjelp av Genechip Scanner3000 med Genechip kjøreprogramvare (GCOS). Alle instrumenter, chips og reagenser ble alle kjøpt fra Affymetrix.

Analyse av forskjellig uttrykte gener i kreft versus normalt vev

Genechip kjøreprogramvare ble benyttet for å analysere chips og trekke ut de rå bildene signal data. Geo datasett av NCBI tiltredelse antall vår studie er: GSE56807. Råsignaldata ble deretter importert og analysert med Limma algoritme for å identifisere differensielt uttrykte gener. Den lineære modeller og empiriske Bayes metoder var å analysere dataene. Dette forhindret et gen med en meget liten ganger endring fra å bli bedømt som differensielt uttrykt bare på grunn av et uhell liten rest SD. De resulterende P-verdier ble justert ved å bruke BH FDR algoritmen. Gener som ble ansett å være signifikant forskjellig uttrykt hvis begge FDR verdiene var mindre enn 0,05 (kontrollere den forventede FDR til ikke mer enn 5%) og genekspresjon viste minst 2-fold endringer mellom kreft og deres tilsvarende normale vev med Log2FC > En eller log2FC < -1, P-verdi < 0,05.

kvantitativ real-time RT-PCR

For QRT-PCR-analyse, ble mindre enn fem mikrogram total RNA revers transkribert til cDNA med en st cDNA synthsis Kit (Takara Dalian, Kina); uttrykket av mRNA for human HIF-1α, TIMP1 og TFF3 ble undersøkt ved QRT-PCR med SYBR Premiks Ex Taq (Takara, Dalian, Kina) og Applied Biosystems 7300 Fast Real-Time PCR System. Den relative uttrykk for mRNA ble normalisert til p-aktin uttrykk ved å sammen Ct metode (2 -ΔΔCt, ΔCt = Ct target-Ct β-aktin, ΔΔCt = ΔCt tumor-ΔCt normal). Alle primere ble utformet med Primer Premier seks Software, ble primer sekvenser for forsterkning i Tabell 2. Data fra QRT-PCR ble analysert med GraphPad Prism versjon 5.0, ble forskjeller mellom gruppene statistisk evaluert av prøven ensidige t-test med p verdi < 0,05 anses som betydelig

Western blot analyse

Om en mm 3 av vevsprøver ble polert med flytende nitrogen og deretter homogenisert i cellelyse buffer (Beyotime, Kina) i. 4 ° C i 30 minutter, fjernes cellerester ved sentrifugering ved 10 000 rpm i 20 minutter i 4 ° C. Proteinkonsentrasjonen ble analysert ved hjelp av Bradford proteinanalyse (Bio-Rad, USA). Det hele proteinet ble separert med 10% SDS-PAGE og deretter overført til en PVDF-membran (0,45 um) i 2 timer. Etter 2 timer av blokkering med 5% melk i TBST, inkubert membranen med mus anti-HIF-1α (Santa Cruz, CA, USA) ved 1:200 fortynning og mus anti-β-aktin (proteintech, USA) ved 1: 2000 fortynning i 4 ° C i 12 timer, og etterfulgt av 2 timers inkubasjon med geite-anti-mus IgG (proteintech, USA) ved 1:2000 fortynning. Etter vask av TBST, oppdaget membran signaler ved hjelp av forbedret chemiluminescence ECL (Beyotime, Kina). Bilde J programvaren ble søkt om kvantitativ analyse av HIF-1α signalintensitet med normalisert med p-aktin nivåer. Data ble analysert med GraphPad Prism versjon 5.0, ble forskjeller mellom gruppene statistisk evaluert av prøven ensidige t-test med p-verdi < 0,05 anses som betydelig

Bygging av transkripsjonsfaktor genet nettverk basert på genuttrykk. profil og transkripsjonsregulerende element database

transkripsjonsfaktor (TF) genet nettverk ble konstruert basert på genuttrykk profil og transkripsjonsregulerende element database (TRED) ved hjelp cytoscape programvaren i henhold til regelverkets samhandling og differensial uttrykk verdiene for hver TF og genet. Nabomatrisen av TFS og gener ble gjort av attributtforhold blant alle gener og TFS. Ellipsen i TF-genet nettverk representert gener med rød (up-regulert) og grønn (nedregulert), trekanter representerer transkripsjonsfaktorer. Forholdet mellom TF og deres mål var representert med piler, retning av pilen var fra kilden til målet.

Analyse av sykdoms forbundet gener og gen sti merknad

Database for kommentering, Visualisering og integrert Discovery (DAVID) funksjonell annotering programvare ble brukt til å analysere den funksjonelle berikelse av avvikende gener. "GENETIC_ASSOCIATION_DB_DISEASE_CLASS" alternativet gitt informasjon om sykdommen foreningen anriking av gensamlingene. Vi valgte "GENETIC_ASSOCIATION_DB_DISEASE_CLASS" for å identifisere sykdom klasse berikelse og "KEGG_PATHWAY" for veien berikelse med Benjamini metode å bestemme betydelig berikelse score≥1.3.

Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Western blot analyse av HIF-1α i 10 par magekreft og normalt vev
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099835.s001 plakater (DOC)
Tabell S1.
Pasienter data
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099835.s002 plakater (DOC)
Tabell S2.
Oppsummering av 2546 differensielt uttrykte gener i mage kreft vev i forhold til de fjerne normalt vev. Genuttrykk nivåer i mage kreft vev kontra de fjerne normalt vev var minst to ganger annerledes med et p-verdi < 0,05
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099835.s003 plakater (XLSX)
Tabell S3.
Oppsummering av these82 differensielt uttrykte gener i TF-regulatoriske nettverk i mage kreft vev
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099835.s004 plakater (XLSX)
Tabell S4.
De 95 tereguleringer dannet av 82 differensial gener i TF-gennettverk. All regulering informasjonen ble hentet fra transkripsjonen regulatorisk element database (TRED)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099835.s005 plakater (XLSX)

Takk

Vi takker også den Medjaden Bioscience Limited (Hong Kong, Kina) for redigering og korrekturlesing dette manuskriptet.

Other Languages