PLoS ONE: mikroRNA-338 Hemmer vekst, invasjon og metastasering av magekreft ved Targeting NRP1 Expression

Abstract

NRP1 som multifunksjonelle ikke-tyrosin-kinase reseptorer spiller avgjørende roller i tumorprogresjon. MicroRNAs (mirnas) er en viktig klasse av gjennomtrengende gener som er involvert i en rekke biologiske funksjoner, spesielt kreft. Det er fortsatt uklart om mirnas kan regulere uttrykket av NRP1. Målet med denne studien var å identifisere mirnas som kan hemme vekst, invasjon og metastasering av magekreft ved å målrette NRP1 uttrykk. Vi fant ut at Mir-338 uttrykk ble redusert i mage kreft cellelinjer og i mage kreft vev. Videre fant vi at MIR-338 hemmet magekreft celle migrasjon, invasjon, spredning og fremmet apoptose ved å målrette NRP1 uttrykk. Som en oppstrøms regulator av NRP1, MIR-338 direkte rettet mot NRP1. Tvungen uttrykk for MIR-338 hemmet fosforylering av ERK1 /2, P38 MAPK og Akt; imidlertid, ble ekspresjonen av fosforylert ERK1 /2, p38 MAPK og Akt gjenopprettet ved overekspresjon av NRP1. I AGS celler infisert med MIR-338 eller transfektert med SiNRP1 ble protein nivåer av fibronektin, vimentin, N-cadherin og brev redusert, men et uttrykk for E-cadherin ble økt. Uttrykket av mesenchymale markører i MIR-338-uttrykker cellene ble restaurert til normale nivåer ved restaurering av NRP1 uttrykk. In vivo
, MIR-338 også redusert tumorvekst og undertrykte D-MVA ved å målrette NRP1. Derfor konkluderer vi at MIR-338 fungerer som en roman tumor suppressor genet i magekreft. MIR-338 kan redusere trekk, invasive, proliferative og apoptotiske atferd, samt magekreft EMT, ved å dempe uttrykket av NRP1

Citation. Peng Y, Liu YM, Li LC, Wang LL, Wu XL (2014) mikroRNA-338 Hemmer vekst, invasjon og metastasering av magekreft ved målretting NRP1 Expression. PLoS ONE 9 (4): e94422. doi: 10,1371 /journal.pone.0094422

Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, Taiwan

mottatt: 18 oktober 2013; Godkjent: 16 mars 2014; Publisert: 15 april 2014

Copyright: © 2014 Peng, et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av prosjektet of Science and Technology Committee i shapingba av Chongqing (201 302). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Neuropilins, inkludert neuropilin1 (NRP1) og neuropilin2 (NRP2), er multifunksjonelle ikke-tyrosin-kinase reseptorer som ble først identifisert basert på sine kritiske roller i å utvikle nervesystemet [1]. Nrp1 og Nrp2 har 44% homologi og deler mange strukturelle og biologiske egenskaper. NRP1 finnes hovedsakelig i bloodvesselendothelia, og NRP2 er hovedsakelig funnet i lymfekar [2], [3]. Påfølgende undersøkelser identifiserte NRP-en som en reseptor for vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) -A isoform VEGF-165 i begge endotelceller og noen tumorceller [4], [5]. Forskning har vist at NRP1 er oppregulert i flere krefttyper og uttrykkes på forskjellige kreft vasculatures [3], [6], som tyder på at NRP1 spiller en avgjørende rolle i tumorprogresjon. Tidlig forskning viste at NRP1 kan påvirke veksten av tumorer som en coreceptor av VEGFR [5]. Forskere fant senere ut at NRP1 kan øke tumorangiogenesis, akselerere tumorvekst og dempe svulst apoptose uten VEGFR [7]. NRP1 kan være en coreceptor av andre vekstfaktorer, som belyser hvorfor VEGF kan signalisere gjennom neuropilins i fravær av VEGFR-1 eller VEGFR-2 [8], [9]. Som et coreceptor av TβRI /TβRII kan NRP1 dempe svulst apoptose og akselerere tumorvekst via både kanoniske og ikke-kanoniske signal [10]. NRP1, som en coreceptor av PDGFR /cmet, kan øke tumorangiogenesis via P38MAPK og ERK-signalering [11].

oppstrøms regulatoriske gener av NRP1, de transkripsjonsfaktorer SP1 /3 og AP1 kan regulere ekspresjonen av NRP1 [ ,,,0],12]. Noe forskning har vist at butyrat undertrykker uttrykk for neuropilin jeg i kolorektal cellelinjer gjennom hemming av SP1 trans [13].

microRNAs (mirnas) er ikke-kodende RNA-molekyler ca 21-23 nukleotider i lengde som regulere genekspresjon på post-transcriptional nivå [14], [15], [16]. miRNA uttrykket profilering analyser har vist en global nedregulering av modent miRNA nivåer i primære, humane tumorer i forhold til normalt vev [17], [18]. Dermed kan mirnas fungere som tumor suppressors eller onkogener og feilregulert miRNA uttrykk kan bidra til tumorcelle metastase. Det er fortsatt uklart om mirnas kan regulere uttrykket av NRP1; Derfor ønsket vi å bestemme målet mirnas av NRP1. Andre funksjoner av NRP1 kan bli oppdaget ved å studere målet mirnas av NRP1.

Materialer og metoder

Menneske vevsprøver og cellelinjer

Denne studien benyttet friske vev, inkludert 41 menneskelige mage kreftprøver og 24 prøver av tilstøtende normale slimhinne vev avledet fra 41 pasienter som gjennomgikk kirurgi ved Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University mellom 2012 og 2013. Denne undersøkelsen ble gjennomført i henhold til "Biomedical forskning som omfatter mennesker Etikk omtale (foreløpig) 'regulering av Helsedepartementet og Helsinkideklarasjonen om etiske prinsipper for medisinsk forskning som omfatter mennesker. Alle prøvene ble oppnådd med informert samtykke fra pasientene og forsøkene ble godkjent av Institutional Review Board av den andre Affiliated Hospital of Chongqing Medical University. Alle deltakerne gitt skriftlig informert samtykke til å delta i denne studien

SGC-7901, HGC-27, AGS, MKN-45 og N87 cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC,. Manassas, VA , USA), og GES-en cellelinje ble kjøpt fra Type Culture Collection av den kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Cellelinjene ble dyrket i RPMI1640 (Hyclone, Logan USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og ble inkubert ved 37 ° C med 5% CO2.

Primers, RNA isolasjon og miRNA Detection

de primere for MIR-338-3p og U6 ble produsert ved hjelp av miScript Primer analysen kit (Qiagen Dusseldorf Tyskland). Sekvensene av mirnas brukt i denne studien var som følger: MIR-338-3p: UCCAGCAUC- AGUGAUUUUGUUG og U6: CGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGUGAA- GCGUUCCAUAUUUUU. Den reverse primere ble også anvendt i revers transkripsjonstrinn. Total miRNA ble ekstrahert fra dyrkede celler og prøver menneskelig vev ved hjelp RNAiso for små RNA (Takara Bio, Otsu, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. Poly-A-haler ble tilsatt til MIR-338 og U6 med miRNA reaksjonsbuffer Mix (Takara Bio), og deretter cDNA ble syntetisert fra 5 ng av total-RNA ved hjelp av miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix (Takara Bio). Real-time PCR ble utført i en CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) med SYBR Premiks Ex Taq II (Takara Bio). PCR-betingelsene var 95 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 30 sek. Dataene ble normalisert mot U6 snRNA. Etter amplifikasjon ble en smeltekurve analyse utført for å bekrefte spesifisiteten av produktene.

pcDNA ekspresjonsplasmider og Plasmid Transfeksjon

ORF Sekvensen av NRP1 ble amplifisert fra genomisk DNA isolert fra AGS cellen linje, og ORF-regionen til NRP1 cDNA ble deretter subklonet inn i GV230 vektor (GeneChem Corporation, Shanghai) sikret plasmid ble transfektert inn i AGS og MKN45 celler ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Twenty-fire timer etter transfeksjon, jo cellene ble anvendt for en rednings eksperiment. AGS celler som ble stabilt transfektert med NRP1 ble valgt å bruke 2 ug /ul puromycin (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Frankrike) 48 timer etter transfeksjon.

miRNA Gene Cloning og Ektopisk Expression

human MIR-338-genet ble PCR-amplifisert fra normal genomisk DNA og klonet inn i en vektor lentiviral. De lentiviruses ble generert av kotransfeksjon av HEK293T celler med plasmider PGC-LV, pHelper 1,0 og pHelper 2,0 ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Virus ble høstet 48 timer etter transfeksjon, og infeksjonene ble utført i nærvær av 2 mg /ml polybrene (GeneChem Corporation). Kontroll miRNA viruse ble kjøpt fra GeneChem Corporation (Shanghai, Kina). AGS celler som stabilt ble infisert med MIR-338 ble valgt ut ved hjelp av to ug /ul puromycin (Invitrogen) 48 timer etter infeksjonen.

Gene Expression knockdown av RNA-interferens

NRP1 uttrykk av AGS celler ble brakt til taushet ved trans følgende målrettede siRNA sekvenser (Sangon Biotech, Shanghai, Kina) med Lipofectamine 2000 (Invitrogen);
: agatcgacgttagctccaa;: aacacctagtggagtgata;: CAATCACGTGCAGGCTCAA (der ikke er angitt, ble siRNAbrukes). Kontroll sirnas (sic) ble generert ved å innføre 4 base erstatninger i NRP1 targeting sekvens (GATAGGTCATGACTGCCC). Førti-åtte timer etter transfeksjon ble NRP1 uttrykk undersøkt av immunoblotting.

luciferaserapportørplasmid analysen

En PsicheckTM-to Dual-Luciferase miRNA mål ekspresjonsvektor ble brukt for 3'UTR luciferasepreparater analyser (Sangon Biotech, Shanghai, Kina). Målet onkogen av miRNA-338 ble valgt på grunnlag av den elektroniske mikroRNA målet databasen http://www.microrna.org/microrna/home.do. Primersekvensene for villtype 3'UTR var som følger: fremover: 5'CCGCTCGAG CAAAGGAC- GGAAGTGGAAGG -3 'og omvendt 5'-ATTTGCGGCCGC GGAGTTCACAAGCACGAGG- TT-3'. Fordi det er to bindingssteder i NRP1 3'UTR, vi designet to primer sekvenser for mutant 3'UTR. For en mutant 3'UTR, primersekvensene var følgende: fremover: 5'GAAT- AATCAGGCATCTTTGTTGAGACCAAGTATGATT-3 'og omvendt: 5'GGTCTCAACAAAG- ATGCCTGATTATTCAAATGAAACC-3'. For det andre mutanten 3'UTR, primersekvensene var som følger: frem: 5'- GCGAAATCCAAGGCATCTTCACCAAGCGTATTCCGTGT-3 'og omvendt: 5'- GCTTGGTGAAGATGCCTTGGATTTCGCTCAGTTTCC-3'. For luciferase-assay ble brukt for å Lipofectamine 2000 cotransfect MKN45 celler med HSA-MIR-338 og PsicheckTM-2 Dual-Luciferase miRNA target ekspresjonsvektorer inneholdende villtype eller mutante målsekvenser. Den ildflue luciferase-aktiviteten ble målt ved anvendelse av den doble Luciferase Assay (Promega, Madison, WI, USA) 18 timer etter transfeksjon, og resultatene ble normalisert mot Renilla luciferase. Hver reporter plasmid ble transfektert minst tre ganger (på forskjellige dager), og hver prøve ble analysert i triplikat.

celleviabilitet og Clonability Assays

De transfekterte celler ble sådd i 96-brønners plater ved en tetthet på 1 x 10 ^{4 celler /brønn. En MTT-oppløsning (20 ul av 5 mg /ml MTT) ble tilsatt til kulturene (for et totalt volum på 200 ul) og inkubert i 4 hat 37 ° C. Etter fjerning av kulturmediet, ble de gjenværende krystaller ble oppløst i DMSO, og absorbansen ved 570 nm ble målt. For kolonidannelse analysen ble cellene sådd ut i en lav tetthet (1000 celler /skål) og fikk vokse til synlige kolonier ble vist. Cellene ble deretter farget med Giemsa, og koloniene ble tellet.}

migrering og invasjon Assays

For de transwell migrerings analysene, 10 x 10 ^{4 celler ble sådd ut i den øverste kammeret med en ikke-belagt membran (24-brønns innsats; 8 mm porestørrelse; BD Biosciences). For invasjonen analysene, 2 × 10 5 celler ble sådd ut i den øverste kammeret med en Matrigel belagt membran (24-brønnen insert, 8 mm porestørrelse, BD Biosciences). For begge analyser, ble cellene sådd ut i et serumfritt medium, og et medium supplert med 10% serum ble anvendt som en kjemoattraktant i det nedre kammer. Cellene ble inkubert i 16 timer ved 37 ° C og 5% CO2 i en vevskulturinkubator. Etter 16 timer ble de ikke-migrerte /ikke-invaderende celler fjernet fra de øvre sidene av transwell membranfilterinnsatser ved hjelp av bomullstupp spinner. De migrerte /invaderte celler på nedre side av innleggene ble farget med Giemsa, og cellene ble telt.}

Antistoffer

Antistoffer mot fibronectin, vimentin, N-cadherin, E-cadherin, SNAIL og GAPDH ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (CA, USA). Fosfor-ERK1 /2, fosfor-Akt, og fosfor-P38MAPK ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, UK), og total ERK1 /2, Akt, og P38MAPK var fra BD Biosciences (USA). Et antistoff mot NRP1 ble kjøpt fra R &D Systems (Minneapolis, MN, USA), og HRP (pepperrotperoksidase) -konjugert-IgG ble ervervet fra Santa Cruz Biotechnology geit-anti-mus-IgG og HRP-konjugert geite-anti-kanin

Immunoblotting

Totalt protein ble hentet fra de transfekterte cellene ved hjelp av RIPA lysebuffer (Beyotime, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter at hel-celle proteinekstrakter ble kvantifisert ved anvendelse av BCA proteinanalyse, ble ekvivalente mengder av cellelysater oppløses ved 10% SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese og ble overført til en polyvinylidenfluorid membran, som deretter ble blokkert i 5% fettfri melk i TBST i 1 time ved 4 ° C. Blottene ble deretter inkubert med primære antistoffer. Etter inkubasjon med HRP-konjugerte sekundære antistoffer, ble proteinbåndene visualisert ved hjelp av en forbedret kjemiluminescens-reagens (Millipore, Billerica, MA, USA). De følgende antistoff-fortynninger ble anvendt: anti-fibronektin, 1:200; anti-vimentin, anti-E-cadherin og anti-N-cadherin, 1:1200; anti-SNAIL og anti-GAPDH, 1:500; anti-fosfo-ERK1 /2, anti-fosfo-Akt, og anti-fosfo-P38MAPK, 1:2000; anti-NRP1, 1:600; anti-total ERK1 /2, anti-Akt, og anti-P38MAPK, 1:500; og HRP-konjugert IgG, 1:7000.

xenograft Eksperimenter

Mann atymiske nakne mus 6 til 8 ukers alder ble hentet fra Animal Experimental Center of Chongqing Medical University, og ble akklimatisert for 2 uker. Denne undersøkelsen ble gjennomført i henhold til anbefalingene fra Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i Chongqing Medical University. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av Chongqing Medical University. Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Like mange AGS celler (10 ^{6) med tvungen uttrykk for MIR-338 eller cont-Mir, med eller uten NRP1 restaurering, ble suspendert i 100 mL PBS og injisert subkutant i høyre bakre flanke av hver mus (10 mus pr gruppe) .Tumor veksten~~POS=HEADCOMP ble overvåket daglig i hver gruppe. Tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av formelen V = 1/2 x b2, der a er den lengste tumor-aksen, og b er den korteste tumor akse. Musene ble avlivet 5 uker senere, og tumorene ble delt i to deler. En del ble løst i formol for påfølgende immunhistokjemisk analyse, og den andre delen ble bevart i liquidnitrogen for western blotting eller QRT-PCR.}

Immunohistochemistry

Svulster bevart i formalin ble plassert i parafinblokker og seksjonert på positivt ladede objektglass. Seksjonene ble deparaffinized i xylen, hydrert i gradert alkohol, og forbehandlet for antigen gjenfinning i citratbuffer i 20 min i en 98 ° C dampskip (CD34 og NRP1). Seksjonene ble inkubert ved 4 ° C over natten med CD34 (1:200, Santa Cruz Biotechnology) og NRP1 (1:100 R &D Systems). Farging ble utført ved hjelp av ultra S-P Detection Kit (KIT-9720, Maixin, Fuzhou, Kina), og fargen ble utviklet ved hjelp av en DAB-kit (PW017, Sangon Biotech, Shanghai, Kina) .Subsequently, ble seksjonene kontra med hematoksylin. Glassene ble deretter farget med H &. E for å vurdere morfologi

Kvantifisering av Immunhistokjemisk Stain Intensitet

For å finne svulsten microvessel tetthet, fem tilfeldig utvalgte lysfelt mikroskopiske bilder (forstørrelses 40 ×; området 0,89 mm ^{2) per prøve ble oppnådd som beskrevet ovenfor, og de positivt fargede microvessels ble telt ved bruk av ImageJ program. Den røde kanalen, tilsvarende CD34 flekker, var isolert og digitalisert inn i et binært bilde, med svart indikerer farget fartøy og hvit indikerer ingen farging. Fartøy med lumen ble digitalt fylt, og en sammensatt D-MVA ble kvantifisert. Bruke ImageJ programmet, ble brun-farget bilder spesifikke for DAB farging hentet av en farge deconvolution makro. Alle de intensitetsverdier i samme gruppe ble midlet for å beregne forholdene mellom ulike grupper.}

Statistical Analysis

SPSS 17,0 programvare ble anvendt for statistisk analyse. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (S.D.). Gruppe sammenligninger ble utført ved anvendelse av Students t-test. Forskjeller ble betraktet som signifikant ved p. ≪ 0,05

Resultater

MIR Utvalg

For å bli inkludert i vår påfølgende analyse, protein målene for NRP1 måtte være concordantly spådd av minst tre av følgende fire prediksjon verktøy: Miranda (http://www.microrna.org), PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu/), TargetScan (http://genes.mit.edu/targetscan /index.html) og miRDB (mirdb.org/miRDB/). Basert på den opprinnelige versjonen januar 2012, fant vi 11 microRNAs som potensielt målrettede NRP1. Vi hadde tidligere identifiserte flere mirnas unormalt uttrykt i magekreft ved hjelp av et gen chip [19] (tabell 1). Basert på de to ovenfor, spådde vi en oppstrøms miRNA av NRP1: MIR-338

MIR-338 er nedregulert i Gastric Cancer vev og cellelinjer

For å utforske rollene til Mir. -338 i human magekreft utvikling, vi målte nivåene av uttrykk i 41 menneskelige magekreft prøver og 24 tilliggende normal slimhinne prøver. I henhold til en QRT-PCR-analyse, ble nivået av MIR-338 ekspresjon betydelig redusert i tumorvev sammenlignet med de tilstøtende normale slimhinne vev (Fig. 1A). I tillegg ble Mir-338 uttrykk redusert i mage kreft cellelinjer (SGC7901, HGC27, AGS, MKN45 og N87) sammenlignet med normal mageslimhinnen cellelinje (GES1) (figur 1B). Disse resultatene tyder på at Mir-338 er nedregulert i magekreftceller, et funn som kan være relevant for menneskers magekreft utvikling.

MIR-338 Direkte Targets onkogene NRP1

NRP1 har vært angitt å være et viktig molekyl som driver magekreft migrering og invasjon. Bruke prediksjon verktøy, spådde vi at målet miRNA av NRP1 var MIR-338. For ytterligere å bekrefte at MIR-338 direkte rettet mot onkogen NRP1, utførte vi luciferaserapportørplasmid analyser for å undersøke om MIR-338 samhandler direkte med sitt mål onkogene NRP1. Vi identifiserte to potensielle bindingssteder for MIR-338 på 3'UTR av NRP1 mRNA. For å avgjøre om NRP1 reguleres av MIR-338 gjennom direkte binding til 3'UTR av NRP1, bygget vi en rekke 3'UTR fragmenter, inkludert full lengde villtype NRP1 3'UTR, et bindingssete en mutant og en bindingssetet 2 mutant (fig. 2A). Disse fragmentene ble deretter satt inn i psiCHECK2 luciferase reporter plasmid. Vi fant at den ko-transfeksjon av MIR-338 og villtype-NRP1 3'UTR forårsaket en signifikant nedgang i luciferase-enheter sammenlignet med kontrollene. Men den kotransfeksjonen av MIR-338 og mutant NRP13'UTR ikke føre til en reduksjon i luciferase enheter (Fig. 2B). Disse resultatene tyder på at Mir-338 mål NRP1 direkte.

MIR-338 hemmer Gastric Cancer Cell migrasjon, invasjon og spredning og fremmer apoptose ved NRP1

For å undersøke den funksjonelle betydningen av MIR-338 overekspresjon i magekreft, infisert vi mage kreft cellelinjer AGS og MKN45 med LV-HSA-mir-338. Sammenlignet med uttrykk for cont-Mir, ble MIR-338 betydelig overexpressed i AGS og MKN45 cellelinjer etter infeksjon med LV-HSA-mir-338 (figur 3A). Vi fant også at sammenlignet med cont-Mir, uttrykk for NRP1 var signifikant nedregulert i AGS og MKN45 cellelinjer etter infeksjon med LV-HSA-mir-338 (figur 3B). Cellene med tvang uttrykk for MIR-338 viste signifikant redusert spredning sammenlignet med cellene med tvungen uttrykk for cont-MIR (Figur 3C). Mir-338-infiserte celler også utstilt redusert kolonidannelse egenskaper: antall foci i MIR-338-uttrykkende celler ble redusert sammenlignet med cont-MIR-infiserte celler (Figur 3D). Transwell migrasjon og Matrigel invasjonen analysene viste at MIR-338 betydelig redusert migrasjon og invasjon kapasiteten til AGS og MKN45 celler (Figur 3E). Den fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) analyse viste at de tvangs ekspresjon av MIR-338 fører til magekreft celle apoptose. Prosentandelen av det totale apoptotiske celler (tidlig apoptotisk + sent apoptotisk) signifikant økt med 11% i respons til MIR-338 overekspresjon sammenlignet med cont-Mir overekspresjon i AGS celler. En 10% økning i antall av apoptotiske celler ble observert i MKN45 celler med MIR-338-overekspresjon i forhold til forts-MIR (figur 3F). MIR-338 kan regulere uttrykk for NRP1 ved direkte hemme NRP1 avskrift eller andre indirekte kretser, slik at vi neste undersøkt om reduksjon av NRP1 uttrykk kunne forklare hemming av magekreft celle migrasjon, invasjon og spredning observert etter tvangs uttrykk for speil 338. Vi tvinges derfor uttrykk for MIR-338 i AGS cellene sammen med en konstruksjon som inneholder NRP1 kodende sekvens, men mangler 3'UTR av NRP1 mRNA. Som et resultat av denne konstruksjon ga en NRP1 mRNA som var resistent mot MIR-338. Vi fant ut at magekreft celle migrasjon, invasjon, spredning og apoptose ble restaurert i AGS cellelinje med tvungen Mir-338 uttrykk og NRP1 restaurering (figur 3G-3J). Disse resultatene viser at MIR-338 hemmer magekreft celle migrasjon, invasjon og spredning og fremmer apoptose ved å målrette NRP1.

Effekt av MIR-338 på signalveier i AGS Cells

Som en ikke- tyrosin-kinase-reseptor, kan NRP1 moderat øke ekspresjonen av fosforyleringen av ERK1 /2, Akt, og P38MAPK for å fremme tumorcelle-proliferasjon og metastase, såvel som for å dempe apoptose og immunresponser. Fordi NRP1 er et nedstrøms mål av MIR-338, antok vi at MIR-338 kan redusere uttrykket av fosforylering av ERK1 /2, Akt, og P38MAPK. Vi har funnet at de tvangs ekspresjon av MIR-338 hemmet fosforylering av ERK1 /2, men den relative ekspresjonsnivået av total ERK1 /2 ble ikke signifikant endret. MIR-338 kan også redusere fosforylering av p38 MAPK og Akt (figur 4A). MIR-338 kan binde 3'UTR av NRP1 mRNA å regulere fosforylering av ERK1 /2, Akt og P38MAPK; Men vi visste ikke om MIR-338 kan binde 3'UTRs av andre gener for å oppnå en lik effekt. Slik redning eksperiment ble utført, og gjenopprettelse av NRP1 ekspresjon ble bekreftet ved immunoblotanalyse (Fig 4B). Vi fant at fosforylering nivåer av ERK1 /2, Akt og P38MAPK ble ikke signifikant endret i AGS celler med tvungen Mir-338 uttrykk og NRP1 restaurering (fig 4C). Derfor konkluderer vi at MIR-338 regulerer fosforylering av ERK1 /2, P38 MAPK og Akt via NRP1.

MIR-338 Bestemmer Epitelial Phenotype av magekreft

EMT er en viktig mekanisme assosiert med kreft invasivitet og metastasering. Fenomenet EMT er definert som overgangen fra epitelceller til fibroblastoid- eller mesenkymale-lignende celler. EMT er preget av tapet av epiteliale markører og oppkjøpet av mesenchymale komponenter. E-cadherin, occludin og cytokeratin er nedregulert i løpet av EMT, mens N-cadherin, vimentin, fibronektin og brev er oppregulert. NRP1 forbedrer signalering via tre hovedveier som har vært knyttet til EMT, dvs., TGF-β, Hh og HGF /cMet. For å finne den rolle NRP1 i å opprettholde den mesenchymale fenotypen av gastriske celler, vi slått ned ekspresjonen av NRP1 av RNA interferens (RNAi) (Fig. 5A) og undersøkt ekspresjonen av mesenchymale markører slik som fibronectin, vimentin, N-cadherin og SNAIL, samt epithelial markør E-cadherin, i AGS-celler. Vi fant at uttrykket nivåer av fibronektin, vimentin, N-cadherin og brev ble redusert, men et uttrykk for E-cadherin ble økt i NRP1-utarmet tumorceller (Fig. 5B). Resultatet viser at NRP1 kan kjøre EMT prosess i magekreft. Fordi NRP1 er et nedstrøms mål av MIR-338, antok vi at MIR-338 kan bestemme epithelial fenotype av magekreft. For å avgjøre om de molekylære forandringer typisk for en redusert EMT skjedde i MIR-338-uttrykkende celler, undersøkte vi uttrykket av mesenchymale og epiteliale markører i AGS celler. Den immunoblot-analyse viste at uttrykket nivåer av fibronektin, vimentin, N-cadherin og brev ble redusert i AGS celler med tvungen ekspresjon av MIR-338. Videre er tvunget ekspresjon av MIR-338 økte ekspresjon av E-cadherin i AGS cellelinje, mens kontroll-infiserte celler forble E-cadherin negativ. Vi fant ut at MIR-338 regulert fosforylering av ERK1 /2, P38 MAPK og Akt via NRP1; Derfor var det nødvendig å fastslå om MIR-338 kan regulere EMT via NRP1. Den immunoblot-analyse viste at ekspresjonen av de ovennevnte mesenchymale markører i MIR-338-uttrykkende celler ble gjenopprettet til det normale nivå ved restaurering av NRP1 uttrykket (fig. 5C). Til sammen disse resultatene viste at MIR-338 kan hemme EMT via NRP1 i magekreftceller.

MIR-338 Reduserer tumorvekst og Undertrykker D-MVA ved målretting NRP1 In Vivo

Basert på de observerte nedgang i trekk, invasive og proliferativ atferd i AGS og MKN45 celler infisert med LV-HSA-mir-338, ved siden undersøkte vi rollen som MIR-338 i vekst in vivo. Vi subkutant inokulert hårløse mus med like tall (1 × 10 ^{6 celler per mus) av AGS celler med tvungen uttrykk for MIR-338 eller cont-Mir, med eller uten NRP1 restaurering. Tumor forekomsten ble vurdert to ganger i uken, og svulster dukket opp i alle mus. MIR-338 uttrykk i det nakne mus svulster ble målt ved hjelp av QRT-PCR, og vi fant ut at Mir-338 uttrykk betydelig økt i de svulster som overuttrykt MIR-338 (figur 6A). Den tvungne ekspresjon av MIR-338 signifikant hemmet tumorvekst in vivo, men overekspresjon av NRP1 kunne gjenopprette tumorvekst (figur 6B). Deretter undersøkte vi NRP1 uttrykk i det nakne mus svulster av western blot og immunhistokjemi. Vi fant ut at NRP1 uttrykk betydelig redusert i de svulster som overuttrykt MIR-338; ble imidlertid NRP1 uttrykk restaurert på svulster som overuttrykt NRP1 (figur 6C, 4D). Dermed inferred vi at MIR-338 hemmet tumorvekst ved å dempe NRP1 uttrykk in vivo. NRP1 kan øke tumorangiogenesis; derfor en hypotese vi at tvangs uttrykk for MIR-338 ville hemme tumorangiogenesis via NPR1. Immunhistokjemisk farging for CD34 ble anvendt for å vurdere antall og morfologiske karakteristika for blodkar i hver tumor. Fartøyene ble nummerert ved å telle antall konstruksjoner med diskret farging innenfor hvert felt uten hensyn til fartøyets størrelse eller åpenhet. Fartøyene i svulster som overuttrykt MIR-338 var subjektivt mindre enn forts-MIR-overekspresjon svulster; ble imidlertid antall fartøy restaurert på svulster som overuttrykt NRP1 (figur 6E). Det digitaliserte mikrovaskulær området (D-MVA) ble analysert for å innlemme fartøyets størrelse og åpenhet i vår analyse av tumorvaskulatur ved å tilveiebringe et estimat for det integrerte lumen området og antagelig blodstrømmen ortogonalt på tumor-delen. D-MVA ble redusert i Mir-338 overuttrykt svulster. Til vår overraskelse fant vi at NRP1-overuttrykt svulster gjorde ikke signifikant viser økt angiogenese, men reduksjonen i D-MVA grunn MIR-338 overekspresjon ble restaurert i svulster som overuttrykt NRP1 (figur 6F og 6G). Vi spekulerer i at NRP1 uttrykk var allerede oppregulert i magekreft, så videre uttrykt NRP1 kan ikke signifikant økning tumorvaskulatur men kan gjenopprette tumor blodkar som har blitt redusert med MIR-338. Resultatene indikerte at MIR-338 reduserer tumorvekst og undertrykker D-MVA ved å målrette NRP1 in vivo.}

Diskusjoner

Ved hjelp av genet chips og bioinformatikk, spådde vi at målet miRNA av NRP1 var MIR -338. Forskning har vist at uttrykket av MIR-338 varierer i ulike svulster. Huang XH et al. viste at MIR-338-3p trykt leveren kreft celle invasjon ved å målrette glattet [20]. Videre, i melanomer, MIR-193a, MIR-338, og MIR-565 ble vist å være underexpressed hos pasienter med BRAF mutasjon [21]. Fra disse dataene, utledet vi at MIR-338 kan fungere som en tumor suppressor. Det er ingen publiserte litteraturen om hvorvidt MIR-338 er underexpressed i magekreft. I vår studie, ble uttrykket nivåer av MIR-338 først målt i 41 menneskelige magekreft prøver og 24 prøver av tilstøtende normal slimhinne vev. Vi vurderte deretter uttrykk for MIR-338 i fem magekreft cellelinjer og i normale mageslimhinnen cellelinjer. Vi har funnet at ekspresjonen av MIR-338 ble nedregulert i både tumorvev og kreftcellelinjer. Videre kan uttrykt MIR-338 hemme magekreft celle migrasjon, invasjon og spredning, og fremme apoptose. I mellomtiden kan de tumorer kvaliteter bli fullstendig restaurert av NRP1 overekspresjon. I tillegg luciferase reporter-analyser antydet at MIR-338 mål NRP1 direkte. Dermed konkluderer vi med at Mir-338 fungerer som en potensiell tumor suppressor i magekreft, en funksjon som er oppnådd ved å dempe uttrykket av NRP1.

Som en ikke-tyrosin-kinase reseptoren, NRP1 kan moderat øke ekspresjon av fosforyleringen av ERK1 /2, Akt, og P38MAPK. M Akagi et al. funnet at inhibering av NRP-1 reduserte ekspresjonen av fosforyleringen av ERK1 /2, Akt, og P38MAPK [22]. I tillegg, har forskning vist at ekspresjonen av ERK1 /2-fosforylering ble oppregulert i NRP-1-celler som overuttrykker [23]. I denne studien fant vi at uttrykt MIR-338 kan redusere uttrykket av fosforylering av ERK1 /2, Akt, og P38MAPK, en effekt som ble snudd på NRP1 restaurering. Aktivering av ERK, Akt og P38MAPK i forbindelse med apoptoseresistens /celle overlevelse er blitt godt dokumentert i en rekke modellsystemer [24], [25], [26].

• PLoS ONE: Forholdet mellom P53 Status og Response to Kjemoterapi hos pasienter med magekreft: A Meta-Analysis
• PLoS ONE: Uttrykk for EGF familien i Gastric Cancer: nedregulering av HER4 og dens Aktivering Ligand NRG4