PLoS ONE: Uttrykk for EGF familien i Gastric Cancer: nedregulering av HER4 og dens Aktivering Ligand NRG4

Abstract

Magekreft er en viktig årsak til kreftrelaterte dødsfall i både menn og kvinner. Den epidermale vekstfaktorreseptorer er EGFR, HER2, HER3 og HER4. Av de fire epidermal vekstfaktor-reseptorer, EGFR og HER2 er velkjente onkogener er involvert i magekreft. Lite er imidlertid kjent om den rollen HER3 og HER4 i denne sykdommen. Vi innhentet paret prøver fra svulsten og tilstøtende normalt vev fra samme pasient som gjennomgår kirurgi for magekreft. Ved hjelp av RT-qPCR, kvantifisert vi mRNA ekspresjon av de fire reseptorer, inkludert de HER4 skjøte isoformene og alle ligander aktiverer disse reseptorer. Ved hjelp av immunhistokjemi, ble protein ekspresjonen av HER4 også kvantifisert. Vi fant at HER2 mRNA-ekspresjon ble oppregulert i tumorvevet i forhold til den samsvarende normale vev (p = 0,0520). Alle ligander med affinitet for EGFR ble oppregulert, mens ekspresjon av EGFR var uforandret. Interessant nok har vi funnet mRNA-ekspresjonen av HER4 (p = 0,0002) og dens ligand NRG4 (p = 0,0009) til å bli nedregulert i tumorvev sammenlignet med normalt vev matchet. HER4 nedregulering ble vist for alle de alternativt spleisede isoformer av denne reseptoren. Disse resultatene støtter involvering av EGFR og HER2 i magekreft og foreslå en interessant sammenslutning av redusert HER4 uttrykk med utvikling av magekreft

Citation. Nielsen TIL, Friis-Hansen L, Poulsen SS, Federspiel B, Sorensen BS (2014) uttrykk for EGF familien i Gastric Cancer: nedregulering av HER4 og dens Aktivering Ligand NRG4. PLoS ONE 9 (4): e94606. doi: 10,1371 /journal.pone.0094606

Redaktør: Rupesh Chaturvedi, Vanderbilt University School of Medicine, USA

mottatt: 08.07.2013; Godkjent: 19 mars 2014; Publisert: 11 april 2014

Copyright: © 2014 Nielsen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Danish Cancer Society # R2-A247-09-S2, dansk MRC #FSS 09072153. de bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:. den forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje største årsaken til kreft dødsfall hos menn og den femte største årsaken hos kvinner. Magekreft utgjorde ca 990 000 nye registrerte tilfeller og 738,000 dødsfall på verdensbasis i 2008 [1]. Infeksjon med Helicobacter pylori
, kosthold, røyking og alkoholbruk er viktige determinanter som påvirker risikoen for å få magekreft [2], [3].

epidermal vekstfaktor (EGF) familie er et komplekst nettverk av tyrosin-kinase-reseptorer og ligander som vekselvirker for å fremkalle forskjellige signalkaskader. Familien omfatter fire reseptorer EGFR (HER1), HER2 (ErbB2), HER3 (ErbB3), og HER4 (ErbB4) [4]. Ved alternativ spleising, er HER4 uttrykkes i en rekke isoformer. I juxtamembraneous område av HER4, inkludering av enten ekson 15b eller exon 16 resulterer i at jma eller JMB isoformer, henholdsvis [5] - [7]. Den jma isoformen og ikke den JMB isoformen kan behandles for å frigjøre et løselig HER4 intracellulært domene (ICD) som lokaliseres i cytoplasma, kjernen, og mitokondrier [8], [9]. Alternativ spleising i den cytoplasmatiske region av HER4 gir opphav til de CYT1 og CYT2 isoformer. Hopper av exon 26 resulterer i en reseptor (CYT2) mangler 16 av aminosyrene i full-lengde-reseptor (CYT1) [10].

Ligandene av EGF-familien er epidermal vekstfaktor (EGF), transformerende vekstfaktor-α (TGF-α), og amfiregulin (AR) som er spesifikke for EGFR; heparin-bindende EGF-lignende vekstfaktor (HB-EGF), betacellulin (BTC), og epiregulin (EPR) som binder både EGFR og HER4; neuregulin 1 (NRG1) og NRG2 som binder både HER3 og HER4; og endelig NRG3 og NRG4 som er spesifikke for HER4 [11]. Ved binding av et aktiverende ligand, reseptorene gjør homo- og hetero-dimerer. Sammensetningen av dimerisering partnere og aktiverende ligander bestemmer det signal som skal omformes inne i cellen [12], [13]. EGFR familien spiller ulike roller i vekst og vedlikehold av en rekke vev, blant annet ved å regulere celledeling, apoptose, differensiering og migrasjon. Deregulering av signalering fra dette systemet er koblet til utvikling og vekst av kreft [14] - [17]

EGFR og HER2 er kjente onkogener i magekreft [18], [19].. HER2 hemme antistoffet trastuzumab forbedrer vellykket prognose da lagt til kjemoterapi hos pasienter med HER2-positiv avansert magekreft [20]. En rekke kliniske studier har også blitt gjennomført for å teste brukbarheten av EGFR-hemmere i magekreft [21], [22]. HER3 og HER4 potensielt kan også være viktig i etiologien av magekreft; imidlertid informasjon om sine roller i denne sykdommen er sparsom. Faktisk, er lite kjent om uttrykket mønster av hele EGF system. På grunn av den interaktive karakter av EGF-reseptorer og ligander, avklaring av mekanismene for regulering av EGF familiemedlemmer krever vurderer alle reseptorer og deres ligander sammen.

For å undersøke uttrykk mønster av EGF-reseptorer og ligander i magekreft, fikk vi vev fra svulsten og tilstøtende normalt vev fra samme pasient som gjennomgår kirurgi for magekreft. Vi brukte paret vevsprøver for å sikre mot inter-individuell variasjon som finnes i referanse uttrykk for EGF system. Ved hjelp av RT-qPCR, kvantifisert vi mRNA uttrykk av de fire EGF reseptorer inkludert HER4 skjøte isoformer og ligander aktive disse reseptorene.

Materialer og metoder

Pasient utvalg og samling av biopsier

i denne kohortstudie, 38 pasienter som gjennomgår kirurgi for adenokarsinom i magen, spiserøret eller gastroøsofageal krysset ble fortløpende inkludert fra juli 2008 til november 2009. Alle individer gitt et informert skriftlig samtykke. Innsamling av biopsier ble godkjent av de regionale vitenskapelige etiske komiteer i Zealand, Danmark (journalnummer H-B-2008-049), og etablering av en biobank ble godkjent av det danske Datatilsynet (journalnummer 2008-41-2138). Biopsier ble tatt fra både tumorvev og tilstøtende normalt vev. Alle biopsiprøver ble anmeldt av en erfaren patolog for å validere diagnosen. Forhåndsdefinerte kliniske data ble hentet fra medisinske diagrammer og patologi rapporter. De kliniske kjennetegn ved pasientene er gitt i tabell 1.

RNA ekstraksjon

Biopsi ble plassert i RNA senere plakater (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) umiddelbart etter fjerning. RNA senere
ble fjernet før RNA isolering, og Trizol (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ble tilsatt. Vevsprøvene ble homogenisert på en Tissuelyser (Qiagen, Chatsworth, CA, USA). RNA fra vev ble isolert i henhold til fremstillingen protokoll for Trizol RNA-isolering (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). RNA-konsentrasjoner ble målt på en Nanodrop ND-1000 spektrofotometer. RNA kvalitet ble testet på en 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) i henhold til produksjon protokoll.

Omvendt transkripsjon kvantitativ polymerase chain reaction (RT-q-PCR)

cDNA ble syntetisert fra 1 ug total RNA ved hjelp av High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Den endelige reaksjonsblandingen ble fortynnet til et totalvolum på 200 pl

1 ul cDNA ble anvendt for qPCR ved hjelp av SYBR grønn Master mix (Roche, Basel, Sveits) på en Roche LightCycler 480 ved.: 95 ° C, 10 min; 50 sykluser av 95 ° C i 10 sek, spesifikk varmebehandlingstemperaturen i 10 sek, 72 ° C i 5 sekunder; 99 ° C i 1 sek; 59 ° C i 15 sekunder; 95 ° C i 1 sek; avkjøling til 40 ° C. Primer sekvenser og annealing temperaturer er gitt i tabell 2.

Genet best egnet for normalisering ble bestemt ved å anvende den Normfinder algoritmen [23] til de kvantifiserte konsentrasjoner av GAPDH, β-actin, YWHAZ, SDHA, og HMBS . SDHA viste seg å være den beste av de fem. To prøver ble ekskludert fra analysene grunnet ingen påvisning av mRNA fra noen av referanse gener.

Farging

Parafin-embedded vev fiksert i 4% bufret paraformaldehyde fra 13 representative pasienter ble undersøkt av immunhistokjemi ved hjelp av C-erbB-4 /HER-4, kanin polyklonale antistoff fortynnet 1/50 som det primære antistoff (RB-9045-P1, Thermo Scientific, Wilmington, dE, USA). For antigen innhentings snitt ble kokt i mikrobølgeovn i 10 mM citratbuffer, pH 6,0. Immunoreaksjonen ble visualisert ved hjelp av biotinylert geit-anti-kanin-antistoff fortynnet 1/200 (BA-1000, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), etterfulgt av en på forhånd dannet avidin og biotinylert pepperrotperoksydase makromolekylære kompleks (ABC) fortynnet 1/100 (Kode nr. PK-4000, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Reaksjonen ble utviklet ved bruk av 3,3 -diaminobenzidine og kontra ble utført med Mayers Hemalum. Som en negativ kontroll ble den samme fremgangsmåte utført uten noen primære antistoff.

Ved hjelp av Image Pro Plus (MediaCybernetics) fargeintensitet av representative bilder av tumor mot den omgivende slimhinne vev ble beregnet. To bilder av tumorprøve og to bilder av de omkringliggende slimhinnen ble tatt fra hver vevsprøve og gjennomsnittet av de to verdiene ble beregnet og benyttet for statistisk analyse og plotting. For noen eksempler, bare tumorvev eller bare normal slimhinne var til stede og ingen sammenligning av HER4 uttrykk var mulig for disse vev. Paret t-test ble benyttet for å bestemme om intensiteten av tumorvev var forskjellig fra intensiteten i slimhinnene vev.

Resultater

mRNA uttrykk av EGF-reseptorer i magekreft

RNA ekstrahert fra 38 svulster og matchet prøver fra tilstøtende normalt vev fra pasienter som gjennomgikk kirurgi for magekreft ble benyttet for RT-qPCR quantifications. MRNA-ekspresjon av de fire EGF-reseptorene EGFR, er HER2, HER3, HER4 og vist i figur 1. Interessant nok var det HER4-reseptoren utsettes for nedregulering i kreftvev i forhold til normalt vev (p = 0,0004). For HER2, så vi en oppregulering av denne reseptoren i kreftvev som var svært nær å bli signifikant (p = 0,0520). EGFR og HER3 mRNA uttrykk var un-endret i svulstene i forhold til normalt vev.

HER4 eksisterer som forskjellige alternativt spleisede isoformer. Den juxtamembranous regionen kan bestå av enten JMA eller JMB, og cytoplasmatiske region kan bestå av enten CYT1 eller CYT2. Den downregulation observert for total HER4 mRNA uttrykk i kreftvev brukes på alle fire varianter av reseptoren (figur 2).

For å bedre illustrere omfanget av HER4 nedregulering i svulstvev, vi plottet HER4 ned- eller oppregulering for hver enkelt pasient. Den HER4 mRNA-ekspresjon i tumorvevet minus HER4 mRNA-ekspresjon i den matchende normalt vev (ΔHER4) er vist i Figur 3. En verdi under 0 representerer en nedregulering. Denne figuren illustrerer tydelig at HER4 nedregulering er en meget generell mekanisme som foregår i de fleste pasientene, og uavhengig av tumorlokalisering.

mRNA-ekspresjon av EGF-familien ligandene i magekreft

TGF -α, amfiregulin, og EGF spesifikt binder EGFR. En ubetydelig mRNA-ekspresjonsnivået ble påvist for EGF i både tumor og normalt vev, og derfor er denne ligand ikke ble ansett for videre analyse. TGF-α og amfiregulin ble begge oppregulert i kreftvev i forhold til normalt vev (Figur 4a og b). HB-EGF, betacellulin, og epiregulin har affinitet for både EGFR og HER4, og alle disse ligander ble også oppregulert i kreftvev (figurene 4 c, d, og e). Til sammen viser dette at alle EGFR aktiverende ligander er oppregulert i svulstene.

Av de neuregulins, NRG1 og NRG2 bind både HER3 og HER4. Vi observerte ingen endring i uttrykk av enten α eller p-varianter av NRG1 og NRG2 (Tall 4F, G, H og jeg). NRG3 og NRG4 bare binde HER4. NRG3 ikke gjennomgå noen endring i uttrykket fra normal til kreftvev (figur 4j). Men NRG4 ble nedregulert i kreftvev i forhold til normalt vev (p = 0,0009) (figur 4k). Dette viser at både HER4 og dens spesifikke ligand NRG4 er nedregulert i magekreft.

For å bedre illustrere omfanget av NRG4 nedregulering i svulstvev, vi plottet NRG4 ned- eller oppregulering for hver enkelt pasient. Den NRG4 mRNA-ekspresjon i tumorvevet minus NRG4 mRNA-ekspresjon i den matchende normalt vev (ΔNRG4) er vist i figur 5.

i betraktning alle de pasientene som viser nedregulering av total HER4 i sin tumorvev, i 82% av disse NRG4 var også nedregulering og i 86% av en eller flere av de EGFR-delte ligander (HB-EGF, epiregulin, betacellulin) ble oppregulert. I 36% av pasientene med total HER4 downregulation, ble alle tre av EGFR delte ligander oppregulert.

Protein uttrykk for henne ved immunhistokjemi

På grunn av post-transkripsjons forskrifter, de mRNA uttrykk mønstre bestemt ved RT-qPCR kanskje ikke representere protein uttrykksmønster. For å sikre at den observerte nedgangen i HER4 mRNA uttrykk i kreftvev av pasienter med magekreft gjenspeiles også på proteinnivå, utførte vi immunhistokjemisk farging på formalinfiksert parafin-embedded vev fra alle pasienter inkludert i studien.

av en kvantifisering av HER4 fargeintensitet i representative områder av tumor- og det omkringliggende vev, har vi funnet at tumorvevet for å ha betydelig mindre HER4 fargeintensitet i forhold til det omgivende normal slimhinne (p = 0,0029) (figur 6) .

Representative mikrofotografier av stainings er presentert i figur 7. i den normale gastriske slimhinne var det en sterk HER4 immunoreaksjon (figur 7 a). Spesielt den basale delen av cytoplasma og den laterale cellemembranen av overflate epitelceller var sterkt immunreaktive for HER4 (figur 5b). Også i parietalcellene viste meget sterk HER4 immunoreaktivitet (figur 7 c og d). Submucosa og muskellagene var negative. I kjertelstrukturer spesielt parietalceller viste meget sterk HER4 immunoreaktivitets (Tall 7 c og d). Negative kontroller utføres uten primære antistoff resulterte i ingen flekker.

I mage kreft bare mindre områder med tumorceller hadde en positiv immunoreaksjon til HER4, og den negative svulstvev i grell kontrast til farget normal slimhinne i tilknytning til tumor (figur 7). I de sentrale delene av svulstvev nesten alle celler var helt negative bortsett fra små klynger av celler som kan ha hatt en tydelig membranfarging.

Diskusjoner

EGF familie består av et samspill nettverk av reseptorer og ligander som må tas i betraktning som en helhet for å forstå regulering av signalering i EGF-familien. Vi har fastslått regulering mønster av EGF-familien i tumorvev fra pasienter med magekreft, så vel som det tilpassede tilstøtende normalt vev fra samme pasient.

Vi fant aliserte potensialet av EGFR blir oppregulert i tumorvevet gjennom oppregulering av alle EGFR aktiverende ligander, og vi har også funnet oppregulering av HER2 i svulstvev som var svært nær å bli signifikant (p = 0,0520). Dette er i god overensstemmelse med eksisterende data som viser at både EGFR og HER2 er assosiert med dårlig prognose i magekreft [19]. Betydningen av HER2 i magekreft er demonstrert av det faktum at HER2 hemme antistoffet Herceptin er den eneste godkjente agent for målrettet behandling av magekreft [24].

For HER3 vi ikke observere noen expressional forskriften mRNA-nivå. Imidlertid har noen studier på HER3 i magekreft tilskrives en rolle for HER3 i magekreft. HER3 har vært assosiert med dårlig overlevelse, og positiv HER3 protein-ekspresjon ble påvist ved immunhistokjemi i 18,6% av magekreftprøvene sammenlignet med bare 2,0% av nontumorous prøvene [25] - [27]. Vi fant ikke høyere HER3 uttrykk i magekreft sammenlignet med normalt vev i vår studie. Men kanskje en forskjell i de metoder som brukes i studiene (immunhistokjemi vs RT-qPCR) står for noen av avvik i resultatene. I tillegg var vi i stand til å beskrive reguleringsmønsteret i hver pasient i stedet for i en pool av kreftpasienter og en pool av kontrollpersoner, og dette kan også utgjøre en forskjell i resultatene oppnådd i de to studiene.

Vi fant en markant nedregulering av både HER4 og dens aktiverende ligand NRG4 i svulstvev. Våre resultater er styrket av det faktum at vi også funnet en nedregulering når vi brukte flere metoder for å kvantifisere spesifikke isoformer av HER4. Ved hjelp av immunhistokjemi, fikk vi bekreftet at normal mage vev er positivt for HER4, mens kreftvev har svært lav eller ingen HER4 farging.

redusert uttrykk for HER4 mRNA uttrykk i svulstvev kan tilskrives en nedgang i antall celler som uttrykker HER4 eller til en reduksjon i HER4-ekspresjon i alle HER4 uttrykkende celler. Fra våre immunhistokjemiske stainings, vi observere at i de gastriske cancere bare små klynger med tumorceller hadde en positiv immunologisk reaksjon til HER4, mens det store flertallet av tumorceller var fullstendig negative. Dette indikerer at det er antallet celler som uttrykker HER4 som er redusert i tumorene. I motsetning til tumorvev, normalt vev hadde meget sterk immunreaksjoner til HER4. Interessant er det særlig mucus-produserende celler og saltsyre-produserende parietale celle som uttrykker HER4 protein.

Rollen av HER4 i kreftsykdommer er kontroversiell. I blærekreft, RT-qPCR kvantifisering av HER4 og dets ligander viser at HER4 er assosiert med bedre overlevelse. Spesielt er det co-ekspresjonen av HER4 sammen med dets spesifikke ligand, NRG4, sterkt korrelert med bedre overlevelse [28]. Likeledes er HER4 assosiert med bedre samlet og sykdomsfri overlevelse i livmorhalsen kreft [29]. I strupehodet plateepitelkarsinom, er HER4 tapt i sent stadium svulster [30], og HER4 er hovedsakelig funnet i lav-trinns og ikke-metastatisk xenografttumorer i bukspyttkjertelkreft [31].

På den annen side, HER4 protein uttrykk som bestemt ved immunohistokjemi har vært forbundet med distal metastase og en minsket overlevelse i orale squamous cell carcinoma [32]. I en studie av tykktarmskreft der protein uttrykk mønster ble også bestemt ved immunhistokjemi, tidlig stadium pasientene hadde en lavere andel av HER4 overekspresjon enn sent stadium pasienter [33]. I malignitet i sentralnervesystemet, HER4 besitter også en svulst fremmende rolle [34], [35].

Ikke mye er kjent om rollen HER4 i magekreft. Ingen HER4 mRNA ekspresjon ble påvist i to magekreft cellelinjer [36]. HER4 protein uttrykk som detektert ved immunohistokjemi er blitt funnet å korrelere med tidlig stadium, lavere grad, og fravær av lymfeknutemetastaser i magekreft [25]. Dette er i veldig god avtale med en annen studie som undersøkte genuttrykk profiler i langsiktige overlevende fra magekreft med spredning behandlet med kjemoterapi der forfatterne indikerte en mulig rolle HER4 oppregulering hos disse pasientene [37]. Sammen med våre nåværende resultater, disse dataene indikerer videre at HER4 signale har en beskyttende funksjon mot kreftutvikling i mage regionen. En studie fant HER4 genet som skal ofte forsterket i magekreft [38]. Men resultatene fra våre studier viser at dette ikke oversette til HER4 uttrykket nivået siden fant vi en nedregulering av HER4 mRNA og protein uttrykk snarere enn en oppregulering.

Selv om vi ikke finner uttrykk for EGFR som skal reguleres, blir signaleringspotensialet gjennom denne reseptoren økes ved oppregulering av alle sine ligander. Dette omfatter ligander delt med HER4: HB-EGF, betacellulin, og epiregulin. I tillegg til autokrin EGFR aktivering, oppregulering av disse ligandene potensielt resulterer i økt aktivitet av HER4. Aktivering av EGFR-reaksjonsveien er faktisk en måte for å få cellene til å bli stadig kreftfremkallende. Men tatt i betraktning HER4 å ha anti-kreftfremkallende funksjoner, vil en samtidig aktivering av denne reseptoren stanse proliferative fordelen av EGFR aktivering. Man kunne tenke seg at dette potensielle aktivering av HER4 unngås ved samtidig nedregulering av reseptoren og dens spesifikke ligand NRG4.

Hos pasienter med blærekreft, kan den kombinerte HER4 /NRG4 aliserte enhet være veksthemmende, og den co-uttrykk for HER4 sammen med NRG4 er svært korrelert til bedre overlevelse dersom de to proteinene opptrer sammen i stedet for individuelt [28].

Vi har også utført en analyse for å sammenligne HER4 uttrykk for pasientens overlevelse. Vi gjorde observere en trend mot høy HER4 uttrykk blir korrelert til en bedre overlevelse (resultater ikke vist), men på grunn av en begrensning i antall pasienter inkludert i studien, ble dette resultatet ikke funnet å være betydelig og videre studier vil ha for å klargjøre om en sammenheng mellom HER4 ekspresjon og overlevelse kan finnes i magekreft. En korrelasjon av ekspresjonsnivået av EGF-reseptorer i nærvær av lymfeknutemetastaser og tumor invasivitet viste bare HER2 for å korrelere inverst til disse parametre mens ingen korrelasjon ble funnet for de resterende EGF (resultater ikke vist).

i konklusjonen, tyder våre resultater en ny rolle for HER4 i magekreft. Interessant, fant vi både HER4 og dens spesifikke ligand NRG4 å bli nedregulert i kreftvev. Dette er ledsaget av en økt signale potensialet i EGFR gjennom oppregulering av alle sine ligander og en oppregulering av HER2.

• PLoS ONE: mikroRNA-338 Hemmer vekst, invasjon og metastasering av magekreft ved Targeting NRP1 Expression
• PLoS ONE: Samtidig Levering av doxorubicin og SATB1 shRNA av termo Magnetic kationiske liposomer for Gastric Cancer Therapy