PLoS ONE: Targeting cadherin-17 inaktiverer Ras /Raf /MEK /ERK alarm og hemmer celleproliferasjon i Gastric Cancer

Abstract

cadherin-17 (CDH17), ett medlem av 7D-cadherin super, ble overuttrykt i magekreft (GC) og ble assosiert med dårlig overlevelse, tumorresidiv, metastaser, og avansert tumor stadium. Så langt cellefunksjon og signalering mekanisme CDH17 i GC er fortsatt uklart. I denne studien vi viste at over 66% av GC-cellelinjer (20/30) var CDH17 positive. Tissue microarray (TMA) analyse viste at 73,6% kinesiske GC vev (159/216) var CDH17 positive, mens 37% respektive tilstøtende normalt vev var CDH17 positive. Knockdown av CDH17 hemmet celleproliferasjon, migrasjon, heft og kolonidannelse, og også induserte en cellesyklus og apoptose i AGS menneskelig GC celler. På den andre siden, overekspresjon av CDH17 lettes MGC-803 GC tumorvekst i nakne mus. Antistoff-matrise og Western blotting-analyse viste at knockdown av CDH17 i AGS-celler nedregulert integrin β serie proteiner, ytterligere inaktivert de Ras /Raf /MEK /ERK-reaksjonsveien, og førte til p53 og p21 akkumulering, noe som resulterte i inhibering proliferasjon, cellesyklus arrest og apoptose induksjon. Kollektivt, våre data for det første demonstrerer kapasiteten til CDH17 for å regulere aktiviteten av Ras /Raf /MEK /ERK-reaksjonsveien for celleproliferasjon i GC, og tyder på at CDH17 kan tjene som et attraktivt terapeutisk mål for videre forskning.

Citation: Lin Z, Zhang C, Zhang M, Xu D, Fang Y, Zhou Z, et al. (2014) Targeting cadherin-17 inaktiverer Ras /Raf /MEK /ERK alarm og hemmer celleproliferasjon i magekreft. PLoS ONE 9 (1): e85296. doi: 10,1371 /journal.pone.0085296

Redaktør: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Frankrike

mottatt: 10. juni, 2013, Godkjent: 26 november 2013; Publisert: 20 januar 2014

Copyright: © 2014 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere

Konkurrerende interesser: Alle forfatterne er ansatte eller tidligere ansatte i Roche R & D-senteret (Kina) unntatt Yanfen Fang, som er ansatt i East China Normal University, Shanghai, Kina.. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.

Innledning

Magekreft (GC) er rangert som den nest største årsaken til global kreftdødelighet og den fjerde vanligste kreftformen i verden [1], [2]. Median overlevelse av GC pasienter er 7~10 måneder. De fleste pasienter med GC stede med sent stadium sykdommen med en samlet 5-års overlevelse på ca 20% og objektiv responsrate til konvensjonell kjemoterapeutiske regimer utvalg kan forbedres fra 20% til 40% [1], [3]. Foreløpig er cisplatin-basert terapi fortsatt mye brukt i kliniske innstillinger for avansert og metastatisk GC. I tillegg, for HER2-neu overekspresjon mage adenokarsinomer, trastuzumab (Herceptin) i kombinasjon med kjemoterapi forlenger median total overlevelse fra 11,1 måneder (kjemoterapi alene) til 13,8 måneder [4]. Tatt i betraktning den høye dødeligheten av GC, er det fortsatt stort udekket medisinsk behov for å finne den følsomme og pålitelig biomarkør for tidlig diagnose av GC og potent terapeutisk mål for behandling av GC.

CDH17, ett medlem av 7D-cadherin super, presenterer i foster lever og mage-tarm under embryogenese, og dermed er også navngitt som lever og tarm cadherin (LI cadherin). CDH17 er overuttrykt i leverkreft [5], [6], magekreft [7], kreft i bukspyttkjertel ductal [8] og tykktarmskreft [9] - [11]. Som rapportert, CDH17 var hovedsakelig til stede på cellemembranen, og fraværende i normale mage vev og den positive hastigheten var nesten 78,4% [12]. Ekspresjonsnivået av CDH17 var karakteristisk for den avanserte gastrisk karsinom som var assosiert med dårlig prognose [13]; og det var også signifikant assosiert med den lymfeknutemetastase i magekreft [14]. Knockdown CDH17 med lentivirus-mediert miRNA inhiberte proliferasjonen, etterlevelse, tumorvekst og metastasering av BGC823 humane magecancerceller både in vitro og in vivo [15] - [17]. CDH17 har vært foreslått som et onkogen, og en nyttig markør for diagnose av magekreft [18]. Det er blitt påvist at CDH17 mediert onkogene signalisering i HCC har sammenheng med Wnt signalveien [5]. Nylig ble det rapportert at CDH17 indusert tumordannelse og lymfatiske metastaser i GC gjennom aktivering av NFkB signalveien [19]. CDH17 regulert α2β1 intealiserte til indusere bestemt brennvidde heft kinase og Ras-aktivering, noe som førte til økningen i celle adhesjon og spredning i tykktarm kreft celler [11]. Men den viktigste rollen og signalering mekanisme CDH17 i GC er fortsatt uklart. I denne studien, for å validere CDH17 som et potensielt terapeutisk mål for GC og å undersøke signal mekanismen for CDH17 i GC, karakterisert vi ekspresjonen av CDH17 i humane cellelinjer GC og GC kinesiske vev, kontrollert påvirkning av CDH17 knockdown eller over uttrykket på tumorigent og metastatisk effekt av GC cellelinjer, og utforsket de mulige signal kaskader knyttet til CDH17. Vi observerte en høy CDH17 uttrykk i humane GC cellelinjer og kinesiske GC vev, og en klar hemming i celle spredning, migrasjon, vedheft, kolonidannelse, apoptose induksjon, og cellesyklus arrest etter å kneble av CDH17 i humane GC cellelinjer. Videre viser våre resultater for det første kapasitet CDH17 for å regulere aktiviteten av integrin-Ras /Raf /MEK /ERK-reaksjonsveien for celleproliferasjon i GC, og tyder på at CDH17 kan tjene som et attraktivt terapeutisk mål for videre forskning.

Materialer og metoder

Etikk uttalelse

bruk og stell av forsøksdyr ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC), Roche R & D-senteret (Kina). De menneskelige GC vevsblokker med tilhørende tilstøtende vevsblokker ble hentet fra Shanghai biochip Company, en CRO service selskap. Alle menneskelige vev ble samlet inn med skriftlig samtykke fra kilde pasienter. Alle cellelinjer ble kjøpt fra ATCC, USA, japansk Innsamling av forsknings Bioressurser, og Shanghai Institute of Biochemistry og cellebiologi, Chinese Academy of Science.

Cellelinjer og reagenser

Alle cellelinjene fra amerikansk Typisk Cell Collection (ATCC), japansk Innsamling av forsknings Bioressurser, og Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, ble Chinese Academy of Science opprettholdt i respektive vekstmedium som ble anbefalt av leverandørene. PMD-18T-CDH17 plasmid var fra Sino Biological Inc. Tetracycline (Tet) var fra Sigma, Cell Counting Kit-8 var fra Dojindo Molecular Tech. Human plasma fibronektin var fra R &D Systems. Transwell kammeret var fra Corning (6,5 mm diameter, 8-um porestørrelse). CDH17 oligo siRNA var fra Genepharma Co. med sekvensen 5'AAGGCCAAGAACCGAGUCATT 3 '. Scram RNA-kontroll (Allstar®) var fra QIAGEN.

Tissue micro array immunhistokjemi

To hundre og seksten parafin innebygd magekreft vevsblokker sammen med tilsvarende tilstøtende vevsblokker (tilstøtende vev ble samplet minst 5 cm fra primærsvulster) ble samlet inn og avsatt av Shanghai biochip Company. Vev ble seksjonert og tilfeldig forberedt på 3 mikromatrise lysbilder. Alderen på pasientene var 32-84 år (median 65 år) med iscenesettelse fra 1A-4 i henhold til amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) retningslinjer ver.7. Alle sakene ble diagnostisert med to senior patologer med erfaren spesialist på magekreft patologi. Platene ble inkubert i blokkeringsserum i 20 minutter, deretter dekket med 100 ul anti-human-cadherin 17 affinitets-renset monoklonalt Ab, mus IgG (R &D MAB1032 1:2000 i TBS /T) ved 4 ° C over natten. Glassene ble dekket med 100 mL DAKO Envision + /HRP, Kanin /mus etter å ha blitt vasket grundig med TBS. Ett hundre mikroliter av substrat-kromogen oppløsning (DAB) ble påført på objektglassene og inkubert ved romtemperatur i 10 min. Stained lysbilder ble undersøkt mikroskopisk av to immunhistokjemi eksperter. Den normale mus IgG ble anvendt som en negativ kontroll. Farging ble ansett for å være negativ når ingen positiv cellemembranen farging kunne identifiseres og positiv når mer enn 10% av tumorceller viste cellemembran-positiv farging.

TR stabile cellelinjer

pLenti6 /TR-vektor (Invitrogen, Cat. No. V48020) og pLenti3.3 /TR-vektor (Invitrogen, Cat. No. A11114), ble anvendt for å generere stabile cellelinjer som konstitutivt uttrykker høye nivåer av Tet repressor. Disse ekspresjonsplasmider som inneholder elementer som tillater pakking av konstruksjonen inn i virioner og blasticidin eller geneticin resistens markør for seleksjon av stabilt transduserte cellelinjer. Kort, 293ft emballasje celler (Invitrogen, kat. Nr R700-07) ble transfektert med pLenti6 /TR eller pLenti3 /TR og ViraPower ^{TM Emballasje Mix (Invitrogen, kat. Nr K4975-00) for å produsere lentiviral partikler. Lentivirus ble anvendt til å transdusere AGS-celler eller MGC-803 og den blasticidin (8 ug /ml, Invitrogen, katalog nr. R210-01) eller geneticin (200 ng /ml, nr Invitrogen, cat. 10131-027) ble brukes til å velge for en stabil TR-uttrykke AGS celler kalt TR-AGS stabil cellelinje eller TR-uttrykker MGC-803 celler kalt TR-MGC-803 stabil cellelinje. Disse TR uttrykker cellelinjene ble brukt som verter for uttrykk konstruksjoner som letter Tet-regulert uttrykk for CDH17 shRNA (kort hårnål RNA) eller CDH17 genet, henholdsvis.}

Stabile AGS celler med Tet-regulert uttrykk shRNA av CDH17 genet

Fire miRNA oligonukleotider målretting CDH17 genet ([Homo sapiens] Gene ID: 1015) ble utviklet ved hjelp av en internett-applikasjon system (Invitrogen). Disse dobbelt-trådet DNA ble ligert inn i pcDNA6.2 ™ -GW /EmGFP-MIR ekspresjonssystem (Invitrogen, katalog nr. K4936-00) som deretter ble transient transfektert inn i AGS celler av Lipofectamine 2000 standard fremgangsmåter (Invitrogen, cat nr. 11668-027). Ifølge real-time PCR-analyse, sekvensen 90-2 (Forward primer: 5'-TGCTGTGTACTTCACACCAAACACTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAGTGTTTTGTGAAGTACA-3 '; Revers primer: 5'-CCTGTGTACTTCACAAAACACTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTAGTGTTTGGTGTGAAGTACAC-3') av miRNAs viste den høyeste effektivitet og ble valgt til per skjema BP rekombinasjon å skaffe pENTR-miRNA. Dette innlegget vektor ble så brukt i LR rekombinasjon med pLenti4 /TO /V5 (Invitrogen, kat. Nr K4920-00) for å få pLenti4 /TO /V5-miRNA lentivirus hjelp Gateway® teknologi (Invitrogen, Cat.No.12535-019 ). Lentivirus ble anvendt til å transdusere TR-stabile AGS-celler og 200 ug /ml Zeocin (Invitrogen, katalog nr. R250-05) ble anvendt for å selektere for en stabil Tet-regulerte CDH17 shRNA ekspresjons-celler kalt TR-AGS-CDH17_KD stabil celle linjen.

Stabile MGC-803 celler med Tet-regulert overekspresjon av CDH17 genet

i korthet ble CDH17 sekvensen amplifisert fra PMD-18T-CDH17 plasmid (Sino Biological Inc.) og subklonet inn IRES -EGFP vektor for å oppnå CDH17-IRES-EGFP ved bruk av primerne: forover primer: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCACCATGATACTTCAGGCCCATCTTCAC-3 '; Revers primer: 5'-TAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTCACCTTCTCAGAGGTTTGACTTCA-3 '). Denne konstruksjonen ble brukt til å utføre BP rekombinasjon å få pENTR-CDH17-IRES-EGFP. Deretter trer vektor og pLenti6.3 /TO /V5 (Invitrogen, kat. Nr V370-06) vektor ble brukt i LR rekombinasjon å få pLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP. Da lentivirus ble produsert for å omsette TR-MGC-803 stabile celler og 4 mikrogram /ml blasticidin ble brukt til å velge for en stabil Tet-regulerte CDH17 genuttrykk celler kalt TR-MGC-803-CDH17_Over stabil cellelinje.

celleproliferasjonsanalyse

for siRNA transient transfeksjon assays, ble cellene sådd ut i 10 cm plate med en tetthet på 5 x 10 ^{6 celler /skål og transfektert med 20 nM siCDH17 eller krafse siRNA. Etter 48 timer inkubering ble cellene tilknytningen og overført til 96-brønn plate med en tetthet på 3000 celler /brønn, og deretter inkubert i en annen 72 timer. Den cellenes levedyktighet ble analysert med CCK-8 kit (Donjindo, Japan). For TR-induserbar AGS-CDH17_KD stabile celler, ble cellene sådd ut i 60 mm x 15 mm skål og behandlet med eller uten Tet (0, 2,5 og 5,0 ug /ml) i forskjellig tid. Cellene ble høstet etter 2, 3, 4, 5 og 6 dager, og celletallet ble talt ved ScepterTM Håndholdt Automated Cell Counter (millipore). For spredning redning assay, ble TR-induserbare AGS-CDH17_KD stabile celler sådd ut i 60 mm x 15 mm skål og dyrket i 10 dager, med eller uten 5,0 ug /ml Tet. For redning gruppe, ble kulturmedium inneholdende Tet erstattet med friskt medium på dag 4, og cellene ble fortsatt dyrkes til dag 10. Cellene i hver gruppe ble høstet på dag 2, 4, 6, 8 og 10 for celle nummer telling og Western blotting-analyse.}

Cell migrasjon analysen

TR-AGS-CDH17_KD stabile celler ble sådd i 10 cm tallerken og behandlet med eller uten Tet (5 mikrogram /ml). Etter 120 timers dyrkning ble cellene samlet og tellet. 0,1 ml av cellesuspensjon (1, 2, 3 x 10 ^{4 celler /ml) ble tilsatt til det øvre rom av kammeret. 0,6 ml 10% FBS-medium ble tilsatt til det nedre rom som et lokkemiddel chemo. Etter 24 timers inkubering ved 37 ° C ble cellene fiksert med 90% EtOH ved 4 ° C i 30 min og deretter beiset med 0,1% krystallfiolett i 15 min. De ikke-migrerende celler ble fjernet fra den øvre flate av transwell membran med en bomullspinne. De fargede cellene ble deretter fotografert og tellet under lysmikroskopi.}

Cell vedheft analysen

TR-AGS-CDH17_KD stabile celler ble sådd i 10 cm tallerken og behandlet med eller uten Tet (5 mikrogram /ml). Pre-belegg på 96-brønners plater ble utført ved inkubering av brønnene med 25 ug /ml fibronektin ved 4 ° C over natten. For å redusere ikke-spesifikk binding, ble 1% bovint serumalbumin (BSA) tilsatt til hver brønn og inkubert i 60 minutter ved 37 ° C, ble BSA vasket to ganger med sterilt PBS. 120 timer etter knockdown CDH17 med Tet ble cellene oppsamlet og utsådd i pre-belagte 96-brønners plater med 4 x 10 ^{4 celler /brønn. 2 timer senere, ble ikke-adherente celler fjernet ved vasking med steril PBS for to ganger. De adherente celler ble analysert ved hjelp av CCK-8 kit.}

kolonidannelse assay

For det første, 6-brønns plater ble fremstilt med bunnagarlag (0,6% gel). Deretter, TR-AGS-CDH17_KD celler eller siCDH17 transfekterte celler (som proliferasjonsanalyse) ble suspendert i fullstendig medium inneholdende 0,3% -0,4% Noble agar (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og sådd inn i stilles 6-brønns plate og dyrket i 7 eller 14 dager. Celler ble farget med tiazolyl blå tetrazolium-bromid (MTT) i 2 timer. Antallet cellekolonier ble talt.

Cell syklus analyse

TR-AGS-CDH17_KD stabile celler ble sådd i en seks brønn plate på 1,0 × 10 ^{5 celler /brønn og behandlet med 5 ug /ml Tet. 120 timer senere ble cellene høstet med trypsin og fiksert med EtOH ved 4 ° C i 3 timer. Da celler ble sentrifugert ved 1500 g i 5 minutter og vasket med PBS. Re-suspenderes cellene i RNase /PBS-oppløsninger (20 ug /ml), inkubert ved 37 ° C i 15 min, deretter tilsatt PI /PBS-oppløsninger (20 ug /ml) og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter, inspisert fargede celler med BD FACS Calibur og analysert dataene med BD Cellquest Pro-programvaren.}

apoptose analyse

TR-AGS-CDH17_KD stabile celler ble sådd i en seks brønn plate på 1,0 × 10 ^{5 celler /brønn og ble behandlet med 5 pg /ml Tet. 120 timer senere ble cellene høstet med trypsin og vasket med forhåndsavkjølt PBS en gang. Celler ble resuspendert i 500 pl 1 x bindingsbuffer og 5 ul PI og 5 ul AnnexinV (BD) ble tilsatt. Etter inkubering i mørket (romtemperatur) i 10 minutter, ble de fargede cellene undersøkes med BD FACS Calibur. De innsamlede dataene ble analysert med BD Cellquest Pro-programvaren.}

Western blotting-analyse

Celler ble lysert ved RIPA buffer [150 mM NaCl, 1% NP40, 0,25% deoxycholate og 10 mM Hepes (pH 7.4)] inneholdende en protease inhibitor cocktail (Roche Molecular Biochemicals). Proteinkonsentrasjoner ble kvantifisert ved hjelp av bicinchoninic syre (BCA) metoden (Pierce). Tretti mikrogram protein per prøve ble kokt i lasting buffer og elektroforese i 8-12% gradient SDS polyakrylamidgeler (Invitrogen) og overført på nitrocellulosemembraner. Membranene ble probet med antistoffer (CDH17, Inte ß1, integrin β4, integrin β5, p-p53, p53, p21 var fra R &D, Raf, p-MEK, MEK, p-ERK, ERK var fra cellesignalisering, og K-Ras var fra Santa Cruz) og etterfulgt av et peroksidase-konjugert immunglobulin. Western Blottene ble visualisert med en forsterket kjemiluminescens (ECL) kit (GE, Healthcare)

Antistoff matriser assay

Tre typer antistoff matriser ble oppnådd fra R &. D Systems, Inc. for antistoff arrays analysen. Menneskelig Phospho-kinase Array Kit (Cat. No. ARY003) inneholder 43 forskjellige kinaser. Menneskelig Løselig Receptor Array Kit Non-hematopoetisk Panel (kat. Nr ARY012) inneholder 119 forskjellige løselige reseptorer. Menneskelig Apoptose Array Kit (Cat. No. ARY009) inneholder 35 forskjellige apoptose antistoffer. Mer utfyllende informasjon om disse matriser kan finnes i lenken av R &D Systems: http://www.rndsystems.com/. TR-AGS-CDH17_KD stabile celler ble høstet etter 120 timer ble behandlet med eller uten Tet (5 ug /ml) og proteinene ble lysert ved lysisbuffer med proteasehemmere, ble celle-ekstraktene ble fortynnet og inkubert med de tre typer av antistoff-matriser over natten . Matriser ble vasket for å fjerne ubundne proteiner, etterfulgt av inkubering med en blanding av biotinylert deteksjons antistoffer. Alle prosedyrer er i henhold til instruksjon av settet. Blottene ble analysert ved densitometri, og protein uttrykk ble normalisert til en positiv kontroll som var representert i hver membran.

Måling av in vivo aktivitet

TR-MGC803-CDH17_Over celler (1 x 10 ^{7 celler i 0,2 ml PBS) ble injisert i venstre armhule av 5~6 ukers BALB /c nu /nu atymiske hunnmus (Sino-britiske SIPPR /BK Lab. Animal Ltd, Kina). Tumor volum (mm 3) ble målt av målepunkter og beregnet som (W 2 x L) /2, hvor W er bredden og L er lengden. Når tumorvolumet nådde ~ 100 mm 3, ble musene tilfeldig delt inn i to grupper (9 mus i hver gruppe). Tetracylcine induksjon (Invitrogen, 0,2 mg /ml, som leveres i sterilisert drikkevann inneholdende 2,5% sukrose) ble initialisert på grupperingen dag. Sterilisert drikkevann inneholdende 2,5% sukrose ble tilført til musene i ikke-induserte gruppe. Tumorvolumer ble målt etter 3 dager før dyrene ble avlivet. Etter 35 dager induksjon, ble xenograft tumorvev oppsamlet og underkastet Western blot-analyse for relativ protein ekspresjon.}

Statistisk analyse

Data ble uttrykt som middel ± S.D. og statistisk utsatt for Students uparet t-test. Et nivå av P < 0,05 ble ansett å være betydelig

Resultater

Expression profilen til CDH17 i magekreft

Uttrykket nivået av CDH17 proteiner i 30 cellelinjer ble kategorisert. inn i 4 grupper basert på data fra tetthet analyse optisk mot beta-aktin. AGS-cellelinjen ble brukt som indre standard for å unngå avvik mellom geler. Over 66% av GC cellelinjer (20/30) var CDH17 positive (figur 1A).

Uttrykket og lokalisering av CDH17 i primær vev parafin delen ble oppdaget av immunhistokjemi på microarray. Sammenlignet med slides farget av normal mus IgG, CDH17 mAb farging ble vist et klart cellemembranen lokalisering (figur 1B). Blant 216 tilfeller med bekreftet patologi diagnose rapporten, 73,6% kreft vev (159/216) næret positiv CDH17 flekken med scoring fra + til +++, mens 37% positive CDH17 flekken i respektive tilstøtende normalt vev (tabell 1). I CDH17 positive tilfeller har ekspresjonsnivået av CDH17 positiv korrelasjon med lymfeknutemetastase. Imidlertid er ekspresjonsnivået omvendt forbundet med gastrisk vegg invasjon, tumor fjern metastase og tumor TNM etapper. Vår observasjon var i samsvar med tidligere kliniske rapporter [20] - [22]. Blant CDH17 positive tilfeller, kreftvevet utstilt sterkere farging av CDH17 (32,1% som scoring +, 25,2% som scoring ++ og 42,8% som scoring +++) enn tilstøtende normalt vev (62,5% som scoring +, 21,3% som scoring ++ og 16,3% som scoring +++). Mens ingen signifikant sammenheng ble observert mellom flekken scoring og klinisk stadium. Tar alt dette bevis sammen, kan CDH17 være en diagnostisk markør for tidlig magekreft i kinesiske populasjoner.

RNAi-mediert slå ned CDH17 på GC cellelinjer viste undertrykkelse av celleproliferasjon og kolonidannelse in vitro

Basert på resultatene av CDH17 ekspresjonsprofilen i et panel av GC-cellelinjer (fig 1 A), AGS (høyere CDH17), BGC-823 (lavere CDH17) og HGC-27 (ingen CDH17) cellelinjer ble valgt ut for videre in vitro celle funksjonell vurdering med RNAi-mediert CDH17 stanse. Western blotting viste at AGS cellene hadde høyt CDH17 protein nivå og uttrykk for CDH17 ble slått ned nesten helt av siCDH17. BGC823 cellene hadde lav CDH17 protein nivå og HGC-27 hadde ingen CDH17 protein (figur 2A). Sammenlignet med de rykke ut kontrollcellene, CDH17 slå ned hadde liten effekt på den proliferative evne BGC823 og HGC27 celler, mens hatt dramatisk effekt på AGS (med 60% på 72 timer, figur 2B). Soft agar-analysen viste at evnen til å danne koloni ble hemmet i AGS celler hvis CDH17 var banke ned (med 66% ved 14 d), men i BGC823 celler og HGC27 celler, CDH17 slå ned hadde liten effekt på kolonidannelse evne (Figur 2C). Det var ikke åpenbar forskjell mellom BGC823 celler (lavt nivå) og CDH17 HGC-27cells (ikke-CDH17) ved inhibering av proliferasjon og kolonidannelse indusert av siRNA CDH17 knockdown.

stabile cellelinjer som bærer TR induserbare knockdown av CDH17 i AGS celler og overekspresjon av CDH17 i MGC-803 celler

målet sekvensen i exon13 (90-2) ga over 90% reduksjon i mRNA nivå (figur 3A). Deretter brukte vi pLenti4 /TO /V5-miRNA-90-2 CDH17 lentivirus å omsette TR-AGS stabile celler og fikk en stabil Tet-regulert uttrykk shRNA av CDH17 genet celler (TR-AGS-CDH17_KD) som CDH17 proteinnivået ble redusert omtrent 90% etter indusert med 5 ug /ml Tet (figur 3B). Den pLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP lentivirus ble brukt til å omsette TR-MGC-803 stabile celler og valgt med blasticidin å få en stabil Tet-regulert uttrykk CDH17 genet celler (TR-MGC-803-CDH17_Over) . Overekspresjon av CDH17 i denne stabile celle ble bekreftet på proteinnivå ved Western blotting (figur 4A).

knockdown av CDH17 indusert hemming i celle spredning, migrasjon, vedheft, kolonidannelse og induksjon i celle-syklus arrest og apoptose

TR-AGS celler (kontrollceller) og TR-AGS-CDH17_KD celler ble brukt for å vurdere de mulige cellulære funksjonelle effekter av shRNA-mediert CDH17 knockdown i AGS celler. TR-AGS-CDH17_KD-celler ble behandlet med 5 pg /ml Tet viste en reduksjon i celleformering (med 75,8% etter 5 dager), cellemigrering evne (med 68,1% ved 16 timer), celleadhesjon evne (med 46,8% ved 30 minutter ) og kolonidannende evne (med 92,7% ved 7 dager) sammenlignet med Tet fri (figur 3C). I spredning redning studie, kan CDH17 knockdown i TR-AGS-CDH17_KD celler indusert av Tet bli reddet ved å fjerne Tet. Etter å ha fjernet Tet på dag fire, ble gjen uttrykk for CDH17 observert på dag 8 og 10 av kultur i CDH17 shRNA knockdown AGS celler. Re-uttrykk for CDH17 kunne redde spredning evne til TR-AGS-CDH17_KD celler (Figur 3D). Sammenlignet med Tet frie TR-AGS-CDH17_KD celler, Tet på celler viste en signifikant økning i prosentandelen av celler i G0 /G1 og G2 /M-fase og en dramatisk avdøde prosentandelen av celler i S-fasen (figur 3E). I mellomtiden har vi også observert at antallet av apoptotiske celler (med 52,2% etter 5 dager) ble økt ved nedregulering av CDH17 i TR-AGS-CDH17_KD celler (figur 3F). Ingen signifikant forskjell ble funnet i TR-AGS stabil cellelinje med eller uten Tet inkubasjon.

Overuttrykte av CDH17 fremmet veksten av tumorxenotransplantater i nakne mus

TR-MGC-803-CDH17_Over celler ble injisert subkutant inn i flankene av BALB /c nakne mus for å danne fast tumor. Ekspresjonen av CDH17 var under kontroll av Tet i drikkevann. Resultatene viste at etter 35 dager induksjon, Tet-indusert gruppe (tumor volum = 1849,08 ± 423.46m3) viste en 2,27 ganger høyere vekst fremgang rente versus Tet-fri gruppe (tumor volum = 814,04 ± 234.69m3) (p < 0,05) ( Figur 4B), og indusert CDH17 ekspresjon i tumorvevet kan bli analysert ved Western blotting (figur 4C). Det indikerte at CDH17 spiller en viktig rolle i kreftutvikling av magekreft. Vi har også brukt TR-AGS-CDH17_KD celler for å observere om lyddemping av CDK17 kan påvirke tumorgenisiteten i nakne mus. Dessverre, svulsten ta sats på denne cellelinjen var svært lav, og ingen pålitelig in vivo resultater ble observert med TR-AGS-CDH17_KD cellelinje.

Fastsettelse relaterte protein nivåer etter knockdown CDH17 av antistoff arrays analyse

i henhold til tumorigene effekter (inhibering av celleproliferasjon, kolonidannelsen, og tumorvekst in vivo) og metastatiske effekter (inhibering av cellemigrering og adhesjon) av CDH17 knockdown, velger vi tre antistoff arrays (fra R &D Systems ) for å teste de relative proteinforandringer, og håper å finne potent CDH17 regulert relaterte proteiner. I apoptose matrisen, fosfo-p53 (S15, S46 og S392) og p21 /CIP1 /CDNK1A ekspresjon økes omtrent to ganger etter 5 ug /ml Tet behandling i 5 dager, sammenlignet med ubehandlede celler (figur 5A (a) og 5B). I det fosfo-kinase matrise, fosfo-p53 (S15, S46 og S392) uttrykk også økt etter Tet behandling og, på samme tid, ekspresjon av fosfo-ERK1 /2 (T202 /Y204) ble redusert (figur 5A (b) og 5B). I den løselige reseptor-matrisen, kan knockdown av CDH17 i AGS-celler i betydelig grad redusere ekspresjonen av integrin β1, β4, β5, mens ikke påvirke ekspresjon av EGFR (figur 5A (c) og 5B). Endringen prosenter av interesserte proteiner mellom Tet-on og Tet-fri AGS celler ble oppsummert i figur 5B.

knockdown av CDH17 i AGS downregulated betainte og Ras /Raf /MEK /ERK-signalveien

protein~~POS=TRUNC endringer fra antistoff rekke analysen ble bekreftet ved Western blotting-analyse. Resultatene viste en signifikant reduksjon av integrin β1, β4, β5 og fosfo-ERK i CDH17 knockdown AGS-celler, men ingen signifikant endring i total ERK (figur 5C). Deretter vurderte vi å involvere andre Ras /Raf /MEK /ERK signalveien komponenter. Knockdown av CDH17 resulterte i nedregulering av Raf, fosfo-MEK og ERK fosfo-proteiner (figur 5C). Fra TR-MGC-803-CDH17_Over in vivo studie, observerte vi at overekspresjon av CDH17 forbedret integrin β1, β4, β5 uttrykk og ERK-aktivering (figur 4C), og det er i samsvar med ovennevnte funn. For å undersøke hvorvidt effekten av CDH17 på integriner eller Ras-protein er direkte interaksjon eller ikke, en co-immunoutfelling av CDH17 med integrin β1, integrin β4, integrin β5, integrin α2, og Ras ble gjennomført i magekreft AGS-celler, respektivt. Ut av forventning, i motsetning til Bartolome resultat [11], var det ingen direkte sammenheng mellom CDH17 og noen av disse inte eller Ras protein (data ikke vist).

Diskusjoner

Det er en stor utfordring for klinikere og grunnforskere for å bestemme de molekylære markører knyttet til progresjon og prognose av relaterte kreftformer. I lever og mage kreft, er det antatt at den høye ekspresjon av CDH17 var forbundet med dårlig overlevelse, tumorresidiv, tumorinvasjon, metastase og tumor avansert stadium [23] - [25]. I studien, blant 30 paneler GC cellelinjer, over 66% av våre testede cellelinjer (20/30) er CDH17 positive, og nesten halvparten av disse cellelinjene har høyere CDH17 uttrykk. I vår patologi diagnose rapport, 73,6% kinesisk GC kreft vev (159/216) hadde positiv CDH17 flekken. I CDH17 positive tilfeller har ekspresjonsnivået av CDH17 positiv korrelasjon med lymfeknutemetastase. Imidlertid er ekspresjonsnivået omvendt assosiert gastrisk vegg invasjon, tumor fjern metastase og tumor TNM etapper. Vår observasjon var i samsvar med tidligere kliniske rapporter [20] - [22]. Tar alt dette bevis sammen, kan CDH17 være en diagnostisk markør for tidlig magekreft i kinesiske populasjoner.

For å identifisere effekten av CDH17 i magekreft tumorigensis og metastatisk potensial, både oligo siRNA og TR induserbare pLentiviral vektorer med spesifikke miRNA (exton13) mot CDH17 ble brukt for knock-down CDH17 uttrykk i mage kreft cellelinjer. CDH17 stanse ved oligo siRNA kan hemme celledeling og kolonidannelse i GC cellelinjer med høy CDH17 uttrykk. Den inhibitoriske effekt var dramatisk på AGS som har en høyere CDH17 uttrykk, men ikke på BGC823 og HGC27 celler som har meget lav eller ingen ekspresjon av CDH17 protein (figur 2). Det indikerte at CDH17 ekspresjonen kan bidra til kreft-celleformering og kolonidannelse evne i AGS-celler. Videre lignende resultater ble også observert i tet-indusert shRNA-mediert CDH17 knockdown i AGS-celler som resulterte i inhibering av celleproliferasjon, migrasjon, adhesjon, kolonidannelse og induksjon av apoptose og cellesyklusarrest i vitro. Re-uttrykk for CDH17 kunne redde spredning evne til TR-AGS-CDH17_KD celler (figur 3). I tillegg Tet indusert over uttrykk for CDH17 i TR-MGC803-CDH17_Over celler kan fremme veksten av tumorxenotransplantater in vivo (figur 4). Tar alt dette bevis sammen, kan vi konkludere med at det er en signifikant sammenheng mellom CDH17 uttrykk og tumorigen og metastatiske evner av magekreft, og CDH17 kan tjene som et potensielt terapeutisk mål for fremtidig forskning.

Selv om flere tidligere studier har rapportert at lyddemping av CDH17 kunne hemme celleproliferasjon i GC-celler, signaleringsmekanisme av CDH17 er fortsatt uklar. Det er blitt påvist at CDH17 mediert onkogene signalisering i HCC har sammenheng med Wnt signalveien [5]. Men det var noen forskjeller mellom våre resultater og resultatene som rapporteres av Liu i HCC. Våre resultater viste ingen endring i fosforylert form av glykogen syntase kinase 3β (GSK-3β og holde av β-catenin i kjernen etter stanse CDH17 (data ikke vist). Dette avviket kunne forklares ved utnyttelse av forskjellige kreftcelletype og

• PLoS ONE: mikroRNA 135a undertrykker lymfeknutemetastase gjennom nedregulering av ROCK1 i tidlig Gastric Cancer
• PLoS ONE: Kliniske resultater for magekreft etter adjuvant Chemoradiation Utnytte Intensity Modulert versus tredimensjonale konforme Radiotherapy