PLoS ONE: Resveratrol hemmer veksten av magekreft ved å fremkalle G1 fase Arrest og Senescence i en SIRT1 avhengig måte

Abstract

Resveratrol, en naturlig forekommende polyfenolforbindelsen, har blitt rapportert å utøve anticancer aktivitet ved å påvirke ulike molekylære mål. I denne studien undersøkte vi effekten og de underliggende mekanismene for resveratrol på magekreft. Vi fant at resveratrol inhiberte proliferasjonen av magekreftceller på en doseavhengig måte. Ved en konsentrasjon på 25 og 50 uM, resveratrol hemmet cellelevedyktighet og svekket klonogene potensialet av magekreftceller. Resveratrol behandling arrestert magekreftceller i G1 fase og førte til begynnende alderdom i stedet for apoptose. Regulatorer av cellesyklus og senescence reaksjonsveier, inkludert cyklin D1, cyklin-avhengig kinase (CDK4 og 6), p21 og p16, ble dysregulerte av resveratrol behandling. De hemmende effektene av resveratrol på magekreft ble også verifisert in vivo
ved hjelp av en naken mus xenograft modell. Resveratrol (40 mg /kg /d) som virker inhiberende aktiviteter på magekreftutvikling og betydelig reduserte fraksjoner av Ki67-positive celler i tumorprøver fra de nakne mus. Etter resveratrol behandling, induksjon av senescence og endringene i uttrykket som er involvert i cellesyklus og senescence trasé regulatorer var lik det vi observerte in vitro
. Men uttømming av Sirtuin (Sirt) en reversert de ovenfor beskrevne effektene av resveratrol både in vitro Hotell og in vivo
. Våre data tyder på at resveratrol hemmer magekreft i en SIRT1 avhengig måte og gi detaljert bevis for muligheten til å søke resveratrol i magekreft forebygging og behandling

Citation. Yang Q, Wang B, Zang W, Wang X Liu Z, W Li, et al. (2013) Resveratrol hemmer veksten av magekreft ved å fremkalle G1 fase Arrest og Senescence i en SIRT1 avhengig måte. PLoS ONE 8 (11): e70627. doi: 10,1371 /journal.pone.0070627

Redaktør: Dominique Heymann, Faculté de Médecine de Nantes, Frankrike

mottatt: 20 mars 2013; Godkjent: 19 juni 2013; Publisert: 21.11.2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (No. 81101869, 81100103, 81171536 og 81000868), National Basic Research Program of China (973 Program, nr 2012CB911202), og Uavhengig Innovation Foundation of Shandong University (2012TS108) sikret funders hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den fjerde vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreft-relaterte dødeligheten i verden. Ifølge en global vurdering, ble totalt 989,600 nye GC tilfeller diagnostisert og et minimum av 738,000 pasienter døde av denne sykdommen i 2008, sto for 10% av alle dødsfall fra kreft [1]. Selv om forekomsten av GC har vært fallende globalt, er det fortsatt høy i utviklingsland, spesielt i Kina [1], [2]. Tidligere studier har avdekket det intime forholdet mellom kronisk gastritt forårsaket av Helicobacter pylori
infeksjon og utvikling av GC [3]. Dessuten har vert genetiske, miljømessige, kosttilskudd og andre faktorer vært innblandet i onkogene mage prosessen [1]. Som det er fortsatt vanskelig å få en tidlig diagnose for GC, er de fleste av pasientene diagnostisert på avanserte stadier. Til tross for den forbedring av konvensjonelle behandlinger for avansert GC, inkludert kirurgi, kjemoterapi og radioterapi, lengden eller livskvaliteten hos pasienter med langt fremskreden GC er fremdeles dårlig [2], [4]. Derfor er utforskning av nye forebyggende medikamenter eller terapeutiske mål av GC presserende behov.

Forbruk av frisk frukt og grønnsaker bidrar til en redusert forekomst av kreft, inkludert GC [2], [5]. Kliniske anvendelser antyder også at noen bioaktive diett molekyler har evnen til å inhibere flere onkogene trinn [5] - [7]. Resveratrol (Res, 3,5,4'-trihydroxystilbene) er en naturlig forekommende polyfenolforbindelsen stede i nesten 70 plantearter, inkludert huden av røde druer, peanøtter, bær og andre [6] - [8]. Res ble først rapportert å utøve anti-tumoraktiviteter i 1997 [8]. Senere rapporter har vist at Res formidler hemmende effekter på flere typer kreft, for eksempel kolonkreft, brystkreft og lymfom, og påvirker ulike molekylære mål [9] - [11]. Sirtuin 1 (SIRT1), en klasse III-nikotinamid-adenin-nukleotid (NAD ^{+) - avhengig av histon /protein-deacetylase, har blitt rapportert å være et viktig mål for Res i flere tumormodeller [9], [10]. Men noen data viser strid resultater som tyder på at Res utøver chemoprotective effekter uavhengig av SIRT1 [11]. De hemmende effekter av Res på GC og den underliggende mekanismen er ikke godt undersøkt.}

I denne studien, viste vi at Res hemmet spredning av GC-celler in vitro
. Res behandling indusert cellesyklus arrest i G1 fasen og førte til mobilnettet senescence. Disse effektene av Res ble tilbakestilt av uttømming av SIRT1. De hemmende SIRT1 avhengige aktiviteter Res på GC-celler ble også bekreftet in vivo
. Til sammen våre resultater tyder på at Res utøver SIRT1 avhengig hemmende effekt på GC og foreslår en terapeutisk rolle for Res i GC.

Materialer og metoder

Etikk erklæringen

All dyrestudier ble godkjent av etikkomiteen av Shandong University School of Medicine (nr 001 i 2011 for dyreetikk godkjenning) og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.

cellelinjer, kultur betingelser og Res Behandling

Menneske GC cellelinjer AGS (hentet fra Shanghai Institute of Biochemistry og cellebiologi Cell Resource Center, ved Chinese Academy of Sciences), BGC-823 og SGC-7901 (kjøpt fra Kina Senter for Type Culture Collection, Wuhan, Kina) ble anvendt i denne studien. Cellene ble dyrket i F12 (AGS) eller RPMI 1640 (BGC-823 og SGC-7901) inneholdende 10% FCS, 100 enheter /ml penicillin og 2 mmol /L L-glutamin ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO _{2. Høy renhet Res ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO, USA), ble oppløst i DMSO og tilsatt til kulturmediet ved den angitte konsentrasjon. Alle forsøkene ble utført 24 timer etter Res tilskudd, med mindre annet er angitt.}

Små forstyrrelser RNA Transfeksjon

Kjemisk modifisert liten interfering RNA (siRNA) rettet mot SIRT1 og kontroll siRNA ble kjøpt fra GenePharma (Shanghai , Kina). Sekvensen av SIRT1 siRNA var 5'-CCAUCUCUCUGUCACAAAUTT-3 '. Celler ble inkubert over natten og deretter transfektert med siRNA ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Førti-åtte timer etter siRNA transfeksjon, ble cellene behandlet med 50 um Res i 24 timer før videre studier.

celleviabilitet analysen

sprednings ble vurdert ved hjelp av Cell Titer 96 ® vandige løsning Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI, USA). I korthet, 2 x 10 ^{3-celler ble sådd i en 96-brønns plate og tillatt å vokse i 24 timer. Tjuefire timer senere ble 20 ul MTS (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-karboksy-metoksyfenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium) ble tilsatt til hvert godt. Etter inkubasjon i 3 timer ved 37 ° C ble absorbansen ved 490 nm registrert på en Varioskan Flash multiplate Reader (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Cellelevedyktigheten ble beregnet ved følgende formel: relativ cellelevedyktighet = (gjennomsnittlig absorbans av behandlede gruppen - gjennomsnittlig absorbans av blank) /(midlere absorbans av kontroll gjennomsnittlig gruppe- absorbans på blank). Analyser ble utført in triplo og gjentatt tre ganger.}

kolonidannelse Assay

Celler ble sådd ut i 6-brønns plater (300 eller 500 celler per brønn) og inkubert i 10 dager inntil koloniene var store nok til å være klart skjelnes. Cellene ble fiksert med metanol og farget med krystallfiolett, og antallet kolonier med mer enn 50 celler ble tellet manuelt. Eksperimenter ble utført in triplo og gjentatt tre ganger.

Cell Cycle Analysis

Cellene ble høstet, fiksert med på forhånd avkjølt 70% etanol ved 4 ° C over natten og deretter farget med propidiumjodid (Beyotime , Jiangsu, Kina) inneholdende RNase A ved 37 ° C i 30 minutter i mørket. Cellesyklus distribusjon ble bestemt ved hjelp av et flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) og dataene ble analysert med Multicycle programvare (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA, USA). Eksperimenter ble utført uavhengig tre ganger.

apoptose analysen

Deteksjon og kvantifisering av apoptose ble utført ved merking av DNA-trådbrudd ved hjelp av en In Situ celledød Detection Kit, TMR rød (Roche Applied Science, Basel, Sveits). Celler eller parafinsnitt av xenotransplantater ble merket med TUNEL i henhold til produsentens instruksjoner. For celler, behandling med 0,2 mM H _{2o 2 til 12 timer tjente som positiv kontroll. For parafinsnitt, var positive kontroller kjøpes fra Millipore (Billerica, MA, USA). Kjernene ble kontra med DAPI (Beyotime) og lysbilder eller seksjonene ble fotografert av en fluorescens mikroskopi (Olympus, Tokyo, Japan) ved hjelp cellSens Dimension programvare. Eksperimenter ble utført uavhengig tre ganger.}

β-galaktosidase Farging

Senescence ble vurdert ved hjelp av en Senescence β-galaktosidase Farging Kit (Beyotime). Kort sagt ble celler eller frosne deler av xenotransplantater fast og deretter inkubert med nyfremstilt β-galaktosidase (β-Gal) fargeløsning ved 37 ° C over natten. Eksperimenter ble utført uavhengig tre ganger.

Stabile Lentiviral-kort hårnål RNA (shRNA) GC Cells

lentiviral vektorer som inneholder kontroll eller SIRT1 shRNA ble konstruert av GenePharma og brukes til å transfektere BGC-823 celler. Effektiv knockdown av SIRT1 ble verifisert av western blot. For stabil transduksjon, kontroll-lentivirus-infiserte eller SIRT1 shRNA-lentivirus-infiserte BGC-823-celler ble dyrket i fullstendig medium som følger med 2 ug /ml puromycin i fire uker, og betraktes som LV-C og LV-S, respektivt.

Nude Mice Xenotransplantat Modell

Kvinne atymiske BALB /c naken mus (6~8 uker) ble kjøpt fra Peking University (Beijing, Kina) og ble opprettholdt under patogenfrie forholdene på nøkkelen Laboratory of Cardiovascular Ombygging og funksjon Research, Qilu sykehus, Shandong University. Musene ble tilfeldig inndelt i fire grupper (8 mus i hver gruppe): gruppe I og II, BGC-823-celler (1 x 10 ^{6 celler pr injeksjon i 0,1 ml PBS) ble injisert subkutant i flanken regionen av nakne mus; gruppe III, ble LV-C (BGC-823 celler) injisert; og gruppe IV, LV-S (BGC-823 celler) ble injisert. Etter implantering, naken mus fra grupper II, III og IV ble behandlet med Res (40 mg kg -1 i 0,1 ml vegetabilsk olje, tilført ved magesonde, en gang daglig). Den subkutane tumorstørrelse ble målt med en skyvelære, og tumorvolumene ble beregnet ved formelen (lengde) x (bredde 2) /2. Musene ble avlivet fire uker senere. Svulstene ble høstet og bearbeidet for vestlige blot og immunkjemiske studier.}

Real Time-kvantitativ PCR (RT-QPCR)

Total RNA i cellene ble isolert ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen) og omdannet til cDNA ved hjelp av PrimeScript ™ RT reagenssett (Takara, Tokyo, Japan). RT-QPCR ble utført for gener, inkludert cyklin D1, cyklin-avhengig kinase 4 (CDK4), p21 og β-aktin som tidligere beskrevet [12]. Sekvensene til amplifiseringsprimerne er oppført i tabell S1. MRNA-ekspresjon av cyclin D1 CDK4 og p21 ble normalisert til p-aktin i forhold til kontrollen ved hjelp av to ^{-ΔΔCt metode. Hvert eksperiment ble gjentatt i triplikat.}

Western Blot

Total protein fra celler eller tumorprøver ble ekstrahert med RIPA-lyseringsbuffer (Beyotime) som beskrevet [12]. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Membranen ble undersøkt med antistoffer mot SIRT1 (Abcam, Cambridge, MA, USA), BCL-2, Bax, caspase-3, cyclin D1, CDK4 og 6 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), p16 og p21 (i Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Det sekundære antistoffet som ble benyttet var et pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert anti-kanin eller mus-antistoff. Proteinbåndene ble synliggjort ved hjelp av en ECL-systemet (Pierce). β-aktin (Cell Signaling) fungerte som en lasting kontroll.

Immunohistochemistry

De vevsprøver fra de nakne mus ble deparaffinized, rehydrert og antigen hentes. Snittene ble inkubert med et antistoff mot Ki67 (1:500, Abcam) over natten ved 4 ° C. HRP-konjugert anti-kanin-IgG og DAB-farging ble anvendt for å visualisere Ki67 antistoff. Glassene ble endelig kontra med hematoksylin. Glassene ble fotografert av et Olympus lysmikroskop (Tokyo, Japan) ved hjelp cellSens Dimension programvare. De Ki67-positive celler ble tellet manuelt, og prosenten av Ki67-positive celler ble bestemt per felt. Fem separate felt ble telles for hver seksjon.

Statistiske analyser

Dataene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. De statistiske analysene ble utført ved hjelp av statistikkprogrammet for samfunnsvitenskap (SPSS, versjon 16.0, Chicago, IL, USA) ved enveis ANOVA med Tukey post-hoc test. P-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.

Resultater

Res Hemmer Livskraftig av GC-celler i en SIRT1 avhengig måte

Tre GC cellelinjer (AGS, BGC-823 og SGC-7901) ble undersøkt i våre forsøk. Dyrking av cellene i bærer (0,1% DMSO) ikke påvirke cellenes levedyktighet (data ikke vist). Imidlertid, når de ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Res i 24 timer, celleproliferasjon ble doseavhengig inhibert ved 25, 50, 100 og 200 uM Res (figur 1A). Av notatet, ble spredning av AGS åpenbart hemmet når de ble behandlet med 10 um Res, som ikke ble observert i de to andre cellelinjer (figur 1A). I alle de tre cellelinjer, nærvær av 100 uM Res var tilstrekkelig til å indusere mer enn 50% veksthemning (56,78% for AGS, 54,87% for BGC-823 og 52,16% for SGC-7901, henholdsvis). Derfor ble 25 og 50 um Res brukes for etterfølgende eksperimenter. For å bestemme den funksjonelle rollen SIRT1 i Res behandling, vi slått ned SIRT1 uttrykk ved hjelp av en bestemt siRNA. Den effektive inhibering av SIRT1 ekspresjon ble bekreftet ved western blot (figur 1B). Resultatene av MTS-analysen viste at i SIRT1-uttømte celler, gjorde Res ikke inhibere celleformering (figur 1C). Disse data indikerer at Res er i stand til å inhibere proliferasjonen av GC-celler, og at den hemmende effekten kan bli reddet ved SIRT1 uttømming.

Res minsker klonogene Potential av GC celler i en SIRT1 avhengig måte

tumorceller, har kolonidannelse blitt funnet å være en mer følsom parameter enn levedyktighet for å vurdere effekten av et legemiddel. Således forsøk ble deretter foretatt for å bestemme virkningen av Res på klonogene potensialet til GC-celler. Res, ved en konsentrasjon på 25 uM, har ført til en betydelig reduksjon i foci tall så vel som størrelsene i GC-celler. Etter behandling med 50 uM Res, den klonogene potensialet reduseres ytterligere. Imidlertid knockdown av SIRT1 før Res behandling økte antall foci til et nivå som kan sammenlignes med bærergruppen (figur 2).

Res Induserer Akkumulering av GC celler i G1 fase i en SIRT1 avhengig måte

for å undersøke den hemmende effekten av Res på GC-celler, utførte vi cellesyklus analyse. Det ble observert at 25 og 50 uM Res økte andelen av celler i G1 fase i både BGC-823 og SGC-7901-celler (figurene 3A og 3B). Induksjonen av G1 faserest av Res var også doseavhengig. Res ved en konsentrasjon på 50 uM viste en sterkere virkning enn den gjorde ved 25 uM. Økningen av antall celler i G1 fasen ble ledsaget av en nedgang i cellepopulasjoner hovedsakelig i S-faser. Uttømming av SIRT1 før Res behandling redusert G1 fase induksjon av Res (figur 3A og 3B). For å underbygge resultatene ovenfor, undersøkte vi uttrykket av cellesyklus regulatorer av G1 fasen, inkludert cyclin D1, CDK4, CDK6, p21 og p16 i BGC-823 celler. Som vist i figur 3C, i Res behandlet BGC-823-celler, protein nivåene av aktivatorer av G1 /S overgang (cyklin D1, CDK4 og CDK6) redusert, mens proteinnivåer inhibitorer av CDK (CDKIs) (p21 og p16) økt. I kontrast, ble disse endringene ikke funnet i SIRT1-utarmet BGC-823 celler når de ble behandlet med 50 um Res. Lignende resultater ble oppnådd fra RT-QPCR av cyclin D1 CDK4 og p21 (figur 3D).

Mangelen på sub-G1-celler indikerte at Res behandling ikke utløse apoptose i GC-celler (figur 3A) , som var i samsvar med resultatene av tunel merking eksperimenter fra BGC-823 celler (Figur S1 A). Protein nivåer av apoptose-relaterte molekyler, slik som bcl-2, Bax og caspase-3, fra hver gruppe var sammenlignbare (figur S1B). Til sammen våre resultater viser at Res induserer G1 fase arrest i GC-celler i en SIRT1 avhengig måte og ikke induserer apoptose.

Res induserer Senescence av GC celler i en SIRT1 avhengig måte

i våre hender, Res resulterer i vekst arrest i stedet for økt apoptose. Derfor har vi gjort ytterligere innsats for å utforske om Res kan indusere senescence i GC-celler. fi-gal-farging, en spesifikk markør for pattedyrsenescent celler, ble anvendt. Etter Res behandling, fant vi økt fraksjoner av celler ble farget med β-Gal. Imidlertid er forbehandling med SIRT1 siRNA blokkert Res-indusert cellulær senescens (figur 4). Lignende resultater ble oppnådd fra både BGC-823 og SGC-7901 celler, noe som tyder på at Res forsørges på SIRT1 å indusere cellealdring i GC-celler.

Res hemmer tumorvekst in vivo i en SIRT1 avhengig måte

Deretter ytterligere studier ble utført for å fastslå effekten av Res på BGC-823 xenografter vekst i nakne mus. For in vivo
studien ble stabile omsatte lentiviral-shRNA BGC-823 celler brukes. Av de fire SIRT1 shRNA-lentiviruses, LV-en og LV-4 utøves åpen Silencing effekter på SIRT1 uttrykk (figur S2). Etter fire uker med screening, var uttrykk for SIRT1 holdes på redusert nivå i stallen lentiviral-shRNA BGC-823 celler (Figur S2). Stabile LV-1 lentiviral-shRNA BGC-823 celler ble brukt i senere xenoimplantater studier på grunn av sterkere hemmende effekt på SIRT1 uttrykk i forhold til LV-4. Alle dyrene overlevde til slutten av forsøkene, og ingen åpenbare forskjell ble funnet i deres kroppsvekt (data ikke vist). Fire uker etter implantering, målinger av tumorvolum indikerte at Res behandling betydelig redusert vekst i BGC-823 transplantater (Res vs kontroll: 0.5728 ± 0,2276 cm ^{3 vs 1.4288 ± 0,1741 cm 3, P < 0,001) . Stabil transduksjon av kontroll shRNA-lentivirus ikke påvirke tumorvolumet (Res vs Res + Ci: 0.5728 ± 0,2276 cm 3 vs 0,68 ± 0,0672 cm 3, P = 0,603). Men i de SIRT1-utarmet xenografter, den hemmende effekten av Res på tumorvekst ble reddet (Res + Si vs Res + Ci: 1.2313 ± 0,1777 cm 3 vs 0,68 ± 0,0672 cm 3, P < 0,001, Res + Si vs kontroll: 1.2313 ± 0,1777 cm 3 vs 1,4288 ± 0,1741 cm 3, P = 0,123) (figur 5A). I Res-behandlede xenografter, spredning markør, Ki67, sunket betraktelig (figur 5B) (% av Ki67-positive celler, Res vs kontroll: 3 ± 1,8 vs 44,67 ± 3,79, P < 0,001). Senescens ble observert i xenotransplantater fra Res-behandlede mus er indikert ved β-Gal farging (figur 5B). Men ingen åpenbar apoptose ble indusert av Res i xenografter (figur S1D) og ble ikke observert noen endringer i regulering av apoptose, som BCL-2, Bax og caspase-3 (Figur S1C). Disse resultatene var konsistente med in vitro
eksperimenter. Videre endringer i uttrykket av regulatorer av cellesyklusen, inkludert cyclin D1, CDK4, CDK6, p21 og p16 var lik det vi observerte in vitro plakater (figur 5C). Alle endringene som er observert i Ki67, β-Gal og cellesyklus regulatorer ble reversert av SIRT1 mangel (figur 5B og C) (% av Ki67-positive celler, Res + Si vs Res + Ci: 46,32 ± 6,03 vs 2,65 ± 1,53, P < 0,001, Res + Si vs kontroll: 46,32 ± 6,03 vs 44,67 ± 3,79, P = 0,946)}

Diskusjoner

Res, en naturlig polyphenol, blir nå vurdert som en lovende kreft. middel. Selv om det har vist seg å gi antiproliferative virkninger mot en rekke krefttyper, både i cellekultur og xenograft-modeller [9] - [11], dens chemoprevention virkning på GC og den underliggende mekanisme er ikke blitt godt undersøkt. I denne studien viste vi at Res hemmet spredning av GC cellelinjer (AGS, BGC-823 og SGC-7901). Den anti-vekst ble observert etter at cellene ble behandlet med 25 uM Res i 24 timer, og den inhiberende effekt var doseavhengig. Ved en konsentrasjon på 50 uM Res, inhiberings-forhold for disse tre cellelinjer var 41%, 34% og 32%, respektivt. Når konsentrasjonen av Res økes ytterligere, ble den hemmende effekter forsterkes. Både 100 og 200 pm Res hemmet vekst med mer enn 50% i forhold til bærergruppen. I tillegg, jo høyere dose av Res er for stor til å oppnå in vivo Hotell og dermed gir ingen mening i en klinisk setting [13], [14]. Derfor ble de to nedre effektive konsentrasjoner på 25 og 50 uM Res anvendt i de etterfølgende studier. Veksthemmende aktivitet av Res synes å være cellespesifikk, som IC50 varierer i henhold til den celletype og varierer fra 27 uM til 180 uM [9], [10], [15], [16]. Noen av disse studier har også vist at Res utøver de inhiberende effekter i en tidsavhengig måte, [15], [16]. Konsentrasjonen og varigheten av Res behandling som brukes i vår undersøkelse var i samsvar med de fleste rapporter fra andre grupper [8], [9], [16]. For in vivo
studie, administrasjonen metoden vi brukte er sonde fordi dette er den metoden som vanligvis brukes i mus som et alternativ til intraperitoneal injeksjon [15], [17]. I tillegg har studier på mus viste at Res absorberes effektivt etter oral administrasjon, og kan finnes i hele kroppen [17], [18]. Når den brukes in vivo
, Res betydelig redusert spredning av celler som preget av Ki67 uttrykk, som er konsistent med resultatene fra våre in vitro
eksperimenter.

Res kan forsinke spredning av cancerceller via forskjellige mekanismer, blant annet, regulering av cellesyklus er en viktig on [9], [15], [19]. Vår in vitro
data viser at behandling av GC-celler med Res induserer G1 fase arrest. G1 fase er den første av de fire faser av cellesyklus som finner sted i eukaryot celledelingen. G1 er en spesielt viktig cellesyklus fase fordi det er det punkt hvor en celle begår til en rund av divisjon. Progresjon gjennom G1 fasen krever dannelsen og handling av cyclin D-CDK4 eller -CDK6 komplekser. Disse komplekser deretter fosforylere retinoblastom, noe som fører til frigjøring av E2F-transkripsjonsfaktorer og nedstrøms gentranskripsjon involvert i S-fasen progresjon. Virksomheten til cyclin D-CDK-komplekser er regulert av oppstrøms hemmere, inkludert medlemmer av INK (p15, p16 og p18) og CIP familier (P21, P27 og P57) [20], [21]. Langs samme linje, akkompagnert med G1 fase arrest, observerte vi at nedregulering av cyclin D1, CDK4 og CDK6 og oppregulering av p21 og p16 i Res-behandlede GC-celler. Vår in vivo
resultatene av uttrykket nivåer av disse cellesyklus regulatorer i vevsprøver er konsistente med in vitro
resultater. Våre resultater er også i overensstemmelse med tidligere studier [15], selv om noen andre har rapportert at S-fasen arrest er indusert av Res [9], [19]. Persistens av vekststans kan føre til apoptose eller begynnende alderdom i celler. Fordi både p21 og P16 signalveier som deltar i progresjonen senescens mediert ved hjelp av forskjellige typer stress [22], [23], utførte vi β-Gal farging. Res behandling betydelig økt hyppighet av senescent GC-celler på en doseavhengig måte. Den cellulære senescens programmet representerer et viktig barriere mot kreft initiering og utvikling [24], [25]. Selv om tidligere studier viser at gjennom demping av oksidativt stress og forbedring av metabolisme, Res utøver anti-aging effekt både in vitro Hotell og in vivo product: [26] - [28], det motsatte effekter har vært vist i kreft. Res har blitt funnet å indusere senescens lignende veksthemming i flere typer kreft [29], [30]. Den doble rollen som Res i mobilnettet senescence, hemmende aldring i normalt vev og akselererende aldrings i tumorer, gjør det til en ideell kandidat for kreft forebygging og behandling.

Apoptose er en annen vanlig effekt som vanligvis observeres i Res-behandlet kreftceller [9], [11], [15], [16]. Eksperimentelle bevis indikerer at apoptose kan bli mediert ved flere forskjellige veier og en rekke regulatoriske molekyler. Blant disse regulatorer, proteinene som omfatter den bcl-2-familien er viktig. Det er både anti-apoptotiske proteiner (BCL-2, BCL-XL) og pro-apoptotiske proteiner (Bax, dårlig, Bak og BCL-xs) i denne familien. En økning av den pro-apoptotiske bax /anti-apoptotiske bcl-2-forholdet øker permeabiliteten av mitokondriemembranen, bevirker frigjøring av cytokrom c fra mitokondrier til cytosol og, i sin tur, resulterer i aktiveringen av caspase-9 og nedstrøms målrette caspase-3 [31]. Til tross for dette indre apoptotisk reaksjonsvei, de pro-apoptotiske ligander, slik som Fasl, ved binding til deres reseptorer, forårsaker aktiveringen av caspase-8 og nedstrøms effektorer, så som caspase-3. Aktiveringen av effektor caspaser induserer spaltning av mange cellulære substrater og direkte fører til apoptose [31] - [33]. Selv om mange tidligere rapporter tydet på at apoptose var ansvarlig for Res-indusert veksthemming, har vi ikke observere opplagt apoptose i Res-behandlede GC-celler. Dette fravær av apoptose kan være på grunn av konsentrasjonen og varigheten av behandlingen er tilpasset Res i vårt eksperiment fordi studier fra forskjellige grupper viser at Res utøver Proporsjone og varighet avhengige effekter [34], [35]. I tillegg, som effekten av Res er også celle-spesifikk [36] - [38], GC-celler anvendt i vårt studium kan være resistente mot Res apoptose

Res har flere mål.; blant annet, i klasse III NAD ^{+ - avhengig deacetylase SIRT1 er det mest studerte. Selv om en biokjemisk studie indikerte at Res var ikke en direkte aktivator av SIRT1 [39], har Res likevel vært ansett som et klassisk agonist av SIRT1. Mange studier viser at Res utøver ulike effekter i ulike modeller i en SIRT1 avhengig måte [40], [41]. I vårt eksperiment, SIRT1-uttømming reversert veksthemming av Res både in vitro Hotell og in vivo
. G1 fase arrest og senescence indusert av Res behandling ble reddet av SIRT1-uttømming. Disse resultatene indikerer at de inhiberings effekter av Res på GC er avhengig av SIRT1. I henhold til tidligere studier, kan SIRT1 regulere genekspresjon gjennom to forskjellige mekanismer. Først direkte, SIRT1 direkte formidler deacetyleringen av et protein og deretter forbedrer sin ubiquitinering og påfølgende ubiquitin proteasome degradering [42]. For det andre, indirekte, SIRT1 utøver deacetylase aktivitet påvirker kromatin bekreftelse eller undertrykke virksomheten til transkripsjonsfaktorer og regulerer deretter transkripsjon av gener [43] - [45]. Som molekylene (cyclin D1, CDK4, CDK6, p21 og P16) påvist i våre forsøk har ikke blitt rapportert som direkte mål for SIRT1, spekulerte vi at SIRT1 kan regulere uttrykket av disse genene hovedsakelig gjennom indirekte mekanisme. Resultatene av RT-QPCR støtter også denne hypotesen.}

Til sammen våre funn tyder på at Res hemmer både spredning av GC-celler in vitro Hotell og vekst av xenografter in vivo
. Res behandling induserer G1 fase arrest i GC-celler og fører til alderdom i stedet for apoptose. SIRT1-uttømming redder de ovennevnte virkninger av Res både in vitro Hotell og in vivo
. Vårt arbeid viser at Res hemmer GC i en SIRT1 avhengig måte og gir detaljert bevis for muligheten til å søke Res i GC forebygging og behandling.

Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Res utøver ingen effekt på apoptose av BGC-823 celler. (A) Apoptose ble indikert ved TUNEL merking (rød) og BGC-823-celler ble motfarget med DAPI (blå). Behandling med H 2o 2 tjente som positiv kontroll. Original forstørrelse: × 200. Scale barer, 50 mikrometer. (B) Regulatorer av apoptose i BGC-823-celler, inkludert bcl-2, Bax og caspase-3 ble analysert ved hjelp av western blot. (C) Regulatorer av apoptose i xenotransplantater, inkludert bcl-2, Bax og caspase-3 ble analysert ved hjelp av western blot. For påvisning av spaltet caspase-3, BGC-823 celler behandlet med H 2o 2 tjente som positiv kontroll (vist i panelet til høyre). (D) Apoptose i xenotransplantater ble påvist ved TUNEL merking (rød) og delene ble motfarget med DAPI (blå). Seksjoner fra kvinnelig gnager melkekjertlene innhentet 3~5 etter avvenning av rotteunger (Millipore) tjente som positiv kontroll. Original forstørrelse: × 200. Scale barer, 50 mikrometer. 'R' representerer resveratrol, "Ci 'representerer kontroll siRNA og" Si' representerer SIRT1 siRNA
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070627.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
knockdown av SIRT1 av shRNA-lentivirus. (A) BGC-823 celler ble transfektert med kontroll eller SIRT1-spesifikke shRNA-lentiviruses. Transfeksjonseffektiviteten ble evaluert med et fluorescens mikroskop. Ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 50, ble mer enn 90% av cellene transfektert med shRNA-lentivirus. Etter fire ukers screening med puromycin ble alle levende celler transdusert. Forstørrelse: × 100, bar for 200 mikrometer. (B) Cellene ble høstet 4 dager etter infisering, og 28 dager etter puromycin screening. Taushet effektiviteten av SIRT1 ble bekreftet av western blot
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070627.s002 plakater (TIF)
Tabell S1.
primere for RT-qPCR eksperimenter utført i denne studien
doi:. 10,1371 /journal.pone.0070627.s003 plakater (DOC)

• PLoS ONE: RhoE Fremmer Metastase i magekreft gjennom en mekanisme Avhengig Enhanced Expression of CXCR4
• PLoS ONE: mykofenolsyre hemmer migrasjon og invasjon av magekreft celler via flere Molecular Pathways