PLoS ONE: Ikke-invasiv visualisering av mikroRNA-16 i Chemoresistance av magekreft Ved hjelp av en Dual Reporter Gene Imaging System

Abstract

microRNAs (mirnas) har vært innblandet å spille en sentral rolle i utviklingen av resistens i en rekke forskjellige maligniteter. Men mange studier ble utført på in vitro
nivå og kunne ikke gi den in vivo
informasjon om funksjonene til mirnas i kreft narkotika motstand. Her introduserte vi en dual reporter gen imaging system for invasivt overvåke den kinetiske uttrykk for miRNA-16 under chemoresistance i magekreft både in vitro Hotell og in vivo
. Menneskelig natriumjodid symporter (hNIS) og ildflue luciferase (Fluc) gener ble knyttet til å danne hNIS /Fluc dobbelt fusjon reporter genet og deretter generere human magekreft cellelinje NF-3xmir16 og dens multiresistens cellelinje NF-3xmir16 /VCR. Radiojodid opptak og Fluc luminescens signaler in vitro
korrelert godt med levedyktige celler. Luciferase aktiviteter og radiojodid opptak i NF-3xmir16 celler ble bemerkelsesverdig undertrykt av eksogen eller endogen miRNA-16. NF-3xmir16 /VHS-celler viste en signifikant økning av ^{131I opptak og luminescens intensitet i forhold til NF-3xmir16 celler. Radioaktiviteten fra in vivo
99mTc-pertechnetat bildebehandling og intensiteten fra bioluminescence avbildning ble også økt i NF-3xmir16 /VCR sammenlignet med i NF-3xmir16 tumorxenotransplantater. Videre bruker denne reporteren genet systemet, fant vi at etoposid (VP-16) og 5-fluorouracil (5-FU) aktivert miRNA-16 uttrykk in vitro Hotell og in vivo
, og oppregulering av miRNA-16 er p38MAPK avhengig men NF-kB uavhengig. Denne doble bilde reporter gen kan serveres som en roman verktøy for in vivo
avbildning av microRNAs i chemoresistance av kreft, samt for tidlig oppdagelse og diagnose i klinikken}

Citation. Wang F, Song X, Li X, Xin J, Wang S, Yang W, et al. (2013) Ikke-invasiv visualisering av mikroRNA-16 i Chemoresistance av magekreft Ved hjelp av en Dual Reporter Gene Imaging System. PLoS ONE 8 (4): e61792. doi: 10,1371 /journal.pone.0061792

Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania

mottatt: 21 november 2012; Godkjent: 13 mars 2013; Publisert: 17 april 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Program for National Basic Research and Development Program of China (973) under Grant No. 2012CB518101, 2011CB707702, Natural Science Foundation National av Kina under Grant nr. 81090272, 81090274, 81227901, Innovasjon Teamutvikling Grant av Kina Institutt Utdannings (2010CXTD01), 863 Program of China (2012AA02A603) og National Key Technology Support Program under Grant No. 2012BAI23B06. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser. Medforfatter Xiaoyuan Chen fungerer som redaktør for tidsskriftet. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.

Innledning

Magekreft er fortsatt den første ledende årsak til kreft dødsfall i Kina og den fjerde vanligste malignitet i verden til tross for en dramatisk nedgang i sin dødelighet og sykelighet i løpet av de siste tre tiårene [1]. Kjemoterapi har vært mye brukt til å behandle både resectable og avansert magekreft, som fører til forbedringer i total overlevelse samt livskvalitet for pasienter [2], [3]. Imidlertid svikter langvarig kjemoterapi ofte for å eliminere alle tumorceller på grunn av iboende eller ervervet multiresistens (MDR), som er den mest primære årsaken til tumorresidiv [4]. I dag er den MDR vært ansett som en multifaktoriell fenomen som involverer flere hovedmekanismer, inkludert økt metabolisme av legemidler, redusert opptak av vannoppløselige medikamenter, endret drug targets, redusert intracellulær legemiddelkonsentrasjon ved efflukspumper, endret cellesykluskontrollpunkter og induserte beredskaps responsgener å svekke apoptotiske trasé, etc product: [5]. Selv om MDR mekanismer har blitt grundig utforsket, de viktigste faktorer som bestemmer dette fenomenet fortsatt i stor grad uklart.

microRNAs (mirnas) er en ny klasse av endogene små ikke-kodende RNA (19-23 nukleotider) som negativt regulerer genekspresjon på post-transkripsjonelle nivå ved perfekt eller imperfekt baseparring med det 3 'ikke-translatert region (UTR) av mål-mRNA og derved indusere mRNA degradering eller translasjon undertrykkelse [6]. Foreløpig har nye studier antydet at det eksisterer og viktigheten av mirnas i utviklingen av anticancerlegemiddelresistens og mirnas ekspresjonsanalyse kan korreleres med utvikling av medikamentresistens [7] - [10], noe som indikerer at mirnas-mediert form av legemiddelresistens legger en annen mekanisme MDR. I vår forrige undersøkelse, ble det rapportert at to mirnas, miRNA-15b og miRNA-16, ble uttrykt forskjellig i en multiresistent human magekreft cellelinje SGC7901 /VCR og dens foreldrecellelinje SGC7901 [11]. Imidlertid ble det gjennomført bare på in vitro
nivå og kunne ikke gjenspeiler de in vivo
informasjon om funksjonene til mirnas i kreft narkotika motstand.

Nylige fremskritt i molekylær imaging teknikker tillater invasivt visualisering av normale og unormale cellulære prosesser i levende individer på molekylært nivå snarere enn på anatomisk nivå [12]. Flere ikke-invasive strategier, som å bruke et fluorescerende protein, luciferasereportergenet, nucleolin aptamer eller fluorescerende molekylær fyrtårn konjugert nanopartikler, er utviklet for å overvåke uttrykk mønstre av ulike mirnas under kreftutvikling, neurogenesis eller myogenesen in vitro Hotell og in vivo product: [13] - [16]. Denne studien var å innføre en ikke-invasiv metode for overvåking av miRNA-16 i chemoresistance av magekreft gjennom en dobbel bilde reporter gen system der menneskelig natriumjodid symporter (hNIS) og ildflue luciferase (Fluc) gener er knyttet til en fusjon genet for bioluminesens bildebehandling og ^{99mTc-pertechnetat gammakamera bilde in vivo
.}

Materialer og metoder

Dyr

Spesifikk patogen-fri 8-ukers -gamle kvinnelige BALB /c nakne mus ble hentet fra Shanghai Animal center i Kina og oppvokst i den fjerde Military Medical University dyresenter, Kina. Alle forsøksdyr ble holdt under spesifikke patogenfrie forhold. Dyret protokollene som brukes i denne studien ble godkjent av den fjerde Military Medical University Etikk Review Board. Alle prosedyrer ble utført i henhold til den fjerde Guide Military Medical University for omsorg og bruk av forsøksdyr formulert av National Society for Medical Research.

Reagenser og antistoffer

Mus monoklonalt antistoff mot hNIS (ab17795) ble kjøpt fra Abcam. Kanin polyklonale antistoff spesifikt til BCL-2 ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Bay11-7082 (NF-kB hemmer) og SB203580 (p38 MAPK-hemmer) ble hentet fra Beyotime Institutt for bioteknologi (Shanghai, Kina). De kreft narkotika inkludert vinkristin (VCR), etoposid (VP-16), mitomycin C (MMC), cisplatin (CDDP), ble 5-fluorouracil (5-FU) og Adriamycin (ADR) kjøpt fra Wolsen Bioteknologi (Xi'an, Kina). Den GV260-Fluc-puro lentivirus plasmid ble innhentet fra Shanghai GeneChem Company (Shanghai, Kina). Alle cellekulturmedier og serum ble kjøpt fra Gibco (Grand Island, New York).

Dual reporter gen plasmid konstruere

Den kodende sekvens av hNIS genet ble amplifisert ved PCR fra et plasmid vennlig levert av Dr. Weidong Yang (fjerde Military Medical University, Kina) ved hjelp av følgende primere:

hNIS-Fw: 5'-CGGGATCCCGCCACCATGGAGGCCGTGGAGACC-3 '

hNIS-Rev: 5'-CGGGTACCGGTACGAGGTTTGTCTCCTGCTGGTC-3 '

for bygging av en dobbel uttrykk vektor, cDNA av hNIS genet ble satt inn i BamH
jeg og Age
jeg restriksjonsenzymseter av en lentiviral vektor GV260 -Fluc-puro (Shanghai GeneChem, Kina) som koder for et Fluc genet under kontroll av ubiquitin-promoteren. Det resulterende dobbel-ekspresjonskonstrukt GV260-hNIS /Fluc ble videre anvendt for å danne GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 plasmid. Tre kopier av komplementære sekvenser mot miRNA-16 (3xmir16) ble innført etter stoppkodonet av den hNIS /Fluc fusjonsgenet for å generere GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 (figur 1A). En egge nukleotid sekvens av tilsvarende lengde til 3xmir16 ble også satt inn i 3'UTR av hNIS /Fluc fusjonsgenet for å få en kontroll konstruksjon (GV260-hNIS /Fluc-scramble. Den 3xmir16 sekvens eller rykke sekvens ble oppnådd ved annealing følgende oligonukleotider :

3xmir16-Fw: 5'-CGCCAATATTTACGTGCTGCTACGCCAATATTTACGTGCTG-CTACGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3 '

3xmir16-Rev: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCGTAGCAGCACGTAAATAT-TGGCGTAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3'

Scramble-Fw: 5 '- TCGTGGCGTCATTTCTTCAGAATCCGTCCTCCCAAGTACT-CAGTGTGCTAATGTCTATCGATACAA-3'

Scramble-Rev: 5'-TTGTATCGATAGACATTAGCACACTGAGTACTTGGGAGG-ACGGATTCTGAAGAAATGACGCCACGA

mage~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP cellekultur og stabil cellelinje generasjon

Menneskelig magekreft cellelinje SGC7901 og dens multiresistent variant SGC7901 /VCR (etableres og opprettholdes i vårt laboratorium som beskrevet [11]) ble dyrket i RPMI-1640 medium supplementert med 10% føtalt kalveserum og 100 enheter penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen ). For å opprettholde den MDR-fenotypen, vinkristin (med sluttkonsentrasjon på 1 pg /ml) ble tilsatt til kulturmediet for SGC7901 /VCR-celler. For å generere stabil cellelinje, lentivirus vektor GV260-hNIS /Fluc eller GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 ble først kotransfektert inn 293T celler med emballasje plasmider ( gag, pol, VSV-g
). Vekstmediet ble forandret ved 6 timer etter transfeksjon og lentivirus-inneholdende supernatant ble høstet ved 48 timer etter transfeksjon. Høstes supernatantene ble sentrifugert ved 4000 g i 10 min for å pelletere celleavfallet. Konsentrert virus ble titrert på 293T celler. SGC7901 celler og SGC7901 /VHS-celler ble transduced med GV260-hNIS /Fluc og GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 virus henholdsvis på et mangfold av infeksjon (MOI) på 10. Da cellene ble screenet med puromycin i 3 uker og cellekolonier var samles til utvidet for neste trinn eksperimenter

RNA oligonukleotider og transfeksjon

Den miRNA-16 og negativ kontroll (NC) RNA oligonukleotider ble syntetisert (Shanghai GenePharma, Kina) ved hjelp av følgende sekvenser.:

miRNA-16 fornuft: 5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3 '

miRNA-16 anti-sense: 5'-CGCCAAUAUUUACGU-GCUGCUA-3'

NC forstand: 5 '-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3'

NC anti-sense: 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3 '

Før transfeksjon ble SGCC7901 celler sådd på 1 x 10 ^{5 celler per brønn i et 24-brønns plate og vokse i 24 timer. Transfeksjon ble utført med Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Alt transfeksjon ble utført i tre eksemplarer.}

Kvantitativ sanntids-PCR (QRT-PCR-analyse)

Total RNA ble isolert fra de dyrkede celler ved anvendelse av Trizol (Invitrogen). RT ble utført med PrimerScript RT Regent Kit (Takara, Japan) og qPCR ble utført med Fast SYBR Grønn Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, California) og ABI StepOne Plus Real-time PCR system (Applied Biosystems) i henhold til produsentens protokoll . PCR-produktene ble analysert på 3% agarosegeler. Den relative mengde av miRNA-16 ble normalisert til U6 snRNA. Og den relative mengde av Fluc ble normalisert til GAPDH-genet. Den fold-endring for miRNA-16 eller Fluc genet fra eksperimentgruppen i forhold til kontrollgruppen ble beregnet ved hjelp av to ^{-ΔΔCt metode, hvor ΔΔCt = ΔCt eksperiment - ΔCt kontroll og ΔCt = Ct miRNA - Ct U6 eller ΔCt = Ct Fluc - Ct GAPDH. PCR ble utført i triplikat. Primere som brukes for stilk-løkke RT-PCR for MIR-16 er oppført som følger:}

U6 Fw: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 '

U6 Rev: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3 '

MIR-16 RT 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGG-ATACGACCGCCAAT-3'

MIR-16 Fw: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3 '

MIR-16 Rev: 5 '-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'

Fluc-Fw: 5'-GGTCCTATGATTATGTCCGGTTATG-3 '

Fluc-Rev: 5'-ATGTAGCCATCCATCCTTGTCAAT-3'

GAPDH-Fw: 5'-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3 '

GAPDH-Rev: 5'-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3'

Western blot-analyse

SGC7901 cellene ble vasket tre ganger med PBS og deretter lysert i kald lyseringsbuffer (20 mM NaCl, 200 mM Tris-HCl [pH 7,4], 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 1% Triton X-100 og 1% aprotinin) i 30 minutter på is. Cellelysater ble deretter sentrifugert ved 12000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble oppsamlet og identiske mengder proteiner ble oppløst ved 8% SDS-PAGE og deretter overført til nitrocellulosemembraner. Membranene ble inkubert i blokkeringsløsning inneholdende 5% BSA i 1 time ved romtemperatur, og deretter immunoblottet med angitte antistoffer. Immunreaktive bånd ble visualisert ved hjelp av en forbedret kjemiluminescens (Amersham Pharmacia Corp, Piscataway, NJ).

MTT analyse

For å bestemme vekstratene av NF-tom, NF-3xmir16 og NF-3xmir16 /VCR-celler, ble disse tre typer celler inokulert i 96-brønners plater med de samme tall (5000 celler) per brønn. På forskjellige tidspunkter (24, 48, 72, 96 timer), 25 ul 5,0 mg /ml sterilfiltrert 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5- difenyl-tetrazolium-bromid (MTT; Sigma) ble tilsatt til hver brønn. Ikke-omsatt fargestoff ble fjernet etter 4 timers inkubering, og de uoppløselige formazankrystaller ble oppløst i 100 ul dimetylsulfoksid (DMSO). Absorbansen ved 570 nm (referanse bølgelengde, 630 nm) ble målt med en Synergy II multimode mikroplateleser (BioTech Instruments, VT).

Radioaktivt jod opptaksanalyse

For å identifisere forholdet mellom jod opptak og celle nummer, ble en fortynningsserie av celler inokulert i 24-brønners plater. Etter 12 timers inkubering ble ^{131I opptak nivå undersøkt. Jodidet opptak ble bestemt ved å inkubere cellene med 500 mL Hanks 'balanserte saltløsning (HBSS) inneholdende 0,5% bovint serumalbumin med 37 kBq av bærerfritt Na 131I og 10 mM Nal i 30 min. Etter inkubasjon ble cellene vasket to ganger så raskt som mulig med 1 ml iskald HBSS-buffer. Cellene ble løsnet med 200 ul trypsin, og radioaktiviteten ble målt ved anvendelse av en γ-teller (Perkin-Elmer). For å evaluere den funksjonelle ekspresjon av hNIS i reportergen system, ble NF-3xmir16-celler sådd ut i 1 x 10 5 celler pr brønn i en 24-brønn plate på dag før transfeksjon, deretter miRNA-16 og NC oligos ble transfektert . 24 timer senere ble den jod opptak målt som beskrevet ovenfor.}

In vitro
bioluminesens bildeanalyse

For å identifisere forholdet mellom luminescens signaler og celle tall, en fortynningsrekke av celler ble inokulert i 24-brønners plater. Etter 12 timers inkubering ble hver brønn vasket med fosfat-beffered saltvann (PBS). Da D-Luciferin (Xenogen) ved en konsentrasjon på 0,5 mmol /l ble tilsatt umiddelbart før analysen. Bioluminesens ble målt med en IVIS 100 Imaging system (Xenogen) og analysert ved hjelp av levende bilde programvare versjon 2.50 (Xenogen). For å evaluere den funksjonelle ekspresjon av Fluc i reportergen system, ble NF-3xmir16-celler sådd ut i 1 x 10 ^{5 celler pr brønn i en 24-brønn plate på dag før transfeksjon, deretter miRNA-16 og NC oligos ble transfektert . 24 timer senere ble bioluminescence analysen måles som beskrevet ovenfor.}

Bioluminescent og 99mTc-perteknetat bildebehandling i nakne mus

Like tall (5 × 10 ^{6 celler) av NF-tom og NF-3xmir16, eller NF-3xmir16 /VCR og NF-3xmir16 celler, var xenopodet subkutant i venstre og høyre bakben flanke av hver naken mus som angitt i resultater. Bioluminescent avbildning ble kjøpt opp en dag etter celle injeksjon. Alle mus ble bedøvet med 2,5% isofluran gassen i oksygen ved en strømningshastighet på 1,5 l /min. En vandig oppløsning av D-luciferine (150 mg /kg kroppsvekt) ble injisert perkutant 10 min før avbildning. Hele kroppsbilder for Fluc signalene ble kjøpt for 2 min og Living Bilde programvare (Xenogen) kjørte for å få selvlysende bilder. En ROI ble valgt manuelt via signalintensiteten. Bioluminesens signaler er uttrykt som fotoner per sekund per kubikkcentimeter per steradian (p /sek /cm 2 /sr) innenfor en ROI.}

For atom bildebehandling, svulst bærende mus ble injisert intraperitonealt med 18,5 MBq av ^{99mTc-pertechnetat på 2 uker etter celle injeksjon. 30 minutter etter injeksjon ble dyret plassert i en spredt-liggende stilling på sengen av SPECT skanneren (Symbia T2, Siemens). Anestesi ble utført med 1% -2% isofluran i 100% O _{2 under injeksjon og bildebehandling. Alle bildene ble rekonstruert med en to-dimensjonal bestilt-undergrupper forventning maksimal algoritme. Aktivitet ble kvantifisert ved å vise de regioner av interesse (ROI) i tumorene og arealet av ROI ble holdt konstant for alle nukleære og optiske bilder. Etter bioluminescent og 99mTc-pertechnetat avbildning, ble tumorene oppsamlet og veiet.}}

Statistisk analyse

Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Data som viser sammenligninger mellom to gruppene ble vurdert ved hjelp av t-test. Sammenligninger mellom mer enn to grupper ble vurdert ved anvendelse av variansanalyse (ANOVA) med det passende posthoc testing. P-verdier. ≪ 0,05 ble ansett som statistisk signifikant

Resultater

Etablering av magekreft cellelinjer stabilt uttrykker hNIS og Fluc gener

For å generere en fusjon reporter gen (GV260- hNIS /Fluc, referert til NF-tom), den hNIS cDNA ble klonet inn i en lentivirus-vektor (GV260-Fluc-puro) som koder for et Fluc gen for å generere et fusjonsprotein, som var under kontroll av ubiquitin-promoteren. Deretter tre kopier av komplementære sekvenser mot miRNA-16 (3xmir16) ble innført etter stoppkodonet av den hNIS /Fluc fusjonsgenet for å generere en annen konstruksjon (GV260-hNIS /Fluc-3xmir16, referert til NF-3xmir16) (figur 1A). En egge nukleotid sekvens av tilsvarende lengde til 3xmir16 ble også satt inn i 3'UTR av hNIS /Fluc fusjonsgenet for å få en kontroll konstruksjon (GV260-hNIS /Fluc-scramble, referert til NF-scramble). In vitro
bioluminesens bilde viste at Fluc genaktivitet fra NF-tomme celler var lik som fra NF-krafse celler (Figur S1 A). Så vi velger NF-tom konstruere i videre studier. To cellelinjer, en MDR human magekreft cellelinje SGC7901 /VCR og dens foreldrecellelinje SGC7901, ble omformet med lentivirus inneholder NF-tomt eller NF-3xmir16 genet henholdsvis å etablere tre stabile cellelinjer NF-tom /SGC7901, NF -3xmir16 /SGC7901 og NF-3xmir16 /SGC7901 /VCR (referert til NF-tom, NF-3xmir16 og NF-3xmir16 /VCR). Først spilte vi MTT analyse for å måle vekstratene av disse tre cellelinjer (figur S1B). Da perfomed vi qPCR analyse for å undersøke de integrerte kopier av reporter konstruksjoner i de tre cellelinjer (figur S1C). In vitro
bioluminesens imaging (figur 1B) og western blotting (figur 1C) ble videre utført for å demonstrere vellykket uttrykk for Fluc og hNIS gener i disse tre cellelinjer.

Lineær korrelasjon av Fluc og hNIS transgene aktiviteter med celletall in vitro

For å evaluere Fluc og hNIS transgene aktiviteter i celler, utførte vi in vitro
bioluminescence bildebehandling og ^{131I radiojodid opptaksforsøk i en fortynningsrekke av NF-3xmir16 cellelinjer. Som vist i figur 1D, i henhold til økning i antall celler, akkumulering av luminescens også økt. Bioluminesens signalene ble funnet å korrelere godt med celletall (γ 2 = 0,9990) (figur 1E). I mellomtiden, 131I opptaket ble også økt med celle tall (figur 1F). Den radiojodid opptaket ble observert godt korrelert (γ 2 = 0,9543) med celle tall (figur 1G). Fordi Fluc ble smeltet sammen med hNIS, et godt samsvar mellom bioluminescence intensitet og 131I radioaktivitet ble notert i cellene i henhold til lineær regresjonsanalyse (γ 2 = 0,9339) (figur 1 H).}

Validering av miRNA-16 aktiviteter via
reportergenet system

for å teste om NF-3xmir16 reporter vektor som inneholder miRNA-16 target-sekvenser ble undertrykt av eksogene miRNA-16, undersøkte vi Fluc og hNIS aktivitet etter innføring av miRNA-16. Sammenlignet med de celler transfektert med NC oligonukleotider, ble Bioluminescens signal redusert med 35% i cellene transfektert med miRNA-16 (figur 2A og 2B). Og ^{131I radiojodid opptak i miRNA-16 transfekterte cellene var omtrent 70% av det i NC transfekterte celler kvantifisert ved radioaktiv telling (figur 2C). Og Fluc og hNIS aktivitet ble redusert på en doseavhengig måte (figur S1D-F). Disse data indikerte at NF-3xmir16 reporter konstruksjon kan være modulert av miRNA-16.}

Påvisning av endogen miRNA-16 uttrykk in vitro Hotell og in vivo

for å oppdage den endogene miRNA-16 uttrykksnivået i magekreftceller in vitro
, like tall (1 × 10 ^{6) av NF-tom og NF-3xmir16 celler ble sådd og deretter den Fluc og hNIS aktivitet ble undersøkt. Som vist på figur 2D og 2E, ble Fluc aktivitet som følge av NF-3xmir16 celler redusert med omtrent 50% av endogen miRNA-16 sammenlignet med det fra NF-tomme celler. Og hNIS aktivitet fra NF-3xmir16-celler ble også redusert med ca. 40% som respons på endogen miRNA-16 i motsetning til den fra NF-tomme celler (figur 2f). Mangelen på undertrykkelse av Fluc eller hNIS aktiviteter observert i NF-tomme celler er i respekt at det var ingen miRNA-16 målse i NF-tom konstruere.}

Den doble bilde reporter gen system aktivert i vivo
visualisering av endogen miRNA-16 uttrykk i magekreftceller. Like tall (1 × 10 ^{7) av NF-tomme og NF-3xmir16 celler var xenopodet subkutant i venstre og høyre bakben flankene av hver naken mus (n = 6) og deretter bioluminescent bildebehandling og 99mTc-pertechnetat gammakamera bildebehandling ble kjøpt. Som vist i figur 2G, luminescens intensitet fra implantert NF-3xmir16 celler var omtrent 55% lavere enn den fra NF-tom-celler, på samme måte for differansen av luciferase-aktivitet målt in vitro plakater (figur 2D og 2E). Etter intraperitoneal injeksjon av 99mTc-pertechnetat på 18,5 MBq, ble gamma-kameraavbildning utført. I motsetning til NF-tom svulster, som viste fremtredende opptak av 99mTc-pertechnetat, NF-3xmir16 svulster viste ubetydelig opptak (figur 2 H), som indikerer endogen miRNA-16 redusert hNIS uttrykk. Fysiologiske opptak ble også observert på nettstedene til skjoldbruskkjertelen, mage og blære, der hNIS normalt uttrykt. Regioner av interesse (ROI) analyse viste at hNIS aktiviteten sunket betraktelig i NF-3xmir16 xenografter sammenlignet med i NF-tomme xenografter (Figur 2 H). Etter bildebehandling, vi samlet og veid NF-tomme og NF-3xmir16 tumorer (figur S1G). Resultatene viste at de hadde samme vekt, indikerte at de forskjeller i signalintensitet er faktisk på grunn av endogen miRNA-16 funksjon, men ikke celle tall.}

Visualisering av ekspresjon endring av miRNA-16 i MDR magekreftceller in vitro Hotell og in vivo

uttrykket endring av miRNA-16 i legemiddelresistente magekreftceller ble oppdaget via
Fluc og hNIS aktivitet ved bioluminesens bildebehandling og ^{131I radiojodid opptak analyser. Både Fluc aktivitet (figur 3A og 3B) og hNIS aktivitet (figur 3C) økte med ca. 1,5 ganger i NF-3xmir16 /VCR-celler sammenlignet med det i NF-3xmir16 celler, noe som antydet at miRNA-16 ble nedregulert i NF-3xmir16 /VCR celler. For å bekrefte resultatene oppnådd ved reportergen system, ble kvantitativ RT-PCR (Q-PCR) utføres for å analyse den differensielle ekspresjonen av miRNA-16 i disse to cellelinjene. I henhold til reportergenet systemdataene viste Q-PCR ble redusert miRNA-16-nivåer i NF-3xmir16 /VCR i forhold til sitt motstykke NF-3xmir16 celler (figur 3D).}

For ikke-invasiv kvantitativ overvåkning av miRNA- 16 differensial uttrykk i MDR magekreftceller i vivo
, bioluminescent bildebehandling og ^{99mTc-pertechnetat gammakamera bildebehandling ble utført. Den selvlysende avbildning vist at luminescens signalene var ca 1,7 fold økning i NF-3xmir16 /VCR xenografter versus NF-3xmir16 xenografter (Figur 3E), i samsvar med økningen av luciferase aktivitet målt in vitro plakater (figur 3A og 3B). Injeksjon av 99mTc-pertechnetat og oppkjøpet av gammakamera bildebehandling indikerte at en betydelig høyere akkumulering av 99mTc-perteknetat ble observert i NF-3xmir16 /VCR xenografter enn at i NF-3xmir16 xenografter. Fysiologisk 99mTc-pertechnetat ansamlinger ble også observert i skjoldbruskkjertelen, blære og mage (figur 3F). Og NF-3xmir16 og NF-3xmir16 /VCR svulster hadde de samme vektene (figur S1H).}

VP-16 og 5-FU oppregulering av miRNA-16 uttrykk invasivt avbildes med dual reporter genet system

for å finne ut om andre kreft narkotika kan endre miRNA-16 uttrykk profil, ble fem kliniske legemidler for magekreft lagt til NF-3xmir16 celler etterfulgt av in vitro
bioluminescence bildebehandling og ^{131I radiojodid opptak analyser. Resultatene viste at luminescens intensitet (figur 4A og 4B) eller celle jodid opptak (figur 4E) ble kraftig redusert eksponering for VP-16, 5-FU og CDDP, men ikke til MMC og ADR-behandling sammenlignet med de ubehandlede celler.}

årsakene til redusert signal observert i VP-16, 5-FU og CDDP behandling kan være at narkotika aktiverte endogen miRNA-16 uttrykk eller hemmet cellevekst selv forårsaket celledød. For å utelukke den siste muligheten, ble de fem narkotika lagt til NF-tom celler som ikke inneholder miRNA-16 målse i konstruksjonen. in vitro
Bioluminescens avbildnings Resultatene viste at VP-16 og 5-FU hadde noen hemmende virkning på luminescens intensitet, mens det fremdeles CDDP reduserte luminescens-signalet (figur 4C og 4D), som indikerer at CDDP kan hemme cellulær vekst, men ikke aktivere endogen miRNA-16 uttrykk. På den annen side, MMC og ADR ble funnet å forsiktig øke luminescence intensitet i både NF-3xmir16 og NF-tomme celler (figur 4A-D), som kan resultere fra å fremme celleformering.

For å verifisere at miRNA-16-aktivering deltok i kreft effekter fra VP-16 og 5-FU, Q-PCR ble utført for å bestemme den miRNA-16-nivå i NF-3xmir16 celler eksponering for anticancer legemidler behandlinger. Følgelig ble miRNA-16 uttrykk oppregulert betydelig etter VP-16 eller 5-FU behandlinger i SGC7901 celler sammenlignet med ubehandlede kontrollceller, mens MMC, ADR og CDDP hadde mindre effekt på miRNA-16 uttrykk (Figur 4F).

Økt miRNA-16 uttrykk av VP-16 og 5-FU er involvert i p38 MAPK men NF-kB signalveien

i likhet med modulering av protein-kodende RNA gener, vises transkripsjon av miRNA gener til reguleres av flere signalveier. Aktivering av NF-kB eller MAPK signalveier er en vanlig reaksjon etter cellegifter [17], [18]. Derfor hypotese vi at oppregulering av miRNA-16 kan være et resultat av økt NF-kB eller MAPK-aktivering etter VP-16 eller 5-FU-behandling. For å belyse rollen til disse signalveier i VP-16 og 5-FU-indusert transaktivering av miRNA-16, ser vi først målte luminescens intensitet i NF-3xmir16 cellene i respons til VP-16 og 5-FU i nærvær eller fravær farmakologiske hemmere til NF-kB eller p38 MAPK. Behandling av celler med en spesifikk NF-kB-inhibitor, Bay 11-7082, hadde ingen effekt på den luminescens signal i forhold til de legemiddelbehandlede celler uten inhibitorer (fig S2).

I motsetning til dette, behandling med en spesifikk p38 MAPK-inhibitor, SB203850, markert reddet reduksjon av Bioluminescens (figur 5A og 5B) eller jodid opptak (figur 5C) med VP-16 og 5-FU, sammenlignet med de behandlede kontrollceller. For å bekrefte miRNA-16 ekspresjon nivå i nærvær av SB203850, sanntid PCR ble utført, og resultatene viste at inhiberende av p38 MAPK drastisk undertrykket VP-16 og 5-FU-indusert miRNA-16 oppregulering (figur 5D), noe som indikerer at den økte miRNA-16 uttrykk ved VP-16 og 5-FU er involvert i p38 MAPK signalveien.

Vår tidligere studie har vist at BCL-2 protein er et direkte mål gen av miRNA-16 i utvikling av MDR i SGC7901 magekreftceller [11]. For å teste om BCL-2 er involvert i VP-16 og 5-FU stimulering av miRNA-16 via
p38 MAPK veien, bestemt vi BCL-2 protein nivå ved western blot analyse. Som vist i figur 5E og 5F, VP-16 og 5-FU signifikant redusert Bcl-2-protein nivå med omtrent 50% sammenlignet med de ubehandlede kontrollceller i fravær av SB203850. Ved behandling sammen med SB203850, reduksjon av BCL-2 protein ble drastisk svekket, noe som tyder på viktigheten av p38 MAPK-aktivering i VP-16 og 5-FU-indusert nedregulering av BCL-2 protein.

in vivo
overvåking av forbedret miRNA-16 uttrykk ved VP-16 og 5-FU

for ikke-invasiv monitorering av forbedret miRNA-16 uttrykk indusert av VP-16 og 5-FU, NF-tom og NF -3xmir16 celler ble podet på det venstre og høyre bakben hos hver mus (n = 6), henholdsvis. For å unngå Bioluminescens signal fra NF-tom forstyrrer den fra NF-3xmir16 i løpet av medikamentbehandling, forskjellig antall NF-tomme (1 x 10 ^{5-celler) og NF-3xmir16 (1 x 10 7-celler) ble podet. Som vist i figur 6, var signifikant redusert bioluminescens intensiteten observert i NF-3xmir16 xenotransplantater etter VP-16 eller 5-FU-behandling sammenlignet med nontreatment. Spesielt hos mus behandlet med VP-16, Bioluminescens signal redusert med ca 40% i NF-3xmir16 xenotransplantater, mens en svak økning i NF-tomme xenotransplantater versus forbehandlede bilder (figur 6A og 6B), likeledes for forskjellen av luminescens intensitet forårsaket av VP-16 in vitro plakater (Figur 4A-D).}

• PLoS ONE: mikroRNA-219-2-3p Fungerer som en tumor suppressor i magekreft og er regulert av DNA Metylering
• PLoS ONE: Sammenhengen mellom glutation S-transferase T1 Null Genotype og Gastric Cancer Risk: En meta-analyse av 48 studier