Bakgrunn
utskilt protein syrlig og rik på cystein (SPARC) er et glykoprotein som fungerer for å hemme angiogenese, spredning, og invasjonen i ulike typer kreft. Evnen til SPARC- til å modulere neovaskularisering er antatt å være formidlet delvis av sin evne til å modulere ekspresjon av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og matriksmetalloproteinaser (MMP'er). I denne studien ønsket vi å bestemme effekten av SPARC uttrykk i magekreftceller på spredning og angiogenese in vitro Hotell og in vivo Vi evaluerte uttrykk for SPARC i syv menneskelige mage kreft cellelinjer. Da har vi etablert et stabilt transfektert SPARC overexpressed cellelinje (BGC-SP) og et stabilt transfektert SPARC knock-down cellelinje (HGC-sh). Effekten av SPARC overekspresjon og SPARC lyddemping ble studert ved å undersøke kapillær dannelsen av HUVECs in vitro Hotell og en dorsal hud-fold kammer modell in vivo endogen SPARC- overekspresjon hemmet ekspresjon av VEGF og MMP-7, samt angiogenese indusert av BGC-SP-celler. Tilsvarende SPARC- stanse øket ekspresjon av VEGF og MMP-7, samt angiogenese indusert av HGC-SH-celler. Forhøyet angiogenese indusert av SPARC stanse i HGC-sh celler ble redusert ved VEGF ble nøytralisert av antistoffer, og MMP-7 ble slått ned in vitro SPARC undertrykker angiogenese av magekreft ved å nedregulere uttrykket av VEGF og MMP-7 Citation. Zhang JL, Chen GW, Liu YC, Wang PY, Wang X, Wan YL, et al. (2012) utskilt protein syrlig og rik i Cysteine (SPARC) Undertrykker angiogenese ved å nedregulere uttrykket av VEGF og MMP-7 i magekreft. PLoS ONE 7 (9): e44618. doi: 10,1371 /journal.pone.0044618 Redaktør: Rajesh Mohanraj, UAE University, De forente arabiske emirater mottatt: 9. juni 2012; Godkjent: 06.08.2012; Publisert: 05.09.2012 Copyright: © Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Natural Science Foundation National of China (No. 30901417 /H1617). http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer Innledning Blant kreftrelaterte dødsfall, rangerer magekreft andre over hele verden etter lungekreft; nesten to tredjedeler av tilfellene forekommer i utviklingsland, inkludert 42% fra Kina [1]. Angiogenese er en viktig prosess i magekreft; derfor er regulatoriske og signalmolekyler som modulerer angiogenese blir fokus for dagens forskning. Angiogenese er ikke en aktiv prosess i seg selv; den styres av noen angiogene faktorer og noen hemmere av angiogenese. Utskilt protein sure og rik på cystein (SPARC-), også kjent som Osteonectin eller BM-40, er en mangesidig utskilt glykoprotein som uttrykkes ved mange forskjellige typer av celler og er forbundet med bendannelse, fibrose og reparasjon av vev. Nyere studier viser at SPARC- modulerer proliferasjon, apoptose, invasjon og angiogenese i forskjellige typer kreftceller, men rolle i SPARC- tumorgenesen er komplisert og synes å være celletype spesifikk grunn av sine forskjellige funksjoner i en gitt mikromiljø [2]. SPARC fungerer som en tumor suppressor i bryst, neuroblastom, bukspyttkjertelen, eggstokkene og lungekreft [3]. Ovarian cancer i SPARC--null-mus økte betydelig større enn det som i vill-type dyrene med forstørrede nivåer av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og matriks-metalloproteinaser (MMP) [4]. Ved å undertrykke tumor vaskularitet gjennom undertrykkelse av VEGF-ekspresjon og sekresjon, SPARC- hemmet vekst gliom [5]. SPARC- binder til VEGF, og dermed hemme VEGFR fosforylering, mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK) aktivering og VEGF-indusert DNA-syntese [6]. Imidlertid er rollen til SPARC- i angiogenese er også celletype spesifikk, noe som endrer signaloverførings hendelser som reaksjon på spesielle cellulære miljøer [7]. VEGF stimulerer angiogenese, og er den viktigste signalet protein som produseres av cellene [8]. MMP'er spiller viktige roller i tumorutvikling, ikke bare i å bryte ned den ekstracellulære matriks, men også ved regulering av angiogenese. MMP-7, som er den minste molekylvekt på alle MMP-familien, har vist seg å akselerere proliferasjon av human navlestrengvene endotelialceller (HUVECs) på en doseavhengig måte in vitro product: [9]. Den primære funksjon av SPARC i angiogenese av magekreft cellelinjer er fortsatt uklart. Derfor, i denne studien, hypotese vi at SPARC kan modulere spredning og angiogenese ved å regulere VEGF og MMP-7 uttrykk i magekreftceller. For å teste disse hypotesene, testet vi uttrykk for SPARC i sju magekreftcellelinjer. Så, for å vurdere effekten av endret SPARC på mage kreftceller, etablerte vi et BGC-SP-klone som overexpressed SPARC og en HGC-sh-klone der den endogene SPARC ble slått ned. uttrykk av SPARC i Cultured Gastric cancer Celler Vi evaluerte uttrykk for SPARC i flere menneskelige mage kreft cellelinjer. Western blotting viste at SPARC var undectable i AGS, MKN45, NCI-N87 og BGC-823 cellelinjer, uttrykte imidlertid SGC-7901 cellelinje lavt nivå av SPARC og HGC-27, MGC-803 cellelinjer uttrykte høyt nivå av SPARC ( Figur 1A). Overuttrykte og Hemming av endogen SPARC i magekreft cellelinjer Western blotting viste at 43 kDa bånd som tilsvarer den SPARC protein øker betydelig hos BGC-SP (BGC celler uttrykke SPARC cDNA) celler sammenlignet med foreldre (BGC-P) og kontrollceller transfektert med tom vektor (BGC-EV) (P < 0,05); SPARC ble hemmet av nesten to tredjedeler i HGC-sh celler (HGC celler som uttrykker SPARC-shRNA) sammenlignet med HGC-P og HGC-EV celler (P < 0,05, figur 1B). RT-PCR indikerte at SPARC- mRNA-ekspresjon i BGC-SP-celler ble øket sammenlignet med BGC-P og BGC-EV-celler (P < 0,05); SPARC mRNA uttrykk i HGC-sh redusert med nesten 80% sammenlignet med HGC-P og HGC-EV celler (P < 0,05, figur 1B). SPARC Overuttrykte Reduserer spredning av magekreft cellelinjer for å avgjøre om endret SPARC uttrykk påvirket spredning av magekreft cellelinjer, veksten av transfekterte celler ble sammenlignet med de av foreldre og tomme vektor kontroller. Dataene viste at veksten av BGC-SP-celler ble hemmet sammenlignet med BGC-P og BGC-EV-celler etter 8 dagers dyrking (P < 0,05); veksten av HGC-sh celler ble økt noe sammenlignet med HGC-P og HGC-EV celler (P < 0,05, figur 1C). SPARC Overuttrykte i Gastric Cancer Cell Lines Reduserer Angiogenese in vitro for å forstå effekten av endret SPARC uttrykk på angiogenese i mage kreft cellelinjer, ble HUVECs inkubert i kondisjonert medium. Den BGC-SP-supernatant induserte HUVECs til å differensiere til kapillær-lignende strukturer i løpet av 36 timer (2564,5 ± 553,1 um, P < 0,05) til en mindre grad enn supernatanten fra BGC-EV-celler (5002,4 ± 665,7 mikrometer) og BGC-P-celler (5417,3 ± 784,25 mikrometer, figur 2A). Den HGC-sh supernatant indusert HUVECs å differensiere i kapillær-lignende strukturer innen 36 timer (7024,9 ± 923,1 nm, P < 0,05) til en sterkere grad enn supernatanten fra HGC-EV celler (4456,2 ± 554,2 mikrometer) og HGC-P-celler (4023,4 ± 665,2 nm, figur 2A). Kvantifisering av den gjennomsnittlige rørlengden indikerte at røret lengden av HUVECs i kondisjonert media fra BGC-SP ble redusert med ca. 52,7% sammenlignet med kontrollceller; tube lengde HUVECs i kondisjonert medium fra HGC-sh kloner ble økt 74,6% sammenlignet med kontrollceller (Figur 2A). Rygg vindu modellen viste at BGC-SP celler hadde en 40,4% nedgang i tumour- indusert microvessels sammenlignet med kontrollceller (p 0,05). HGC-SH-celler i rygghuden-fold kammer resulterte i en 73,2% økning i tumor-indusert mikrokar, med et større antall små blødninger flekker, sammenlignet med kontrollceller (P < 0,05 figur 2B). Resultatene viste tydelig at SPARC overekspresjon i magekreft hemmet angiogenese in vitro Hotell og in vivo for å bestemme effekten av SPARC overekspresjon på MMP-7 og VEGF, kvantitativ real-time PCR og Western blotting ble utført. Resultatene viste at MMP-7 og VEGF-ekspresjon ble negativt regulert av SPARC- uttrykk. I BGC-SP-celler, ble nivåene av MMP-7 mRNA, MMP-7-protein, VEGF mRNA og VEGF protein hemmet med 87,2%, 68,9%, 48,4% og 58,6%, henholdsvis, sammenlignet med tom vektor transfekterte celler. I HGC-SH-celler økte MMP-7 mRNA nivå 11.6-ganger, økte MMP-7 proteinnivået 8,1-fold, økte VEGF mRNA nivå 8,8-fold, og VEGF-proteinnivå øket 3,2 ganger sammenlignet med tom vektor-celler (figur 3A, B). For å avgjøre om MAPK signalveien ble regulert av SPARC, SAPK /JNK, ERK1 /2 og p-38 nivåer ble vurdert av western blotting. Resultatene viste at nivåene av p-ERK1 /2 var signifikant redusert i BGC-SP-celler og forhøyet i HGC-SH-celler i sammenligning med deres kontrollceller (figur 3C). for å bekrefte at de pro-angiogene effektene sett med nedsatt SPARC uttrykk skyldes økt MMP-7 og VEGF uttrykk og ikke til nivåer av SPARC selv, HUVECs ble inkubert i kondisjonert medium høstet fra HGC-sh celler med eksogent lagt rekombinant humant SPARC (rhSPARC, 0,3 mikrogram /ml). Våre data antyder at det å tilsette eksogen SPARC- ikke inhiberer kapillær-lignende strukturer av HUVECs sammenlignet med HGC-sh (figur 4), i motsetning til den anti-angiogene responsen observert med endogen ekspresjon av SPARC- i BGC823 celler (figur 2). for ytterligere å karakterisere rollen til VEGF og MMP-7 i SPARC--mediert angiogenese modulasjon, MMP-7-shRNA og 1 ug /ml nøytraliserende VEGF-antistoff (Chemicon, Temacula, CA, USA) ble anvendt for HGC-sh kloner motvirke funksjoner av MMP-7 og VEGF. Vi har undersøkt muligheten av MMP-7 uttrykk i HGC-sh celler til å modulere angiogenese in vitro for å bestemme funksjonen av forhøyet VEGF uttrykk indusert av SPARC stanse, VEGF i det kondisjonerte medium av HGC-sh og HGC-sh + MMP7-sh cellene ble nøytralisert ved VEGF-antistoff (1 ug /ml). Resultatene viste at kapillær dannelsen av HUVECs ble redusert betydelig i HGC-sh supernatant som inneholder VEGF nøytraliserende antistoff sammenlignet med supernatant fra HGC-sh celler alene (HGC-sh + anti-VEGF vs Serum-fritt kondisjonert medium høstet fra HGC-P, HGC-EV, HGC-sh med eller uten rhSPARC (0,3 ug /ml) og HGC-sh + MMP7-sH-celler ble konsentrert ved ultrafiltrering rør (Millipore, Bedford, MA , USA) under de samme betingelser. Western blotting viste at konsentrasjonen av SPARC i HGC-sh celler med 0,3 mikrogram /ml rhSPARC inmedium var like bra som den HGC-P supernatant (figur 4A). for å vurdere den terapeutiske effekten av SPARC uttrykk, BGC-P, BGC-EV, BGC-SP celler eller HGC-P, HGC-EV, HGC-sh celler ble injisert subkutant i nakne mus. Det var ingen signifikant forskjell i størrelse mellom BGC-P (n = 6; bety tumorvolumet = 2004 ± 63 mm 3), BGC-EV (n = 6; bety tumorvolumet = 1856 ± 69 mm 3 ) xenografter. En betydelig reduksjon (39,1%) i gjennomsnittlig tumorvolumet ble funnet i dyr implantert med BGC-SP xenografter (n = 6; bety tumorvolumet = 1130 ± 55 mm 3) sammenlignet med dyr implantert med BGC-EV xenografter ( P < 0,05, figur 5). Det var ingen signifikant forskjell i størrelse mellom HGC-P (n = 6; bety tumorvolum = 1605 ± 63 mm 3), HGC-EV (n = 6; bety tumorvolum = 1708 ± 82 mm 3 ) xenografter. En betydelig økning (50,3%) i midlere tumorvolum ble funnet i dyr implantert med HGC-sh xenotransplantater (n = 6; bety tumorvolum = 2412 ± 75 mm 3) sammenlignet med dyr implantert med HGC-EV xenotransplantater ( P <. 0.05, figur 5) For å vurdere SPARC, VEGF, MMP-7 uttrykk in vivo Diskusjoner For å undersøke hvilken rolle SPARC i magekreft, vi først testet uttrykk for SPARC i syv cellelinjer av magekreft. De fleste cellelinjer uttrykte ikke, eller bare uttrykt lavt nivå av SPARC. For å finne ut hvilken rolle SPARC i vekst og angiogenese av magekreft, etablerte vi BGC-SP-klone som ble stabilt transfektert med en SPARC cDNA vektor, og HGC-sh-klone som ble stabilt transfektert med en shRNA vektor rettet mot SPARC mRNA. SPARC- ekspresjon økt betydelig i BGC-SP-klonen og redusert i HGC-sh-klon i forhold til sine respektive styre kloner, som bestemt ved western blotting og RT-PCR-analyser. Celleproliferasjon var lavere i BGC-SP-klone, og var høyere i HGC-sh klone enn i sine respektive styre kloner ved MTT metoden. Vi fant også at overekspresjon av SPARC hemmet tumorcelle-indusert kapillær dannelsen av HUVECs in vitro Hotell og angiogenese i rygg vindu analysen in vivo Blodårene er avgjørende for å levere næringsstoffer til vev . Derfor er neovaskularisering uunnværlig for utviklingen av fast tumor. Tidligere studier har vist at SPARC- spiller en rolle i angiogenese [7]. Våre resultater viste at overekspresjon av SPARC- inhiberte angiogenese in vitro Vi videre gjennomført studier for å undersøke hvilken rolle VEGF og MMP-7 i SPARC-mediert angiogenese modulering. Når rekombinant human SPARC protein ble lagt inn i kondisjonert medium fra HGC-sh klone å gjenopprette SPARC konsentrasjon, gjorde dette kondisjonert medium ikke endre kapillær dannelsen av HUVECs av in vitro VEGF spiller en nøkkelrolle i angiogenese, og er nødvendig for overlevelsen av endotelceller [8]. I glioma, SPARC- hemmet tumorvekst ved å forandre dens mikromiljø og undertrykke dens angiogenese ved inhibering av VEGF-ekspresjon og sekresjon [5]. Det kan være en negativ sammenheng mellom SPARC- og VEGF uttrykk, dvs. mer SPARC, jo mindre VEGF eller vice versa product: [13], [14]. MMP-7 er i stand nedverdigende basalmembran eller bindevev rundt skipene. Det stimulerer også DNA-syntese i dyrkede vaskulære endotelceller, og induserer angiogenese på stedet hvor tykktarmskreftceller ble implantert i en musemodell [15]. VEGF og andre angiogene faktorer virker hovedsakelig gjennom MAPK signalveier, som antas å være viktige overføringsveier som er involvert i prosessene neovaskularisasjon i tumorer [8]. Vår fersk studie viste at MMP-7 uttrykk ble modulert via aktivering av MAPK signalveier [16]. Flere studier har også vist at SPARC- negativt modulerte aktiveringen av MAPK banene [17]. Følgelig kan SPARC uttrykk endre angiogene balanse i svulster ved å nedregulere en serie av neovaskularisering fremme faktorer. For å undersøke funksjonen av SPARC i reguleringen av magekreft vekst in vivo SPARC- uttrykker i normale gastriske epitel-celler, magekreftceller, og stromale celler som omgir magekreft på et lavere nivå [21 ]. En immunhistokjemi studie viste at SPARC hovedsakelig uttrykt i stromale celler rundt svulsten [22]. Disse uoverensstemmelsene kan ikke forklares fullt ut. SPARC uttrykk kan avhenge av histologisk type svulst, eller vice versa I sammendraget, veksthemming av magekreft ved SPARC- synes å være formidlet via dens undertrykkelse virkninger på MMP-7 og VEGF uttrykk, noe som igjen kan hemme microvessel infiltrering inn i tumorer. Vi konkluderer med at nedregulering av SPARC kan assosiere med fremdriften av magekreft, og utforskningen forsøkte å regulere SPARC uttrykk kan bli en meningsfull tilnærming for å forbedre magekreft behandling. Antistoffer og reagenser Antistoffer mot SPARC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), (p-) SAPK /JNK, (p-) ERK1 /2, (p-) p-38, MMP-7 (Cell signalteknologi, Danvers, MA, USA), VEGF, og CD31 (Abcam, Cambridge, MA, USA) ble anvendt for western blotting og immunhistokjemi. Den rhSPARC ble levert av R & D (Minneapolis, Minnesota, USA). Revers transkripsjon-PCR kit ble levert av Promega (Madison, WI, USA). MMP-7-shRNA (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp Frederick, MD, USA) ble anvendt for nedregulering av MMP-7 i cellekloner. β-kasein (C-6905, Sigma-Aldrich Corporation, Natick, MA, USA) ble anvendt i β-kasein zymografi. Alle andre reagenser var av analytisk kvalitet eller bedre. Menneske mage kreft cellelinjer AGS, MKN-45, NCI-N87, BGC823, MGC803, HGC27, SGC7901 ble hentet fra Cancer Institute i den kinesiske Academy of Medical Science. Alle celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). BGC-EV (transfektert med tom vektor), BGC-SP (overekspresjon SPARC- cDNA), HGC-EV (uttrykk tom vektor) og HGC-sh (uttrykk SPARC- shRNA) ble dyrket i komplett RPMI 1640 med G418 (50 ug /ml) . Alle cellene ble opprettholdt i monolagkulturer ved 37 ° C i fuktet luft med 5% CO 2. ca 150000 BGC-823-celler ble sådd ut pr brønn i en seks-brønns plate i RPMI 1640 med 10% FBS og fikk feste seg over natten. Ekvimolare mengder pcDNA3.1 med full-lengde SPARC cDNA vektor eller tom vektor (Invitrogen, San Diego, CA, USA) ble inkubert med Lipofectamine-2000 Transfeksjon Reagens (Invitrogen, San Diego, CA, USA). Validert SureSilencing menneskelig SPARC shRNA og tom kontroll vektor ble oppnådd fra SuperArray Biovitenskap Corp (Frederick, MD, USA). HGC-27-celler ble transfektert som tidligere beskrevet [24]. I korthet ble cellene transfektert på en stabil måte ved å bruke lipofektamin. Transfekterte celler ble valgt ut ved hjelp av G418 (100 ug /ml for BGC-SP og HGC-SH kloner) i 14 dager før isolering av individuelle kloner. HGC-sh-MMP7-sh varianter ble etablert som beskrevet ovenfor, ble HGC-sh klone celler transfektert med MMP-7-shRNA (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp. Frederick, MD, USA) ved hjelp lipofektamin. Deretter ble transfekterte celler velges ut av puromycin (1 pg /ml) i 10 dager. celle proliferasjon ble bestemt ved en 3- (4,5-dimetyltiazol-2- yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse som beskrevet tidligere [24]. I korthet ble 500 celler ble dyrket per brønn i 96-brønners plater og inkubert i 8 dager, og deretter, MTT (R &D, Minneapolis, MN, USA) ble tilsatt til cellene. Absorbans verdier ved 550 nm ble målt med en mikroplateleser. Resultatene er vist som midlere absorbans ved 550 nm og midlene (± sd) av kvadruplikate bestemmelser fra seks separate forsøk. Totale cellelysater ble fremstilt og analysert ved western blotting som tidligere beskrevet [24]. Kort sagt ble antistoffer mot SPARC-, MMP-7, og VEGF (1:1000 fortynning) anvendes for å detektere SPARC, MMP-7, og VEGF, henholdsvis, mens antistoffer mot (p) SAPK /JNK, (p) ERK1 /2 og (p) p-38 (1:800 fortynning) ble anvendt for å detektere aktivering av MAPK-signalveien. Bundet antistoff ble visualisert ved hjelp av ECL (Promega, Madison, WI, USA) på en Kodak Image Station 4000 mm Pro System (Kodak, Rochester, NY, USA). Tettheten av båndene ble kvantifisert ved densitometrisk analyse ved anvendelse av bildeverktøyet (versjon 3.0) system. Total RNA ble isolert fra stabilt transfekterte tumorceller bruker Trizol reagens (Invitrogen, San Diego, CA, USA) og behandlet i 45 minutter ved 37 ° C med RQ1 DNase (Promega, Madison, WI, USA). RNA ble revers transkribert ved hjelp av AMV revers transkriptase (A3500, Promega, Madison, WI, USA). Kvantitativ real-time PCR ble utført i en ABI Prism7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Beverly, MA, USA) med en GoTaq qPCR Master Mix A6001 kit (Promega, Madison, WI, USA). Primerne anvendt for kvantitativ real-time PCR var som følger: MMP-7, 5'-GGAGATGCTCACTTCGATGA-3 '(sense) og 5'-ATACCCAAAGAATGGCCAAG-3' (antisense); og VEGF, 5'-AGGAGGAGGGCAGAATCATCA-3 '(sense) og 5'-CTCGATTGGATGGCAGTAGCT-3' (antisens). Primerne anvendt for PCR var som følger: SPARC-, 5'-CTCGAGATGAGGGCCTGGATCTTC-3 '(sense) og 5'-GGATCCCGGATCACAAGATCCTTGTCG-3' (antisense); og glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), 5'-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3 '(sense) og 5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3' (antisens). β-kasein Zymografi funksjonelle aktiviteten til MMP-7 ble evaluert ved β-kasein zymografi på 10% polyakrylamidgeler innebygd med 1 mg /ml β-kasein. Like mengder av serum-fritt kondisjonert medium fra celler dyrket i 24 timer ble underkastet elektroforese. Etter elektroforese, ble gelene vasket i 2,5% Triton X-100 i en time for å fjerne SDS. Gelene ble deretter inkubert i 18 timer ved 37 ° C i 50 mM Tris /HCl inneholdende 10 mM CaCl 2 og 0,02% NaN 3, farget med Coomassie brilliant blue og deretter avfarget. Proteolytiske aktiviteter latent MMP-7 og aktivert MMP-7 ble dokumentert som band med molekylmasser av 28 og 19 kDa, henholdsvis. Totalt 2 × 10 5 celler av HGC-P, BGC-P eller deres tilsvarende stabilt transfekterte kloner ble podet og inkubert i fullstendig RPMI 1640 i 6-brønners kammerobjektglass og tillatt å vokse i 24 timer. Deretter ble kondisjonert medium samlet, merket og lagret ved -80 ° C for fremtidig bruk. For å undersøke effekten av SPARC på i vitro Dorsal Skin-fold Chamber Modell Studiene ble utført i samsvar med en protokoll godkjent av Animal Care og bruk komité i Peking University (etisk søknad godkjenningsnummer No. J201155). in vivo atymiske nakne mus ble randomisert til ulike grupper (n = 6 per gruppe). Mus ble inokulert subkutant i den nedre bakre flanke med menneskelig BGC-P, BGC-EV, BGC-SP eller HGC-EP, HGC-EV, HGC-sh celler (2 × 10 6 celler per mus). Tumor vekst ble overvåket ved palpasjon på stedet av inokulasjon.
.
Metode
. Kvantitativ real-time PCR og Western blotting ble utført for å oppdage om de uttrykk for VEGF og MMP-7 ble modulert av SPARC uttrykk. For ytterligere å bestemme effekten av SPARC uttrykk på angiogenese in vivo
, ble xenograft modeller etablert og microvessel tetthet (MVD) forskjellige kloner ble oppdaget av immunhistokjemi.
Resultater
.
Konklusjon
Resultater
og in vivo
.
Den MAPKs Signale Pathway og ekspresjon av VEGF og MMP-7 er hemmet av SPARC overuttrykte
Knock-down av SPARC- Expression in HGC-27 Cells Fremmer Angiogenese via oppregulert VEGF og MMP-7 Expression
av stabilt trans MMP-7-shRNA inn HGC-sh celler. Figur 4A viser at ekspresjonen av MMP-7 i HGC-sh + MMP7-sh-celler ble nedregulert ved stabilt uttrykker MMP-7-sh-RNA til et nivå sammenlignbart med den til HGC-P og HGC-EV-celler. Å belyse rollen som MMP-7 i knock-down SPARC-mediert fremming av tumorcelle-indusert angiogenese, utførte vi kapillær formasjon analyse med kondisjonert media av HGC-sh celler og HGC-sh + MMP7-sh celler. Som vist i figur 4B, resultater indikerer at redusert MMP-7-ekspresjon i HGC-SH + MMP7-sh-celler førte til en signifikant redusert kapillær dannelsen av HUVECs in vitro plakater (HGC-sh + MMP7-sh vs
HGC-sh, P <. 0,05)
HGC-sh, P < 0,05 figur 4B). Capillary dannelsen av HUVECs var nesten fullstendig hemmet når dyrket i kondisjonert medium fra HGC-sh + MMP7-sh celler pluss lagt VEGF nøytraliserende antistoff ( vs
HGC-sh, P < 0,05 4B).
Overuttrykte SPARC i magekreft Cells Hemmer Tumourigenicity i Nude Mice
, xenograft seksjonene ble farget med et monoklonalt antistoff mot humant SPARC, VEGF eller MMP-7 . Figur 5A viser at BGC-SP svulster uttrykke mer SPARC enn BGC-P, BGC-EV svulster, mens samtidig VEGF, er MMP-7 uttrykk redusert (P < 0,05, figur 5A). Seksjoner fra HGC-sh svulster uttrykke mindre SPARC enn HGC-P, HGC-EV svulster mens samtidig VEGF, er MMP-7 uttrykk økt (P < 0,05, figur 5A). CD31 blir brukt primært for å demonstrere nærværet av vaskulære endotelceller i histologiske vevssnitt, som kan bidra til å vurdere graden av tumor angiogenese. For å vurdere om endret SPARC uttrykk formidlet den microvessel tetthet (MVD), analyserte vi angiogenese i xenografter ved histologisk analyse av CD-31. Det var ingen signifikant forskjell i MVD mellom BGC-P (12,5 ± 2,3 microvessels /0,145 mm 2), BGC-EV (11,5 ± 3,4 microvessels /0,145 mm 2) xenoimplantater. MVD ble redusert 54,8% i BGC-SP (5.2 ± 2.1 microvessels per /mm 2) svulster sammenlignet med BGC-EV tumorer (P < 0,05, Figur 5). Det var ingen signifikant forskjell i MVD mellom HGC-P (6,4 ± 2,1 microvessels /0,145 mm 2), HGC-EV (6,9 ± 1,8 microvessels /0,145 mm 2) xenografter. MVD ble forhøyet 51,7% i HGC-sh (10,5 ± 1,5 microvessels /0,145 mm 2) svulster sammenlignet med HGC-EV tumorer (P < 0,05, figur 5)
. På den annen side, nedregulering av SPARC av mRNA interferens fremmet kapillær formasjon in vitro Hotell og angiogenese in vivo
.
og in vivo
i forbindelse med reduksjon av MMP-7, VEGF og fosforylert ERK1 /2, mens nedregulering av SPARC- fremmes angiogenese in vitro Hotell og in vivo
i forbindelse med økningen av MMP-7, VEGF og fosforylert ERK1 /2.
analyse i forhold til kapillær dannelsen av HUVECs inkubert i tilstanden medium uten eksogene rhSPARC. Vi så brukt MMP-7-shRNA til nedregulerer MMP-7-ekspresjon i HGC-sh klon, og /eller anti-VEGF-antistoff til å nøytralisere VEGF i kondisjonert medium fra HGC-sh-klonen. Kapillar dannelse av HUVECs ble inhibert betydelig når de inkuberes i det kondisjonerte medium med lavere MMP-7 og /eller blokkerte VEGF. Disse eksperimentene tyder på at SPARC nedregulering alene ikke er tilstrekkelig for induksjon av neovaskularisering, og andre faktorer må være involvert i denne prosessen.
, BGC-SP og HGC-SH cellekloner ble sammenlignet med sine kontroll kloner for deres evne til å danne svulster i en subkutan modell. SPARC- overekspresjon betydelig redusert størrelse av xenopodet tumor med redusert MVD, nedregulering av SPARC- av RNA-interferens fremmet vekst av tumor xenopodet med økt MVD. Derfor, i magekreft xenografter, SPARC uttrykk er negativt korrelert med angiogenese. Tidligere studier indikerte at SPARC- bidrar til reguleringen av tumordannelse, selv om dens rolle syntes å være celletype spesifikk. I hepatocellulære kreftcellelinje xenotransplantater, SPARC- overekspresjon vesentlig forsinket tumordannelse, redusert tumor-størrelse, og redusert MVD i sammenligning med kontroll-xenografter [18]. I tykktarm kreft vev, ble SPARC uttrykk negativt korrelert med VEGF uttrykk og MVD [19]. I medulloblastoma celler, SPARC- overekspresjon inhiberte angiogenese som fører til reduksjon av tumorvekst [11]. I menneskelige mikrovaskulære endotelceller, SPARC hemmet DNA-syntese in vitro product: [6]. I neuroblastom xenografter, SPARC peptider hemmet angiogenese og tumorvekst in vivo product: [20]. Disse resultatene bekreftet SPARC- som en hemmer av tumor angiogenese in vivo
.
. Siste immunhistokjemi studie fant at SPARC uttrykket er negativt korrelert med uttrykk for VEGF og MVD i mage kreft vev, og SPARC uttrykk gått ned i magekreft med høyere grad av malignitet [23].
Materialer og metoder
Cell Kultur
Etablering av BGC-SP, HGC-sh Clones og HGC-sh-MMP7-sh Clones
Cell Proliferation Assay
Western blotting-analyse
RT-PCR og kvantitativ real-time PCR
Betinget mediesamlingen for Eksperimentering
endotelcelle Capillary lignende Tube Dannelse analysen
angiogenese, ble en kapillær-analysen utføres. I denne analysen ble Matrigel pipettert inn i pre-kjølte 96-brønners plater (75 mL Matrigel per brønn) og polymerisert i 30 minutter ved 37 ° C. For å avgjøre om endret SPARC uttrykk ville regulere angiogenese, HUVECs (5000 celler per brønn) ble inkubert i 100 ul kondisjonert medium høstet fra forskjellige typer celler. Etter 36 timers inkubering, ble rørstrukturer fotografert. Hver analyse tilstand ble undersøkt i kvadruplikate bestemmelser fra tre separate eksperimenter. Bilder ble tatt med et Cannon Power Shot A640 kamera på et Olympus invertert mikroskop med en 100 × forstørrelse; slangelengden ble kvantifisert ved hjelp av IPP (versjon 6.0, Media Cybernetics, Silver Spring, MD).
prosedyrer var i samsvar med anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Atymiske nakne mus (6 uker gamle, hunn, 26-28 g, n = 3 per gruppe) ble avlet og opprettholdes innenfor et bakteriefritt miljø. Implantasjonen teknikken har blitt tidligere beskrevet [11]. En dorsal luftsekken ble gjort hos mus ved injeksjon av 10 ml luft subkutant etter at dyret var helt bedøvet. Diffusjon kamre (Millipore, Bedford, MA, USA) ble fremstilt ved å innrette 0,45 mm Millipore membraner på begge sider av kanten av en O-ring med sement. BGC-P, BGC-EV og BGC-SP; HGC-P, HGC-EV eller HGC-SH-celler (1 x 10 6) suspendert i PBS ble injisert inn i kammeret. Et 2 cm langt snitt ble gjort horisontalt langs kanten av dorsal luftsekken, og kamrene ble plassert under huden. Musene ble avlivet 10 dager senere. Dyrene ble grundig flådd rundt de implanterte kamre. De hudfolder som dekker kamrene ble fotografert i henhold til synlig lys. Antallet blodkar ble regnet.
xenograft modeller, og Immunohistochemistry
Tarmmikrobiota kan forutsi alvorlighetsgraden av COVID-19
Edderkoppespeptid kan hjelpe til med å stoppe smerter ved irritabel tarm
Søvnkvalitet kan være indikator for senere studier av Alzheimers sykdom
Kortkjedet fettsyretilskudd forbedrer slaggjenoppretting,
Fører hypertensjon alltid til alvorlig COVID-19?
Åpne en smal spiserør
Anti-coronavirus-molekyler fra mikrober kan være nøkkelen til nye behandlinger
Mikrober i tarmen som produserer fordelaktige forbindelser, kan inneholde nøkkelen til behandling av symptomer på koronavirus. Tarmmikrobiom. Bildekreditt:Anatomy Image/Shutterstock.com
Lag et fysisk og genetisk kart over Cannabis sativa
De Cannabis sativa plante brukes ofte til en rekke medisinske, landbruket, industrielle og rekreasjonsformål rundt om i verden. Til tross for den utbredte bruken, det er fortsatt lite genetisk infor
Forskning viser at tarmparasittangrep reduserer alvorlighetsgraden av COVID-19
Vi lærer mer om COVID-19 sykdom hver dag. Voksne i alle aldre med visse underliggende medisinske tilstander har økt risiko for alvorlig sykdom fra viruset som forårsaker COVID-19. COVID-19, forårsak