PLoS ONE: Melk Fermentert av Propionibacterium freudenreichii induserer apoptose av HGT-1 Menneskelig Gastric Cancer Celler

Abstract

Bakgrunn

Magekreft er en av de vanligste kreftformene i verden. Den "økonomisk utviklede land" livsstil, inkludert kosthold, utgjør en risikofaktor favorisere denne kreftformen. Diet modulasjon kan senke fordøyelseskreftforekomst. Blant lovende mat komponenter, ble meieri propionsyrebakteriene vist å utløse apoptose av menneskelige tykktarmskreftceller, via utgivelsen av kortkjedede fettsyrer acetat og propionate.

metodikk /hovedfunnene

En gjæret melk utelukkende gjæret av P. freudenreichii
, ble nylig designet. I dette arbeidet ble det pro-apoptotiske potensialet i denne nye gjæret melk demonstrert på HGT-en human mage kreftceller. Fermentert melk supernatant indusert typiske trekk ved apoptose inkludert kromatin kondens, dannelse av apoptotiske legemer, ladde DNA, cellesyklus arrest og fremveksten av en subG1 befolkning, fosfatidylserin eksponering på plasmamembranen ytre pakningsvedlegget reaktivt oksygen arter opphopning, mitokondrie transmembrane potensial avbrudd, caspase aktivering og cytokrom c utgivelse. Bemerkelsesverdig, denne nye gjæret melk som inneholder P. freudenreichii
forbedret cytotoksisitet av camptothecin, et stoff som brukes i magekreft kjemoterapi.

Konklusjon /Betydning

En slik ny probiotisk gjæret melk kan derfor være nyttig som en del av et forebyggende diett utviklet for å forebygge magekreft og /eller som et supplement til mat for å forsterke kreft terapeutiske behandlinger

Citation. Cousin FJ, Jouan-Lanhouet S, Dimanche-Boitrel MT, Corcos L, jan G (2012) Melk Fermentert av Propionibacterium freudenreichii
induserer apoptose av HGT-1 Menneskelig Gastric kreftceller. PLoS ONE 7 (3): e31892. doi: 10,1371 /journal.pone.0031892

Redaktør: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, USA

mottatt: 15 november 2011; Akseptert: 19. januar 2012; Publisert: 19 mars 2012

Copyright: © 2012 Cousin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Conseil Regional de Bretagne gjennom CBB Développement oppfordring til prosjekter og ved Centre National Interprofessionnel de l'économie LAITIERE (CNIEL) gjennom av Vitenskapskomiteen Syndifrais oppfordring til prosjekter. Forskning i IRSET gruppen ble støttet med tilskudd fra Ligue Nationale Contre le Cancer (Côte d'Armor, Ille et Vilaine, Morbihan, Vendée og Sarthe komiteer), INSERM, Universitetet i Rennes 1 og Region Bretagne. FJC mottatt tilskudd fra CNIEL (doc). SJL ble støttet av foreningen pour la Recherche sur le Cancer (doc). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

kosthold modulerer risikoen for å utvikle magekreft

kreft er den viktigste dødsårsaken i økonomisk utviklede land som følge av kreft-assosiert livsstilsvalg inkludert røyking, fysisk inaktivitet, og "vestlige" diett [ ,,,0],1]. Faktisk er den rollen diett i kreftutvikling sterkt støttet av epidemiologiske studier, særlig om kreft i fordøyelseskanalen. Magekreft (GC) representerer den tredje typen dødelige kreft for menn i verden. I 2008 ble 640.600 tilfeller av GC anslått, forårsaker 464.400 dødsfall på verdensbasis [1]. Denne sykdommen er spesielt hyppig i Øst-Asia, og i Sentral- og Øst-Europa. De viktigste etiologiske faktorer involvert i magekreftutvikling er kosthold og Helicobacter pylori
infeksjon. Betydelige bevis, hovedsakelig fra case-control studier tyder på at risikoen for å pådra GC økes ved høyt inntak av saltet, syltet eller røkt tradisjonelt matvarer, samt tørket fisk og kjøtt. Tvert imot, fibre, friske grønnsaker og frukt, kanskje på grunn av sitt innhold av vitamin C, ble funnet å være omvendt assosiert med GC risiko [2], [3]. Virkningen av naturlig /mat komponenter på kreftutvikling av magen har dermed blitt undersøkt i løpet av de siste tiårene [4] - [6]. Blant disse, probiotika og deres evne til å hemme utvikling av kreft tilt vitenskapelig interesse [7], [8]. En probiotisk er generelt definert som "en levende mikroorganisme som, når de administreres i tilstrekkelige mengder, ensidige helse fordel for verten" [9]. Mens noen mikroorganismer som H. pylori
kan favorisere GC, mens andre kan ha en gunstig effekt ved å forebygge fordøyelses kreft. Spesielt kan utvalgte stammer av probiotiske bakterier begrense kreftutvikling i dyremodeller av kreftutvikling [10]. Dette ble spesielt dokumentert for tykktarmskreft, mens mindre er kjent om mulige effekter av probiotika på GC. En mulig mekanistisk forklaring på en slik beskyttende effekt er in situ
utgivelsen av anti-kreftfremkallende metabolitter som kort kjetting fettsyrer (SCFAs).

Short fettsyrer indusere apoptose av kreftceller

SCFA, inkludert acetat, propionat og butyrat, er viktige anioner av tarminnholdet og deres konsentrasjon kan moduleres av dietten. De ble vist seg å spille en nøkkelrolle i viktige fysiologiske funksjoner, inkludert modulering av fordøyelses epitelceller spredning /apoptose balanse. Dette innebærer SCFA-mediert cellesyklus-stans, histon deacetylase inhibitor og apoptose stimulering i transformerte celler, men også stimuleringen av differensiering i friske celler [11], [12]. Det har også blitt rapportert at SCFAs butyrat og propionat både indusere apoptose i humane mage-carcinom-cellelinjer [13] - [15]. Apoptose er en naturlig fysiologisk prosess slik celle nummer regulering og utgjør et mål for anti-kreft kjemoterapi [16]. Apoptose tillater uttømming av kreftceller i en "ren" måte. Kreftceller fragmentere i en koordinert kjedereaksjon, og residuet tas opp i tilstøtende vev og immunsystemet [17], [18]. To hoved apoptotiske reaksjonsveier har blitt beskrevet: den ekstrinsiske reaksjonsveien, som blir mediert av aktivering av døds reseptorer og kaspase 8, og den indre vei, der mitokondrier og caspase 9 er involvert [16]. Vanligvis, i kreftceller, er det apoptotisk funksjon mangler, noe som kan forklare deres vedvarende spredning og dermed dannelsen av tumorer. Evnen til å indusere apoptose i cancerceller er således anerkjent for sin terapeutiske potensial [16]. Siden meieri propionsyrebakteriene er i stand til å produsere gunstige pro-apoptotiske SCFAs, kan de vise seg nyttig i kreft forebygging eller behandling.

Propionibacterium freudenreichii
kan favorisere apoptotisk utarming av fordøyelseskreftceller

Dette probiotiske melke propionibacterium ble vist å indusere celledød forskjellige menneskelige tykktarmskreft cellelinjer gjennom apoptose induksjon, i co-kulturer [19]. De aktive forbindelser, utskilt i mediet, utløser den indre mitokondrie-apoptotiske reaksjonsvei i dyrkede humane kolorektale cancerceller. Spesielt SCFAs acetat og propionate utgitt av P. freudenreichii
indusere apoptose ved å virke på den mitokondrielle adenin-nukleotid Translocator, forårsaker depolarisering mitokondrier og permeabilisation, lekkasje av cytokrom c og caspaseaktivering [19], [20]. Imidlertid propionibacterial supernatanter er fremdeles mer pro-apoptotiske enn SCFAs acetat og propionat, anvendes i de konsentrasjoner målt i supernatanter, noe som tyder på at andre forbindelser kan være involvert i denne effekten. Valgte stammer av P. freudenreichii
forblir levende og metabolsk aktiv i tarmen hos mennesker og av normalflora-forbundet rotter der de produserer SCFAs [21], [22]. Følgelig ble de vist seg å øke apoptose i transform kolon epitelceller slike rotter som ble matet med den kreftfremkallende 1,2-dimetylhydrazin (DMH), men ikke i kontroll sunt [23]. Propionsyrebakterier kunne utgjøre probiotika favoriserer profylakse tykktarmskreft, forutsatt at de når sine mål i live og metabolsk aktiv. I denne sammenheng vektoren, eller probiotiske leveringsmiddelet, ble vist å bestemme overlevelse propionsyrebakterier og aktivitet [21], [24], [25]. Komplekse meieriprodukter som yoghurt og ost, spesielt beskytte propionsyrebakterier fra stress, men inneholder en kompleks blanding av bakterier. Det er derfor ikke mulig å tilskrive den reelle effekten til en bestemt belastning.

En gjæret melk ble vurdert som propionsyrekulturen levering kjøretøy i denne sammenheng

I denne studien brukte vi en ny mat-grade gjæret melk inneholder bare P. freudenreichii
som et eget mikroflora. Da dette produkt inneholder både levende propionsyrebakterier og deres aktive metabolitter, skal det bringe dem i kontakt med mageslimhinne ved inntak. Dette gjæret melk ble undersøkt med hensyn til HGT-en human magekreftceller apoptose induksjon. Faktisk er propionsyrebakterier kjent for å drepe humane tykktarmskreftceller, men deres effekt på mage kreftceller er ukjent. Den fermenterte melk drepte HGT-1-celler i en tids- og doseavhengig måte. Typiske trekk ved apoptose prosessen ble observert, inkludert levedyktighet drop, kromatin kondens, apoptotiske legemer 'formasjon, DNA ladde, ROS produksjon, mitokondriemembranen potensial forstyrrelse, caspaseaktivering, cellesyklus arrest og fremveksten av en subG1 befolkning.

Resultater

P. freudenreichii
gjæret melk dreper menneskelige mage og tykktarm kreft celler

P. freudenreichii
ITG P9 vokste i 72 timer ved 30 ° C i supplert melk og supplert melk ultra å nå finalen befolkning på 9,43 log _{10 kolonidannende enheter (cfu) /ml og 9,35 log 10 cfu /ml, respektivt. De SCFA konsentrasjonene var 26,21 mM acetat og 54,47 mM propionat (2,08 propionate /acetat forhold) i melken gjæret supernatanten mens de var 24,00 mM og 53,32 mm (2,22 ratio) i gjæret melk ultra supernatant. Disse forhold var forventet for propionsyrebakterier, som generelt produserer dobbelt så mye propionat som acetat [26]. Tolv andre mat-grade meieri propionsyrebakterier stammene ble også testet (se tabell S1 og figur S1). Ved hjelp av disse stammene, ble tolv fermentert melk oppnådd. Propionate konsentrasjoner varierte fra 36 til 67 mm og propionsyrebakterier populasjoner 9,0 til 9,7 log 10 cfu /ml, for den mindre og for den mest effektive belastning, henholdsvis.}

Den cytotoksiske potensialet supernatanter fremstilt av melk eller melk ultra, både gjæret av P. freudenreichii
ITG P9, ble undersøkt. HT-29 humane tykktarmkreftceller og HGT-1 humane magecancerceller ble behandlet med disse supernatanter. Forskjellige fortynninger alt fra ½ til ble testet. Dessuten ble cytotoksisiteten til en blanding av 15 mM acetat og 30 mM propionat testet ved konsentrasjoner nær disse ½ fortynnede supernatanter. Som positive kontroller av apoptose induksjon, den kjemoterapi narkotika camptothecin (4 mm) og etoposid (100 mm) ble brukt for HGT-1 og HT-29 celler, henholdsvis. Tre forskjellige fremgangsmåter for celledød overvåkning ble sammenlignet. Som vist i fig S2, metylenblått, MTT og trypan blå eksklusjons ga analyser liknende Kinetikken til døden. Følgelig ble metylenblått-analyse anvendt i denne studie for å vurdere cellelevedyktighet ytterligere. Den ikke-fermenterte meieriprodukter (melk eller melk ultrafiltrerte) hadde ingen effekt, hverken på HT-29, og heller ikke på HGT-1-celle-levedyktighet (fig. 1 A, B). Supernatanten av melk eller melkeultra gjæret av P. freudenreichii
induserte en lignende cytotoksisitet i en tidsavhengig måte i HT-29 og HGT-1-celler, og i nærheten av cytotoksisiteten indusert av medikamenter eller av acetat /propionat blanding. Halv-maksimal dreping av HGT-1-celler skjedde etter 24 timer og 26 timer fra behandlingen med den fermenterte melk og fermentert melkeultrafiltrerte supernatanter henholdsvis, etter 17 timer med behandling med camptothecin og etter 24 timers behandling med SCFA blanding (Fig. S3) . I tillegg cytotoksisiteten av fermenterte meieriprodukt supernatanter i HGT-1-celler var doseavhengig (fig. 1C). For hver fortynning ble testet, fallet i HGT-1-celle-levedyktighet indusert av den fermenterte melken eller den fermenterte melken ultrafiltrat var svært like (fig 1C &. Fig. S3). Det er derfor de neste trinnene i studien vi bare utføres med gjæret melk ultra supernatant. Tatt sammen indikerer disse data at propionsyrebakterier effektivt drepe human colon og magekreftceller, i det minste delvis via produksjons av propionat og acetat (fig. 1). Noen andre gjæret melk, fermentert med forskjellige meieri propionsyrebakterier stammer, viste lignende cytotoksiske effekter på kreftceller (tabell S2). P. freudenreichii
ITG P9 er kjent for sin metabolsk aktivitet

in vivo product: [22], tilsvarende gjæret melk ble videre undersøkt. P. freudenreichii
gjæret melk induserer typiske merkene av apoptose i humane mage kreftceller

Nucleus morfologi av HGT-1 celler inkubert i nærvær av P. freudenreichii
gjæret melk ultra ble analysert ved fluorescens mikroskopi etter Hoechst 33342 farging (Fig. 2A). Den kjernefysiske fluorescens av ubehandlede celler (kontroll) forble uendret i løpet av tiden løpet av eksperimentet med blå normal kjerner (tid 0-h, Fig. 2AA). Under behandlingen HGT-1-celler viste de kondenserte kromatin og fragmenterte kjerner karakteristikker av apoptotiske kjerner (fig. 2AB, c), etterfulgt av forekomsten av apoptotiske legemer etter 72 h (fig. 2AD). Inter-nukleosomale DNA-fragmentering som resulterer i DNA ladde, et typisk tegn på apoptose [27], ble også overvåket under gjæret melk ultrafiltrat behandling. DNA-fragmentering ble observert fra 24 timer etter behandling med fermentert melk ultrafiltrat (Fig. 2B), og i mindre grad med camptothecin (fig. S3). DNA-innhold ble også kvantifisert ved flowcytometri etter propidiumjodid- merking for å studere effekten av gjæret melk ultra på HGT-en cellesyklus distribusjon (Fig. 2C). Ubehandlede HGT-1-celler presentert en cellesyklusfordeling (fig. 2ca) uten subG1 fase, som forble uendret i løpet av tiden løpet av eksperimentet (data ikke vist). Prosentandelen av celler i subG1 fase, en indikasjon på en apoptotiske prosess, en signifikant økning med tiden i løpet av fermentert melk ultrafiltrat behandling (figur 2C-B, Cc, Cd.) Ved 24 timer (39,24 ± 4,87%), etter 48 timer (91,63 ± 0,28 %) og etter 72 h (94,79 ± 0,45%). Etter 48 timer og 72 timers behandling var alle cellene var i subG1 cellesyklus fase, noe som indikerer fullstendig død av HGT-1-celler. Som en kontroll, camptothecin induserte lignende apoptotiske merkene i HGT-1-celler (Fig. S4).

å bekrefte apoptose-induksjon, phosphatdylserine translokasjon fra den indre til den ytre paknings av plasmamembranen ble bestemt ved å farge HGT- 1-celler med en kombinasjon av Annexin V-FITC (aV) og 7-AAD, etterfulgt av strømningscytometri fluorescens-analyse (fig. 3). Ubehandlede celler (0 h) presenterte en høy andel av levende celler (AV ^{- /7AAD -; 92%) og bare 5% av cellene ble farget med Annexin V (figur 3B.). Disse prosentsatsene bestemt i ubehandlede celler forandret seg ikke i løpet av tiden løpet av eksperimentet (data ikke vist). Under behandlingen av HGT-1-celler med ½ fortynnet gjæret melk ultrafiltrat i DMEMc, bare prosentandelen av celler farget med 7-AAD (som indikerer nekrose) var meget lav (Fig. 3B). Imidlertid er prosentandeler av celler farget med Annexin V økte signifikant i en tidsavhengig måte og nådde 80% ved 72 timer (fig. 3B). Derfor HGT-1 celler gikk apoptose etter behandling med P. freudenreichii
gjæret melk ultrafiltrat, karakterisert ved første AV positiv farging, noe som indikerer eksponering fosfatidylserin, og deretter både AV og 7-AAD positiv farging, noe som indikerer et senere tap av membranintegritet. Som en kontroll, camptothecin indusert lignende apoptotiske kjennetegnene (Fig S5.)}

Som SCFA handle direkte på mitokondriene, ble tre viktige mitokondrielle parametere bestemmes også. Den ΔΨm indre membran potensial, og generering av ROS, ved hjelp av to fluorescerende prober, DiOC (6) 3 (som er ΔΨm følsom) og DHE (som registrerer O _{2 ^{- nivå), og lokalisering av cytokrom c. Ubehandlede celler (0 h) oppviste en høy fluorescens (høy ΔΨm) og en lav DHE fluorescens (lav fremstilling av O 2 -) (Fig. 4A, B). Etter behandling med gjæret melk ultrafiltrat, en tidsavhengig reduksjon i inkorporering av DiOC6 (3) fluoriserende probe ble observert, og viser et tap av ΔΨm og følgelig mitokondriemembranen depolarisering (Fig. 4A). Prosentandelene av behandlede HGT-1-celler med redusert indre membranpotensialet økes på en tidsavhengig måte for å nå 96% av cellene i 72 timer. FCCP behandling ble anvendt som en positiv kontroll av mitokondriemembranen depolarisering. Dette tap av ΔΨm ble bekreftet ved den karakteristiske tap i rød fluorescens følgende JC-1-farging (fig. 4B). Når det gjelder ROS produksjon i HGT-1 celler, gjæret melk ultra behandling indusert opphopning av O 2 -, betydelig etter 48 timer og 72 timer etter behandling (fig 4C.). Dette ROS akkumulering delvis kan forhindres hvis celler er forbehandlet med ROS scavenger TEMPOL (fig. S6). Cytokrom c frigjøring fra mitokondrier til cytoplasma er en viktig cellulær hendelse av den apoptotiske programmet. Immunoblotting undersøkelse av cytoplasma-anrikede fraksjoner med hensyn til nærvær av cytokrom c bekreftet en endring i dens subcellulære lokalisering (Fig. 4D). Cytokrom c ble påvist i cytoplasma-anrikede fraksjon fra 24 timer av behandlingen, noe som indikerer flytting av dette proteinet (fig. 4D). Dette relocalization av cytokrom c i cytoplasma ble bekreftet av farging, viser diffus farging gjennom hele cellen etter behandling, mens punctuated flekker før behandling (fig. 4E).}}

P. freudenreichii
gjæret melk aktiverer caspases

For å bekrefte apoptotiske mekanismene indusert av gjæret melk ultra i HGT-1 celler, ble behandlingen av caspases 3, 8 og 9 analysert ved Western blotting og tilsvarende enzymatiske aktiviteter overvåking i HGT -1 celleekstrakter (fig. 5). Den ikke-gjæret melk ultrainduserte ikke caspaseaktivering i HGT-1 celler: bare proforms av caspase-3 og -9 ble oppdaget på western blot (Fig. 5A) og ingen caspase aktivitet ble målt (figur 5B.). Den fermenterte melk ultrafiltrat supernatant, så vel som camptothecin eller blandingen av propionat og acetat i en [2: 1] molforhold, indusert spaltning av pro-kaspase 3 og genereringen av de aktive former av caspase-3, subenhetene p17 og p12 (fig. 5A). Aktiveringen av caspase-3, som er en effektor caspase, bekreftet den apoptose-induksjon. I tillegg er gjæret melk ultrafiltrat indusert spaltning av procaspase-9, som fører til at 35 og 37 kDa bearbeidede former. Caspase-8 ble ikke påvist i kontroll ubehandlede HGT-1 celler. Imidlertid behandling med propionibacterial supernatanter eller C2 /C3 blanding førte til en klar påvisning av 54 kDa proform, etterfulgt av spalting etter 48 timers behandling

Kvantifisering av caspase-3, -8 og. - 9 enzymatiske aktiviteter bekreftet caspaseaktivering av begge propionibacterial metabolitter og ved camptothecin. Faktisk ble caspases-9 og -3 aktivert på de tidligste stadiene av behandlingen, mens caspase-8 virket aktiveres senere (Fig. 5B). Camptothecin og den SCFA blandingen aktiveres alle de tre undersøkte caspaser. Disse data bekreftet aktiveringen av den indre reaksjonsvei av apoptose av fermentert melk ultrafiltrat behandling, med en tidlig aktivering av kaspase-9 og deretter av caspase-3 og -8.

P. freudenreichii
gjæret melk øker camptothecin cytotoksisitet

Campthotecin er et cytotoksisk kinolin alkaloid som inhiberer enzymet DNA-topoisomerase I (topo I) og er mye brukt i kjemoterapeutisk behandling av GC. Vi har vist ovenfor at propionibacterial metabolitter indusere apoptose i HGT-1-celler via mitokondrie død pathway. Vi neste studert apoptose indusert ved en kombinasjon av både camptothecin og gjæret melk ultrafiltrat i HGT-1-celler. Økte konsentrasjoner av camptothecin (0, 0,25, 0,5, 1, 2 uM) i kombinasjon med økt konsentrasjon av fermentert melk ultrafiltrat (0,, ⅛, ¼) ble testet på HGT-1-celle-levedyktighet og begge indusert tap av HGT-1 levedyktighet , på en doseavhengig måte (fig. 6). Videre, tilsetningen av gjæret melk ultrafiltrat forbedret signifikant cytotoksisitet av camptothecin i HGT-1-celler (fig. 6). For eksempel, 0,25 uM camptothecin og gjæret melk ultrafiltrat fortynnet til ⅛ førte til en levedyktighet tap på 8,6% og 18,6%, respektivt. Kombinasjonen av disse to forbindelser førte til en cellelevedyktighet tap på 29,8% (fig. 6), noe som tyder på en ekstra cytotoksisk effekt når camptothecin ble kombinert med fermentert melk ultrafiltrat i HGT-1-celler. Følgelig er kombinasjonen indeks (CI) beregnet som tidligere [28], har en verdi på 1, noe som indikerer en additiv effekt av camptothecin og fermentert melkeultrafiltrert behandlinger.

diskusjon

En ny gjæret melk, som inneholder P. freudenreichii
som eneste bakterie, ble utviklet for å ytterligere undersøke probiotiske potensialet i denne meieri utarbeidelse av propionsyrebakterier (anmeldt i [29]). I denne studien, rapporterer vi at den vandige fase av dette fermentert melk dreper human colon og magekreftceller via metabolittene, inkludert propionat og acetat, utgitt av denne bakterien. Denne forestillingen er basert på de observerte cytotoksiske effekten av P. freudenreichii
gjæret melk supernatanter på kultivert HT-29 og HGT-1 kreftceller. Denne effekten ble oppnådd med ultra-sentrifugerings supernatanter, dvs. den fermenterte melk vandige fase, blottet for kaseiner og bakterier, som viser at de aktive forbindelser utskilles, som tidligere beskrevet for propionsyrebakterier [19]. Av denne grunn ble de fleste av forsøkene i dette arbeidet som er utført med fermentert melk ultrafiltrat (fig. 1). Vi demonstrerte for første gang at P. freudenreichii
gjæret melk supernatant induserte apoptose av HGT-1-celler i en tids- og doseavhengig måte med utseendet av klassisk morfologiske og biokjemiske funksjoner i apoptose (kondensert og fragmentert chromation, DNA ladde og akkumulering av celler i cellesyklus subG1 fase).

Vi så da hvis de cellulære mekanismene som er involvert i HGT-en celledød veien var lik den mitokondrielle dødsveien utløst i Caco-2 og HT-29 human tykktarm kreft celler med P. freudenreichii
DMEMc dyrkningssupernatanter [19], [20]. Den sub-cellulære og biokjemiske hendelser som ble observert i de behandlede HGT-1-celler med gjæret melk ultrafiltrat var lik og er inkludert i det minste mitokondrie ΔΨm tap, ROS (O _{2 ^{-) generasjon, caspaser behandling og aktivering, cytokrom c flytting inn i cytoplasma (fig. 3, 4, 5). Fermentert melk supernatant induserte prosessering og aktivering av kaspase-8 i tillegg til caspaser -3 og -9. Videre viser figur 4A at caspase-8 ikke blir oppdaget i kontroll ubehandlede celler og i celler behandlet med camptothecin eller ikke-gjæret melk ultra, i tråd med mangel på dens mRNA (C. Le Jossic-Corcos, Det medisinske fakultet, Brest , Frankrike, personlig kommunikasjon). Det skal bemerkes at en tilsynelatende uoverensstemmelse foreligger mellom enzymatiske resultater, noe som tyder caspase-8-aktivitet in camptothecin-behandlede celler, mens ingen caspase-8 oppdages i disse cellene ved western blotting. Dette kan forklares ved mangelen på spesifisitet av Ac-IETD-AMC substrat, som kan behandles av andre enzymer slik som kaspaser -3 og -10 eller granzyme B, spesielt hvis konsentrasjonen av slike enzymer er forhøyet [30], [31]. I motsetning P. freudenreichii
gjæret melk ultrafiltrat og blandingen av SCFA begge forårsaket ekspresjon og aktivering av caspase-8. De involverte her mekanismer er ikke klarlagt; imidlertid caspase-8 kjent for å være under-uttrykt i enkelte kreftceller som et resultat av DNA-metylering [32], [33]. Dets ekspresjon kan bli gjenopprettet ved RNA og proteinnivå ved demethylating midler slik som decitabine [34] og HDAC-inhibitorer [35], noe som resulterer i demetylering av den regulatoriske sekvens av kaspase-8, en økning av caspase-8-promoteraktivitet og i re uttrykking av caspase-8 [32]. SCFA, slik som propionat, er HDAC-inhibitorer, som fører til hyperacetylation av histoner [36]. Dette favoriserer transkripsjon via en forandring i DNA-konformasjon [37] og kan gjenopprette caspase-8 ekspresjon. Annen mat fødte forbindelser ble allerede vist seg å gjenopprette caspase-8 uttrykk. En injeksjon ekstrakt av Semen coicis plakater (en slektning av mais) extract viser anti-tumor aktivitet øker uttrykket av caspase 8 og induserer apoptose i HepG2 celler [38]. Diallyl disulfid, som finnes i hvitløk, forsterker uttrykket av caspase-8, Fas og Fasl i leukemi K562 celler. En slik regulering kan således være involvert i de pro-apoptotiske virkninger av meieri propionsyrebakterier og av gjærede produkter som inneholder dem. Western blotting dokumentert gjenopprettet ekspresjon og deretter sen aktivering av kaspase-8 i propionibacterial metabolitter-behandlede HGT-1-celler, som kan oppstå som et resultat av caspase-8 aktivering av en annen caspase såsom caspase-9. Faktisk utgang av cytokrom c, en del av mitokondrie veien, ble vist å aktivere kaspaser flere blant 2, 3, 6, 7, 8 og 10 [39]. Videre ble caspase-9-aktivering vist resultat i nedstrøms caspase-8-aktivering [40]. Følgelig caspase-9 ble vist in vitro
å aktivere caspase-3 som igjen aktiverer caspase-6, som er ansvarlig for caspase-8 aktivering [41]. Til sammen bekrefte våre resultater som propionibacterial metabolitter som finnes i P. freudenreichii
gjæret melk indusere flere sub-cellulære mekanismer som favoriserer apoptose. En slik aktivering av caspase-8 uttrykk kan føre til en stor apoptotisk respons i HGT-1 celler behandlet med døde domene reseptorer agonister (f.eks Trail eller Fas).}}

Så vidt vi vet, er dette det første arbeidet rapportering spesifikk induksjon av magekreft celle apoptose av en gjæret melkeprodukt. Fermenterte melketyper, inkludert yoghurt, ble foreslått å være anvendelige i forebygging av tykktarmskreft. Epidemiologiske data om den beskyttende effekten av melk og melkeprodukter på tykktarmskreft sats ga motstridende resultater [42]. Melk og melkeprodukter totale forbruk er assosiert med en reduksjon i kolorektal kreftrisiko. Men dette er ikke sant for alle slags meieriprodukter og effektene varierer sterkt. Gjærede meieriprodukter kan utgjøre effektive levering kjøretøy for å målrette beskyttende molekyler eller mikroorganismer til bestemte nettsteder som fordøyelses epitel [43]. Bovint laktoferrin, en bestanddel av melk, induserer apoptose av colon [44] og gastriske [45] kreftceller. Utvalgte stammer av mikroorganismer som finnes i gjæret melk kan også motvirke tykktarmskreftutvikling. Følgelig, yoghurt og melkesyrebakterier utviste anti-kreft egenskaper i dyremodeller av colon carcinogenesis [46]. Men litt arbeid fokusert på gjærede meieriprodukter og magekreft. Vårt arbeid antyder at P. freudenreichii
kan spille en rolle i denne sammenheng, da det ville levere både levende propionsyrebakterier og pro-apoptotiske metabolitter til den gastriske mucosa. I denne sammenheng bør det bli lagt merke til at P. freudenreichii
holder fordøyelses epitelceller og slim [47], [48]. Det ble også vist å hemme vedheft av den utløsende agent for magekreft Helicobacter pylori
til fordøyelses epitelceller, samt H. pylori
indusert skader [49]. Disse egenskapene foreslå en rolle P. freudenreichii
gjæret melk i profylakse av magekreft.

Til slutt, vår gjæret melk potentialized den pro-apoptotiske handlingen av stoffet camptothecin på mage kreftceller. Følgelig levende kulturer av probiotiske melkesyrebakterier ble tidligere vist å bevisst LS513 kolorektal kreft celler til 5-fluorouracyl [50]. Men i dette tilfellet, probiotika alene hadde ingen effekt proapoptotiske. I dette arbeidet, lave doser av stoffet camptothecin anvendes i magecancerkjemoterapi var ineffektive i å drepe magekreftceller. Imidlertid, i nærvær av lave doser av P. freudenreichii
gjæret melk, de drepte de samme cellene effektivt (Fig. 6). Propionibacterial metabolitter indusere indre apoptose vei ved å handle direkte på mitokondriene, mens camptothecin fungerer på DNA-nivå. Dette er i overensstemmelse med deres samlede potensial i apoptoseinduksjon når disse pro-apoptotiske induktorer er kombinert. Dessuten inneholder den fermenterte melk SFCAs, kjent som HDAC-inhibitorer i stand til å modulere apoptose og cellesyklus i magekreftceller [13], [51], så vel som ekspresjon av cellesyklusrelaterte og apoptotiske proteiner i andre kreftceller [52], [53]. Probiotika ble allerede brukt i kliniske studier for å redusere bivirkninger av kreft kjemoterapi [54]. P. freudenreichii
kan, i henhold til våre resultater, brukes i slike kliniske studier. Dens synergistisk effekt kan bidra til å senke legemiddeldose og bedre komfort for pasientene.

I konklusjonen, en ny melk, utelukkende gjæret av P. freudenreichii
, indusert apoptose i HGT-1 menneskelige mage kreftceller. I tillegg har denne gjæret melk forbedret camptothecin cytotoksisitet aktivitet, stoffet som brukes i magekreft kjemoterapi. Slike nye probiotiske gjæret melk kan være av interesse som en funksjonell mat for å forebygge magekreft og /eller potensial terapeutiske behandlinger.

Materialer og metoder

Kjemi

Camptothecin, etoposid , TEMPOL, acetat og propionat natriumsalter, og caspase substrater Ac-DEVD-AMC (N-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-metylkumarin), Ac-IETD-AMC (N-acetyl-Ile -Glu-Thr-Asp-7-amido-4-metylkumarin) og Ac-LEHD-AFC (N-acetyl-Leu-Glu-His-Asp-7-amido-4-trifluoromethylcoumarin) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Quentin Fallavier, Frankrike). Camptothecin ble løst i DMSO. Den endelige konsentrasjonen av DMSO overskred ikke 0,01%, en konsentrasjon som fremkalte ikke noen toksisitet. RNAse A, PI (propidiumjodid), Hoechst H33342, MitoTracker® Red CMXRos, TO-PRO-3, JC-1, 3,3'-dihexyloxacarbocyanine jodid (DiOC6 (3)) og dihydroethidium (DHE) ble oppnådd fra Invitrogen ( Cergy-Pontoise, Frankrike). Annexin V-FITC (AV) kit og 7-Aminoactinomycin-D (7-AAD) løsning ble gitt av BD Biosciences (Pont-de-Claix, Frankrike).

• PLoS ONE: E-cadherin destabilisering Regnskap for patogenitet missense mutasjoner i arve Diffuse Gastric Cancer
• PLoS ONE: Identifisering av Serum microRNAs som Novel ikke-invasive biomarkører for tidlig deteksjon av Gastric Cancer