PLoS ONE: Tap av Promyelocytic Leukemi Protein i Gastric Cancer: Konsekvenser for IP-10 Expression og Tumor-infiltrerende Lymphocytes

Abstract

Magekreft er en av de vanligste årsakene til kreft relatert dødelighet på verdensbasis. Uttrykk for tumor suppressor, promyelocytic leukemi (PML) protein, er redusert eller avskaffet i mage karsinom, i forbindelse med økt nivå av lymfatisk invasjon, utvikling av høyere pTNM iscenesettelse, og ugunstig prognose. Heri, undersøkte vi forholdet mellom graden av tumor-infiltrerende lymfocytter og status for PML protein ekspresjon i avansert gastrisk karsinom. Vi har observert høyere antall av infiltrerende T-celler i mage-karsinom vev hvori PML-ekspresjon ble redusert eller opphevet, sammenlignet med vev positive for PML. Omfanget av T-cellemigrering mot kultur-supernatanter erholdt fra interferon-gamma (IFN-γ-stimulert gastrisk karsinom-cellelinjer ble også påvirket av ekspresjon av PML in vitro
. Interferon-gamma-induserbar protein 10 (IP- -10 /CXCL10) uttrykk ble økt i magekreft vev viser reduserte PML nivåer. Videre, både PML
knockout og knockdown celler vises forbedret IP-10 mRNA og protein uttrykk i nærvær av IFN-γ. PML knockdown øket IFN-γ-mediert signal Svinger og aktivator av transkripsjon-1 (STAT-1) binding til IP-10-promoteren, noe som resulterer i forhøyet transkripsjon av IP-10-genet. Omvendt, PML IV protein ekspresjon trykkes IP-10-promoteren aktivering . Basert på disse resultatene, foreslår vi at tap av PML protein uttrykk i magekreftceller bidrar til økt IP-10 transkripsjon via
forbedring av STAT-en aktivitet, som i sin tur fremmer lymfocytt menneskehandel innenfor kreft regioner .

Citation: Kim HJ, Song DE, Lim SY, Lee SH, Kang JL, Lee SJ, et al. (2011) Tap av Promyelocytic Leukemi Protein i Gastric Cancer: Konsekvenser for IP-10 Expression og Tumor-infiltrerende lymfocytter. PLoS ONE 6 (10): e26264. doi: 10,1371 /journal.pone.0026264

Redaktør: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), USA

mottatt: 21 april 2011; Godkjent: 23 september 2011; Publisert: 12 oktober 2011

Copyright: © 2011 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (2010-0015506) til Y-HC, ved National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av Korea regjeringen (MEST) (2010-0029353) til JLK, og ved RO1 NS50665 til ENB. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de hyppigste årsakene til kreftrelaterte dødsfall på verdensbasis. Nylige fremskritt innen genetikk har muliggjort påvisning av hendelser som oppstår i løpet av magekreftutvikling, inkludert aktivering av onkogener, tie av tumorsuppressorgener, og mutasjon av gener involvert i DNA-reparasjon [1]. Blant disse genetiske hendelser, er det kjent at tumor suppressor promyelocytic leukemi (PML) protein uttrykk er redusert eller avskaffet i magekreft, og at dette er forbundet med mer omfattende lymfatisk invasjon, høyere pTNM iscenesettelse, og ugunstig prognose, noe som tyder på at PML tap er knyttet til kreftutvikling og gastrisk karsinom progresjon [2]. Tidligere studier innblandet PML
dysfunksjon i utviklingen av en rekke kreftformer, og redusert eller avskaffet uttrykk for PML er rapportert i prostata, bryst, CNS, tykktarm, lunge og mage kreft [2], [3] .

PML
genet ble opprinnelig identifisert ved fusjon med retinsyre reseptoren involvert i t (15; 17) translokasjon i forbindelse med akutt promyelocytic leukemi (APL) [4], [ ,,,0],5], [6], [7], [8]. PML er en tumor suppressor protein som regulerer cellesyklusprogresjon, gentranskripsjon, transformasjon undertrykkelse, og apoptose. PML
knockout-mus er betydelig mer følsomme for tumordannelse etter eksponering for kreftfremkallende enn det som er villtype-kontroller, og PML
-deficient cellene er mindre tilbøyelige til å gjennomgå apoptose etter påføring av bestemte typer cellulært stress [9]. I tillegg til rapporter med fokus på tumor suppressor rolle PML, har flere studier bekreftet at proteinet fungerer som en transkripsjonsregulator, via
tilknytning til co-aktivator CREB-bindende protein; co-repressors inkludert HDAC, N-Cor, og mSin3A; og transkripsjonsfaktorer Nur77, AP-1, myc, p53, og STAT-1α [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].

Progressive mutasjon av og genetiske forandringer i flere tumorsuppressorgener fremme svulst utvikling og progresjon [18]. I tillegg til genetiske endringer i tumorceller, både inflammatoriske celler og mediatorer bidrar til dannelsen av bestemte tumor microenvironments [19], [20]. Tumorassosierte fibroblaster (TAFs) og makrofager (TAM) er også involvert i modulering av tumor-mikromiljøet via
produksjon av cytokiner, kjemokiner, interferoner, og andre biologisk aktive faktorer [21], [22]. Krysstale mellom tumorceller, TAFs, TAMs, og lymfocytter, er av betydning i tumorutvikling og progresjon, og bidrar til etableringen av tumor microenvironments anriket i ekspresjon av en rekke biologisk aktive faktorer [23], [24], [25] [26], [27].

TAMs er funnet å korrelere med angiogenese og en ugunstig prognose i flere typer kreft, inkludert magekreft [22], [28]. Mastcelle produserer mange angiogene faktorer og en rekke cytokiner, og dets tetthet har blitt rapportert å høyt korrelere med graden av tumor neoangiogenesis og dårlig prognose [29], [30]. CD4 ^{+ og CD8 + lymfocytter er også funnet i en rekke av faste kreftvevet. Til nå har de presise molekylære mekanismer som typen og antallet tumorceller infiltrere reguleres er stort sett ukjent. Det er flere kontroversielle rapporter med hensyn til antall og funksjon av tumor-infiltrerende lymfocytter. Spesielt, CD8 + T-lymfocytter, mens deres funksjon er kjent for å eliminere begynnende transformerte celler og bidra til immunosurveillance [31], er det rapportert at CD8 + tumor-infiltrerende T-celler er defekte i effektorfasen funksjon ved kontakt med tumorceller [32] og deres infiltrasjon er knyttet til ugunstig prognose i visse typer kreft så som nonsmall celle lungekreft og nasofaryngeal karsinom [33], [34].}

Kjemokiner utskilt av stromale celler eller tumor cellene påvirke tumorcelle-migrering, invasjon, proliferasjon, angiogenese og immuncelleinfiltrasjon i tumormassen [35]. IFN-γ-induserbart protein-10 (IP-10, CXCL10) er en av de CXC kjemokiner som spiller flere roller i inflammatoriske sykdommer og kreft [36], [37]. Siden IP-10 fortrinnsvis fremmer Th1-immunresponser ved å tiltrekke robust NK og T-cellene, er det foreslått som en av mulige mekanismer for T-celle-infiltrasjon i tumorer.

Enten tap av tumorsuppressorgener i tumorceller induserer rekruttering av lymfocytter og modulering av funksjonene til slike celler i kreft microenvironments er foreløpig uklart. I denne studien undersøkte vi PML funksjon med hensyn til rekruttering av lymfocytter og modulering av uttrykket av tumor-avledet faktorer. Ekspresjon av PML er omvendt korrelert med graden av infiltrering av CD8 ^{+ T-celler til gastriske karsinomer. PML tap ble ytterligere assosiert med økt ekspresjon av IP-10, en av de lymfocytt-tiltrekkende CXC kjemokiner, i gastrisk karsinom celler og vev. PML knockdown fremmet IFN-γ-mediert STAT-1 binding til IP-10-promoteren, som resulterer i økt transkripsjon av IP-10 genet. Våre data understøtter ideen om at PML er involvert i rekruttering av lymfocytter inn i tumorer, via
modulering av uttrykket nivåer av tumor-avledede faktorer, inkludert IP-10, noe som gir ytterligere bevis på at tapet av tumorsuppressorgener i tumor celler deltar aktivt i etableringen av tumor microenvironments.}

Resultater

Tap av PML protein er assosiert med økt infiltrasjon av CD8 ^{+ T-celler i avansert magekreft vev}

Immunhistokjemisk farging for PML og CD8 ble utført for å undersøke om omfanget av lymfocytter infiltrasjon var assosiert med PML uttrykk status i avansert magekreft. CD8-immunopositive celler ble nummerert som beskrevet i Materialer og Metoder. I alt 35 prøver (71,4%) viste delvis til fullstendig tap av PML i tumorcellekjerner av scenen IV avanserte mage karsinom. Prøver fra 14 avanserte magekarsinom pasientene var diffust positivt for PML, og inneholdt et gjennomsnitt på 32,7 CD8 ^{+ T-celler per felt (figur 1A). Vi identifiserte 19 tilfeller av avansert magekreft stiller samlings positivitet for PML, med et gjennomsnitt på 47,2 CD8 + T-celler per felt. Videre ble fullstendig tap av PML observert i 16 avanserte magekreft pasienter; prøvene inneholdt et gjennomsnittlig antall CD8 52,8 + T-celler per felt. Prøvene viser fokus positivitet eller fullstendig tap for PML viste en mer markert økning i CD8 + T-celle nummer enn gjorde eksemplarer stille diffuse positivitet for PML. Representative bilder er vist i figur 1B. Selv om PML protein uttrykk ble redusert eller avskaffet i tumorceller, som alle normale mage slimhinnekjertlene, stromale vev og lymfoide celler, viste diffus moderat til sterk kjernekraft immunopositivity for PML.}

PML påvirkninger T-celle infiltrasjon /migrasjon in vitro

i lys av tapet av PML protein uttrykk og økningen i infiltrasjon av CD8 ^{+ T-lymfocytter til avansert magekreft vev, vi en hypotese om at PML bidratt til T-celle infiltrasjon /migrasjon i magekreft. For å undersøke om PML nivået i magekreftceller påvirkes T-celle migrasjon, klimaanlegg media fra SNU-638 celler transient transfektert med enten PML
siRNA eller PML IV uttrykk vektor, deretter behandlet med IFN-γ ble benyttet i Transwell migrasjon analyser. SNU-638 magecancerceller uttrykte høye nivåer av PML-protein, i overensstemmelse med tidligere funn [2], mens SNU-638-celler transfektert med PML
siRNA som vises reduserte nivåer av endogen PML uttrykket (~46-56%) , som bekreftet av immunoblotting (figur 2A). IFN-γ induserte en beskjeden økning i PML protein uttrykk, i samsvar med tidligere resultater [38]. Migrering av Jurkat T-celler mot kondisjonert medium fra PML
siRNA-transfekterte SNU-638-celler ble betydelig forbedret, sammenlignet med den for kontroll siRNA-transfekterte celler etter behandling med IFN-γ (figur 2B). Ved transfeksjon av SNU-638 med PML IV ekspresjonsvektor, migrering av Jurkat T-celler mot kondisjonert medium fra PML IV overuttrykt-celler ble redusert sammenlignet med tom vektor (figur 2C). Disse resultater antyder at PML regulerer nivåene av sekretoriske molekyler som produseres av og slippes ut fra IFN-γ-stimulerte magekreftceller, og påvirker også migreringen av T- lymfocytter.}

Tap av PML øker IFN-γ-indusert IP-10 uttrykk

Kjemokiner, en familie av kjemotaktiske cytokiner, fremme migrasjon av sirkulerende leukocytter /lymfocytter til steder med inflammasjon og skade. For å undersøke om chemokin nivåene ble påvirket av PML
genetisk status, chemokine genuttrykk ble undersøkt ved hjelp av ribonuklease beskyttelsestest (RPA). PML
<sup>+ /+ og PML
- /- mus embryonale fibroblast (MEF) celler ble inkubert i fravær eller nærvær av IFN-γ for 0-24 timer , total mRNA ble oppsamlet ved forskjellige tidspunkter og underkastet RPA. I PML
- /- MEFs, IP-10 mRNA nivåer økt 1,5 ganger på to timer, og ble markert forhøyet (8 ganger) etter 4 h (figur 3A). RANTES mRNA nivåene ble øket 3,2 ganger i 0,5 timer, og forble forhøyet, men i en lavere grad (1,3 ganger), 8 timer etter IFN-behandling γ in PML
- /- MEFs . Andre chemokin gener, inkludert MIP-1, MIP-2, og MCP-1, ble ikke påviselig uttrykt i PML
+ /+ eller PML
- /- MEFs (data ikke vist). STAT-1 uttrykk ble økt etter eksponering for IFN-γ i begge celletyper, men ingen forskjell var tydelig når IFN-y-nivåene ble sammenlignet mellom PML
+ /+ og PML
- /- celler. Som transkripsjon av IP-10-genet ble vesentlig forhøyet i IFN-γ-stimulert PML
- /- MEFs, vi målte relevante proteinnivåer i kultursupernatanter av PML
+ /+ og PML
- /- MEFs, ved hjelp av en enzymbundet immunosorbent assay (ELISA). I samsvar med RPA resultater, høyere nivåer av IP-10 protein var tydelig i kondisjonert medium fra IFN-γ-behandlet PML
- /- MEFs (figur 3B). Også, IP-10-mRNA-ekspresjon i PML
siRNA-transfekterte NIH3T3-celler ble forbedret, sammenlignet med kontroll siRNA-transfekterte celler, etter IFN-γ behandling (figur 3C). Reduksjonen i uttrykket av PML protein i PML
siRNA-transfekterte NIH3T3 celler ble bekreftet av immunoblotting.</sup>

Redusert PML uttrykk er omvendt korrelert med IP-10 proteinnivået i magekreft vev og SNU- 638 celler

Deretter undersøkte vi sammenhengen mellom IP-10 og PML protein uttrykk i avansert magekreft vev. Cancer vev ble farget for immunhistokjemisk PML og IP-10, og intensiteten av IP-10 immunopositivity ble målt som beskrevet i materialer og metoder. Den gjennomsnittlige intensiteten av IP-10 var 1,2 i 14 prøvene som viser diffus positivitet (DP) for PML, 2,2 i 19 tilfeller av fokal positivitet (FP), og 2,0 i 16 prøver hvor det ikke var fullstendig tap (CL) av PML uttrykket ( 4A, venstre panel). Signifikant økning i IP-10 uttrykk ble observert i prøvene viser fokus positivitet av PML ( P
= 0,034), sammenlignet med dem som viser diffuse positive PML uttrykk. Det ble observert en økning i IP-10 uttrykk når fullstendig tap av PML var tydelig, sammenlignet med hva som ble notert når PML var diffust uttrykk; Men denne forskjellen ikke statistisk signifikant. Representative eksempler på variasjoner i PML protein status som korrelerte med ulike IP-10 uttrykk nivåer i kreftceller fra avanserte mage karsinom er vist (figur 4A, høyre). For ytterligere å undersøke forholdet mellom IP-10 og PML protein ekspresjon i gastrisk karsinom-cellelinjer, IP-10-proteinnivåer ble målt i kultursupernatantene fra SNU-638-celler transient transfektert med enten PML
siRNA eller PML IV exression vektor. Celler ble dyrket i fravær eller nærvær av IFN-γ i 8 timer ble supernatanter oppsamlet, og IP-10 nivåer kvantifisert deri (ved ELISA). IFN-γ-indusert IP-10-sekresjon ble betydelig forbedret i SNU-638- PML
siRNA-transfekterte celler, sammenlignet med den av SNU-638-celler transfektert med kontroll siRNA (figur 4B). Transfeksjon av SNU-638 med PML IV ekspresjonsvektor trykkes IFN-γ-indusert IP-10-sekresjon (figur 4C). Resultatene viser klart at sekresjon av IP-10 fra magekreftceller blir øket når PML ekspresjon blir redusert.

IP-10 nøytralisering reduserer migrering av T-celler

SNU-638- PML
siRNA-inneholdende celler som uttrykker reduserte nivåer av PML-proteinet viste forbedring av T-celle-rekruttering og IP-10 som respons på IFN-γ (figurene 2 og 4), vi neste undersøkt hvorvidt en økning i IP- 10 nivåer tilrettelagt T-celle migrasjon mot kondisjonert medium fra SNU-638 mage kreft celler stimulert av IFN-γ. SNU-638- PML
siRNA-celler ble dyrket i fravær eller nærvær av IFN-γ i 8 timer, og de oppsamlede supernatantene ble forbehandlet med et anti-IP-10-nøytraliserende antistoff eller kontrollere ikke-spesifikk IgG i 1 time før begynnelsen av transwell analysen. Nøytraliserende antistoff eller IgG-holdige supernatanter ble plassert i de nedre kamre, og migrering av Jurkat-celler fra øvre til nedre kammer ble analysert ved å undersøke celler høstet fra de nedre kamre. Inkludering av IP-10-nøytraliserende antistoffer hemmet Jurkat T-celle migrasjon mot kondisjonert medium fra SNU-638- PML
siRNA celler (figur 5A). Disse funnene er i samsvar med data fra NIH3T3 celler; IP-10-nøytraliserende antistoff hemmet EL-4 T-celle migrasjon mot kondisjonert medium fra NIH3T3- PML
siRNA celler (figur 5B).

PML knockdown forbedrer IP-10 promoter aktivering

Som IP-10 uttrykk ble økt i PML knockdown celler, vi videre undersøkt om PML protein uttrykk påvirket IP-10 promoter aktivitet. Muse IP-10 promoter inneholder en antatt GAS-lignende element som ligger mellom nts -246 og -238 (TTN _{5AA) (Figur 6A). Vi har tidligere rapportert at PML regulerer transkripsjonen aktivitet av STAT-1 [17] negativt. For å finne ut om PML påvirket IFN-γ-indusert IP-10 genekspresjon via
en mekanisme som involverer STAT-en, vi isolert og genererte en reporter konstruere starter i posisjon -330 av murine IP-10 promoter inneholder formodede GAS lignende element, som beskrevet i Materialer og Metoder. IP-10- luc
reporter inneholder gasslignende element ble transient transfektert inn i NIH3T3-celler inkubert med eller uten IFN-γ i 24 timer, og deretter analysert for luciferase-aktivitet. IFN-γ-indusert IP-10 promoter-aktivitet ble betydelig forbedret i NIH3T3-celler transfektert med PML
siRNA, sammenlignet med celler som fikk kontroll siRNA (figur 6B). Ved transfeksjon av NIH3T3-celler med PML IV ekspresjonsvektoren, ble IFN-γ-indusert IP-10-promoteren aktivering betydelig undertrykt. Nedregulering av PML uttrykk ved hjelp av PML
siRNA og overekspresjon av PML ved PML IV ekspresjonsvektor ble verifisert av immunoblotting. For å avgjøre om den hemmende effekten av PML på IFN-γ-indusert IP-10 promoter aktivitet skjedde i magekreftcellelinjer utførte vi lignende eksperimenter med SNU-638 mage kreftceller. Mønstre av økning og reduksjon av luciferaseaktiviteten i SNU-638 var lik den for NIH3T3 celler (figur 6C). Nivået på PML protein uttrykk i SNU-638 celler transfektert med enten PML
siRNA eller PML IV ekspresjonsvektor ble verifisert ved immunoblotting (data ikke vist).}

PML knockdown øker IFN-γ- indusert STAT-en DNA binding til IP-10 promoter

effekten av PML på IFN-γ-indusert STAT-en DNA binding til IP-10 promoter ble videre undersøkt. PML protein overekspresjon i NIH3T3-celler, etter transient transfeksjon med PML IV ekspresjonsvektoren, delvis blokkerte IFN-γ-indusert STAT-1-DNA-binding til den IP-10-promoteren, innbefattende sekvensen ved -246 til -238 (figur 7A, sammenlign kolonnene 3 og 5). Konkurranse ved hjelp av en 100-molart overskudd av umerket oligonukleotid som koder for den IP-10-promoteren avskaffet kompleksdannelse (felt 6). Nivåene av PML og STAT-1 protein uttrykk i hel-cellelysater (WCL) og omfanget av STAT-en tyrosinfosforylering i kjerneekstrakter (NE) ble verifisert av immunoblotting. Utnytte NE fra NIH3T3- PML
siRNA-celler ble oppnådd etter 0,5 timer av IFN-γ behandling, sterk binding til muse-IP-10-promoteren ble observert (figur 7B, toppanelet, spor 5), sammenlignet med binding sett i NIH3T3-kontroll siRNA-celler (søyle 3). De samme NE ble utsatt for STAT-en konsensus oligonukleotid, og STAT-en DNA-binding ble forsterket i NE fra NIH3T3- PML
siRNA celler (figur 7B, midtpanelet, sammenlign spor 3 og 5). Ved hjelp av SNU-638 magekreftceller, fant vi også at STAT-1 DNA-binding av PML
siRNA-transfekterte SNU-638-celler ble forbedret sammenlignet med den for kontroll siRNA-transfekterte celler etter behandling med IFN-γ (figur 7C, sammenlign spor 3 og 5). Disse data indikerer at PML delvis inhiberer STAT-1 binding til IP-10-promoteren, og at denne effekten er korrelert med øket IFN-γ-indusert IP-10 transkripsjon i fravær av PML.

diskusjon

histopatologiske studier har vist at den inflammatoriske mikromiljøet av tumorer er kjennetegnet ved tilstedeværelsen av mononukleære celleinfiltrater, både i støtte stromaceller og tumor regioner. Men de nøyaktige mekanismene som mononukleære celler infiltrere og opprettholdes innenfor kreft vev er foreløpig ikke fullt ut forstått. I denne studien har vi bevis for at tap av uttrykk av svulst suppressor protein, PML, bidrar til forbedring av lymfocytter infiltrasjon i magekreft vev, via
regulering av IP-10 uttrykk.

Vi undersøkte funksjon av PML med hensyn til lymfocytt rekruttering ved hjelp av humane mage kreft vevsprøver, PML
<sup>+ /+ og PML
- /- MEFs, og PML knockdown i både NIH3T3 og SNU-638 celler. Data fra både menneskelig vev tester og transwell migrasjon analysene viste at tap av PML fremmer lymfocytt menneskehandel; derfor søkte vi mekanismer som kan muligens forklare disse observasjonene. Vi viser at en økning i IP-10 nivåer i kreftceller som uttrykker lave nivåer av PML bidrar til lymfocytt rekruttering. I tillegg, IP-10-nøytraliserende antistoff hemmet T-cellemigrasjon mot kondisjonert medium fra NIH3T3 fibroblaster og SNU-638 magecancerceller in vitro
, i samsvar med resultatet av flere tidligere in vivo-studier
som viste at nøytralisering av IP-10 undertrykte T-cellerekruttering [39], [40]. Så langt vi kjenner til, er dette den første studien som viser at tumor suppressor, PML, regulerer IP-10 kjemokin transkripsjon og lymfocytter handel med magekreft, ved å modulere aktiviteten av IFN-γ /STAT-1 signalveien.</sup>

IP-10, en lymfocytt-målretting CXC kjemokin indusert av type i og II-IFN, spiller en viktig rolle i lymfocytt rekruttering under flere inflammatoriske tilstander [41]. IP-10 blir utskilt av tumor-infiltrerende immunceller, og også ved tumor og parenchyma celler i en interferon og cytokin-anriket mikromiljøet. TAFs fra lungekreftpasienter konstitutivt produsere og skille ut IP-10 [27]. Hepatocytter infisert med hepatitt C-virus fremstille IP-10, og indusere migrering av aktiverte T-celler til leveren parenchyma, noe som indikerer at IP-10 nivåer er korrelert med histologisk alvorlighet og inflammasjon [42]. I vårt system, ble IP-10 sekresjon observert i mage kreft SNU-638-celler, NIH3T3-fibroblaster, og MEFs, som respons på IFN-γ, og sekresjon ble økt i fravær av PML-proteinekspresjon. Siden vi funnet at det ikke var noen signifikante forskjeller i nivået av STAT-1-ekspresjonen og fosforylering i fravær eller nærvær av PML på IFN-γ (figur 3 og 7), øket IFN-γ-indusert IP-10 transkripsjon i fravær PML skyldes i hovedsak økt STAT-en DNA binding til IP-10 promoter. Vi foreslår at PML-mediert hemming av STAT-en DNA-binding fører til undertrykkelse av STAT-1-avhengige IP-10 uttrykk, i tråd med våre tidligere funn [17]. I den foreliggende undersøkelse, identifiserer vi en potensiell regulatorisk område for PML i IP-10-promoteren, som er en antatt STAT-1-bindingssete. Videre viser vi at PML knockdown øker IFN-γ-indusert STAT-1-DNA-binding til den IP-10 promotoren, og forbedrer IP-10 nivåer i fravær av PML.

lymfocytter, nøytrofiler, makrofager, og mastceller er de viktigste komponentene i de fleste tumor infiltrater. Tumor-infiltrerende lymfocytter er blitt identifisert i en rekke faste cancervev. Men de spesifikke funksjoner av slike celler i tumorer, og den eksakte molekylære mekanismer for lymfocytt rekruttering i tumorer, forblir kontroversielt. Status og funksjonelle relevansen av CD8 ^{+ T-celle infiltrasjon i svulster, og foreningen av slike celler med pasientens prognose, er også uklart. I nyrecellekarsinom, er infiltrasjon av CD8 + T-celler forbundet med gunstig prognose [43]. Omvendt blir en slik infiltrasjon knyttet til ugunstig prognose i nonsmall celle lungekreftpasienter [33]. Vi her viser at PML protein ekspresjon i tumorceller er inverst korrelert med graden av infiltrering av CD8 + T-celler til tumorvev. Når funksjonen for PML i lymfatisk invasjon regnes sammen med foreningen mellom PML uttrykk og ugunstig prognose [2], er det tydelig at noen sammenheng mellom kliniske funksjoner og omfanget av CD8 + T-celleinfiltrasjon i magekreftpasienter krever ytterligere forklaring.}

Nuclei av normal mage slimhinnekjertlene, stromale vev og lymfoide celler var diffust immunopositive (moderat til sterk) for PML protein uttrykk, mens PML ble redusert eller avskaffet i tumorceller (Figur 1). Disse funnene støtter ideen om at kreftceller har spesifikke degraderingsmekanismer for PML. Vi vil foreslå at post-translasjonell proteasome avhengig nedbrytning forklarer tapet av PML protein. Med andre ord, er degradering på transkripsjonsnivået ikke operative [2], [44]. PML proteinekspresjon er redusert eller opphevet i mange forskjellige kreftformer, inkludert prostata, bryst, CNS, tykktarm, lunge, og magekreft [2], [3]. I samsvar med disse resultatene, observerte vi redusert eller ubetydelig uttrykk for PML i avansert ventrikkelcancer vev. Videre våre resultater tyder på at kreftceller som uttrykker ulike nivåer av PML protein varierer i sin evne til å tiltrekke seg og beholde lymfocytter i tumor områder, og dermed gi ytterligere bevis på at slike celler delta aktivt i etableringen av inflammatoriske tumor microenvironments, via
PML-mediert mekanismer.

NF-kB og STAT-3 signale er foreslått for å tjene som store reguleringssystemer knytte betennelse til kreft [45]. IL-6, et NF-kB-avhengige inflammatoriske vekstfaktor, er essensielt for utviklingen av betennelses forbundet karsinogenese [46]. Nyere indisier har ytterligere forsterket ideen om at IL-6 /gp130 /STAT-3 signale akse tjener som både en autokrin og parakrin amplifisering sløyfen i lunge adenokarsinom, multippelt myelom, Ras-transformerte kreftceller, og en kolitt-assosiert kreft modellen [47], [48], [49], [50]. PML har vist seg å undertrykke IL-6-indusert STAT-3-aktivitet [51], for å fremme apoptose via
en TNF-mediert prosess, og for å sensitivisere celler til apoptose ved å inhibere NF-kB-mediert overlevelse pathway [52]. Imidlertid er det fortsatt å fastslås om tap av tumor suppressor PML bidrar til endringene i vertens immunrespons eller tumoren mikromiljøet, kanskje noe som resulterer i enten immunosurveillance eller immun flukt, ved modulering av transkripsjonsfaktorer. Det ville således være interessant å sammenligne effektene av tap av PML-proteinet uttrykket i NF-kB /STAT-3 og STAT-1-signalering, og for å bestemme hvorvidt disse transkripsjonsfaktorer funksjon på en koordinert måte for å regulere ekspresjonen av en undergruppe av chemokiner som bidrar til etablering av inflammatoriske kreft microenvironments.

Materialer og metoder

Cells

Primær og udødelig PML
<sup>+ /+ og PML
- /- MEFs ble etablert og vedlikeholdt som tidligere beskrevet [53]. SNU-638 human gastrisk carconoma cellelinje, Jurkat human T-celle-lymfoblast-lignende cellelinje, og EL-4 mus T-lymfom cellelinjer ble opprettholdt som tidligere beskrevet [2], [54].</sup>

magekarsinom vev

Det er totalt 49 gastrisk karsinom parafinblokker ble hentet fra 49 pasienter (29 hanner, 20 hunner, median alder 64 år, range 35-84) som hadde gjennomgått total eller subtotal gastrektomi for stadium IV avanserte mage karsinom på Mokdong Hospital, Ewha Womans University School of Medicine, Seoul, Korea fra 2001 til 2007.

Reagenser og antistoffer

Rekombinant murine og humane IFN-γ (mIFN-γ og hIFN- γ) og MIP-10 og hip-10 ble kjøpt fra ProSpec (Rehovot, Israel). Antistoffer mot PML (monoklonalt) og STAT-en ble kjøpt fra Upstate Bioteknologi, Inc. (Lake Placid, NY, USA) og nøytraliserende antistoff mot IP-10 ble kjøpt fra R &D Systems (Minneapolis, MN, USA). Antistoff mot p-Y701-STAT-en ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistoffer mot histon ble Lamin B og PML (kanin polyklonale) kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA), og anti-tubulin antistoff ble kjøpt fra Sigma-Aldrich, Co. (St. Louis, Missouri, USA) .

Immunohistochemistry, ble celletall, og måling av immunreaktive områder

menneske~~POS=TRUNC mage kreft vev behandles for immunhistokjemisk analyse som tidligere beskrevet [2] med mindre modifikasjoner. Primære antistoffer for PML (1:200, Santa Cruz Biotechnology), CD8 (1:50; Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA), og IP-10 (1:50; R &D Systems) ble benyttet. Alle lysbildene ble kontra med Mayers hematoksylin. Positive kontroller ble innhentet ved hjelp av Palatine mandlene for PML protein og CD8, og nasopharyngeal udifferensierte karsinom for IP-10. Negative kontroller ble oppnådd ved å utelate primære antistoffer fra alle lysbilder. Immunopositivity for PML protein ble kategorisert som diffust positivitet (atom immunreaktivitet i ≥50% av tumorceller), fokal positivitet (i ≥10%, men < 50%), eller fullstendig tap (i < 10% av tumorceller). Numrene på CD8 immunopositive celler i en høy effekt felt (HPF, x40) på 0,25 mm ^{2 for fem tilfeldig valgte tumor infiltrerende grenser ble tellet for hver prøve, etterfulgt av beregningen av det midlere antall og SD. Immunopositivity for IP-10 ble definert som kjernefysisk eller cytoplasma positivt uttrykk i tumorceller. For å bestemme den uttrykte nivået på hvert bilde, ble digitale bilder innhentet ved hjelp av et mikroskop-montert digital kamera. Bruke ImageJ programvare (http://rsb.info.nih.gov/ij), hvert bilde ble konvertert til 8-bits gråtoner og området tettheter ble målt fra pikslene i regionen av interesse; eneste piksler som overstiger et visst nivå (> 50 intensitetsverdi). ble inkludert for å eliminere bakgrunnsfeil}

siRNA transfeksjon

NIH3T3 celler ble transient transfektert ved hjelp av Mirus transfeksjon reagens (Mirus Bio LLC, Madison,

• PLoS ONE: nedregulering av RPL6 av siRNA hemmer spredning og cellecyklusprogresjonen of Human magekreft cellelinjer
• PLoS ONE: MiR-29a Hemmer Cell Proliferation og induserer cellesyklus arrest gjennom nedregulering av p42.3 i Human Gastric Cancer