PLoS ONE: Sonic Hedgehog Pathway er avgjørende for vedlikehold av Cancer Stem-lignende celler i menneskets magekreft

Abstract

Unormal aktivering av Sonic pinnsvin (SHH) veien har blitt beskrevet i en rekke av kreft hos mennesker og i kreft stamceller (cscs), derimot, har rollen SHH veien i mage cscs ikke blitt rapportert. I denne studien undersøkte vi muligheten for at unormal aktivering av SHH banen opprettholdt egenskapene til mage cscs. Først identifiserte vi kreft stamceller lignende celler (CSLCs) fra menneskelige mage kreft cellelinjer (HGC-27, MGC-803 og MKN-45) med tumorsphere kultur. Sammenlignet med heftende celler, de flytende tumorsphere cellene hadde mer selvfornyende kapasitet og chemoresistance. Cellene som uttrykker cscs markører (CD44, CD24 og CD133) var også signifikant mer i tumorsphere celler enn i adherente celler. Enda viktigere, in vivo xenograft studier viste at svulster kan genereres med 2 x 10 ^{4 tumorsphere-celler, som var 100 ganger mindre enn dem som kreves for tumorer seeding av adherente celler. Deretter RT-PCR og Western blot viste at uttrykket nivåer av ptch og Gli1 (SHH sti målgener) var signifikant høyere i tumorsphere celler enn i adherente celler. Resultatene av kvantitativ real-time PCR var lik dem av RT-PCR og Western blot. Videre analyser viste at SHH veien blokkert av cyclopamine eller 5E1 forårsaket en større reduksjon i selvfornyende kapasitet på HGC-27 tumorsphere celler enn at de heftende celler. Vi fant også at SHH veien blokkerer sterkt forbedret effekt av cellegifter i HGC-27 tumorsphere celler in vitro og in vivo, men hadde ingen signifikant effekt på heftende celler. Til slutt, isolert vi tumorspheres fra magekreft prøven, disse cellene hadde også chemoresistance og tumorigent kapasitet, og SHH sti opprettholdt mage CSLCs kjennetegn tumorsphere celler fra primærtumorprøver. I konklusjonen, våre data antydet at SHH veien var avgjørende for vedlikehold av CSLCs i human magekreft}

Citation. Song Z, Yue W, Wei B, Wang N, Li T, Guan L, et al. (2011) Sonic Hedgehog Pathway er avgjørende for vedlikehold av Cancer Stem-lignende celler i Human Gastric Cancer. PLoS ONE 6 (3): e17687. doi: 10,1371 /journal.pone.0017687

Redaktør: Mikhail Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA

mottatt: 27 november 2010; Godkjent: 10 februar 2011; Publisert: 04.03.2011

Copyright: © 2011 Song et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National High Technology Research and Development Program of China (È6AA402A04,È6AA02A107), Major State Basic Research Program of China (È9CB521704), og Natur Science Foundation National of China (Ĵ72468Ĵ73031). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

cscs spille en viktig rolle i utviklingen av kreft, dette undergruppe innen svulst besitter egenskapene til selvfornyende kapasitet, chemoresistance og tumorigent kapasitet dermed kan spille en avgjørende rolle i initiering, progresjon og tilbakefall av kreft. Undersøke og manipulere biokjemiske mekanismer som er involvert i disse egenskapene er en av de beste måtene å bidra til cscs, som fører til utvikling av nye legemidler og behandlingsprosedyrer. SHH reaksjonsvei spiller en viktig rolle i mange cscs, for eksempel glioblastom stamceller [1], [2], CD34 + leukemiceller [3], [4] og bryst cscs [5], i tillegg, er det avgjørende for utvikling og homeostase av mavekjertel [6], kunne unormal aktivering av SHH veien resulterer i magekreft [7], [8], men er rollen til SHH bane i mave cscs ikke klart.

SHH pathway in pattedyrceller er mediert av ligander Shh [9]. I fravær av Shh, det transmembrane reseptor lappet (ptch) inhiberer aktiviteten av en annen transmembranprotein, glattes (Smo), noe som resulterer i inaktivering av SHH pathway [9], [10]. Binding av Shh til ptch opphever den hemmende effekten av ptch, og Smo er derepressed, og dermed aktivere transkripsjonsfaktor Gli (Gli1, Gli2 og Gli3) [9], [10]. Gli1 er en sterk positiv aktivator av nedstrøms målgener og er i seg selv en transkripsjonen mål av SHH pathway [11]. Derfor er Gli1 ansett som en markør for SHH pathway unormal aktivering [10], [12]

Nylig har flere typer cscs eller CSLCs blitt identifisert og isolert fra ondartede svulster [13] - [25].. I magekreft, metodisk, er det vanskelig å isolere og forsterke cscs fra cellelinjer eller prøver svulst vev. På det nåværende tidspunkt synes CD44 å være mest nyttig markør for potensiell rensing av gastrisk cscs, er det imidlertid ikke meget spesifikt for gastrisk cscs [26].

I denne studien ble det isolert CSLCs fra human gastrisk kreftcellelinjer (HGC-27, MGC-803 og MKN-45) ved bruk av tumorsphere dyrking i serumfritt medium og identifisert selvfornyelse kapasitet, chemoresistance og tumorgene kapasitet på tumorsphere celler; neste, vi undersøkte uttrykk for Shh pathway-relaterte molekyler, inkludert Shh, ptch, Smo, Gli1 og Gli2 i tumorsphere celler og heftende celler, spesielt uttrykk for ptch og Gli1.Then, blokkerte vi SHH sti av cyclopamine eller kontroll tomatidine, 5E1 eller kontroll PBS for å undersøke om egenskapene til CSLCs i tumorsphere celler ble holdt ved unormal aktivering av SHH pathway. Til slutt, benyttet vi primære magekreft prøver å analysere de funksjonelle aspektene av SHH sti i mage CSLCs.

Cyclopamine er en celle-gjennomtrengelig steroidal alkaloid. Det forstyrrer kolesterol bio-syntese og spesielt i fiendskap SHH signalveien gjennom direkte interaksjon med Smo (glattes), en fjern slektning av G-protein-koblede reseptorer. Det er et verdifullt verktøy for å studere involvering av SHH signalering i utviklingen av ulike svulster. Tomatidine er et steroid alkaloid som strukturelt ligner cyclopamine, men mangler evnen til å hemme SHH signalering. Den kan brukes som en negativ kontroll. 5E1 er en anti-Hh monoklonalt antistoff som nøytraliserer SHH og IHH aktivitet.

Resultater

1. Tumorsphere celler besatt egenskapene CSLCs

Vi vokste HGC-27, MGC-803 og MKN-45 heftende celler i serumfritt medium beskrevet i metodedelen. Etter 7 dager ble tumorspheres bestående av omtrent 50 til 100 celler observert (Fig. 1A).

Den selvpolerende effekt for disse tumorspheres ble bedømt ved å dissosiere dem i enkelt celle og vokser med en klonal densitet på 1000 celler pr milliliter. Etter 2 uker, avledet enkelt celle fra HGC-27 tumorsphere celler generert under tumorspheres på 41,83% ± 3,13% mot 8,17% ± 2,40% av heftende celler, dessuten i MGC-803 og MKN-45, den under tumorspheres formasjon hastighet på tumorsphere celler var også høyere enn den for adherente celler. (Fig. 1B). Disse data antydet at det selvfornyende kapasitet på tumorsphere celler var signifikant høyere enn for adherente celler. Tumorsphere celler viste også en økt evne til å danne kolonier i henhold til forankringsuavhengige forhold i en standard soft agar-analysen etter 14 dager i HGC-27 og MKN-45 (Fig. 1C).

Vi utførte også en begrensende fortynning assay for sfæroidene i formasjonen ved hjelp av HGC-27 tumorsphere celler og adherente celler, respektivt. Som vist i tabell S1, kan omtrent 27-35% av tumorsphere celler produserer sfæroider, mens mindre enn 5% av adherente celler kan generere kuler etter 3 ukers kultur. Derfor, i HGC-27 tumorsphere celler, kan vi anslå at kulene dannende celler befolkning består maksimalt 35%.

Chemoresistance er et annet karakteristisk for cscs, så vi undersøkt om en forskjell i chemoresistance eksisterte mellom tumorsphere celler og heftende celler. Resultatene viste at etter 48 timer, tumorsphere celler viste signifikant større motstand mot legemidler sammenlignet med adherente celler under de samme betingelser (Fig. 1D). Vi har også vurdert chemoresistance av HGC-27 tumorsphere celler og heft celler til ulike konsentrasjoner av narkotika, men både tumorsphere celler og festede celler viste ikke signifikant chemoresistance til narkotika på en doseavhengig måte (fig. S1).

Deretter undersøkte vi uttrykket av CD44 i dissosiert tumorsphere celler og heft celler ved hjelp av immunfluorescens analyse og western blot. Resultatene viste at celler som uttrykker CD44 var signifikant mer i tumorsphere celler enn i adherente celler (Fig. 2A). Dessuten ble uttrykket av andre cscs markører (CD24 og CD133) i tumorsphere celler og heft celler undersøkt ved western blot, sammenlignet med tumorsphere celler, uttrykket av CD24 var betydelig lavere i heftende celler, mens uttrykket av CD133 var lik (Fig . 2B). Videre vi fraksjonert HGC-27 celle ved FACS sortering for CD44, fant vi at CD44 (+) cellefraksjon kan generere flere sfæroide kolonier mot CD44 (-) cellefraksjon, dessuten, på størrelse med sfæroide kolonier fra CD44 (+) celler var større enn de fra CD44 (-) (fig. 2C). cellene

2. Tumorsphere celler kan generere svulster ved xenotransplantasjon

For xenograft studier, like mange (2 × 10 ^{4, 2 × 10 5, 2 × 10 6, 2 × 10 7) friskt dissosiert tumorsphere celler eller kontrollheftende celler ble injisert sc inn i hver mus (6 mus pr gruppe). Resultatene viste at svulster ble samlet med 2 x 10 4 tumorsphere-celler, som var 100 ganger mindre enn dem som kreves for tumor poding av adherente celler (tabell 1). Videre tumorsphere celler generert subkutane tumorer med større volum og kortere tid sammenlignet med dem som genereres fra adherente celler (fig. 3A, B). Dermed subkutan injeksjon av lavt antall tumorsphere celler bekreftet at de sfæroide cellene beholdt sterkere tumorigent kapasitet i hårløse mus enn heftende celler}

H &. E undersøkelse av xenografter avledet fra HGC-27 tumorsphere celler viste at disse svulstene nøye lignet den opprinnelige humane tumor, som hovedsakelig inneholder differensierte celler (fig. 3C). Viktigere, tumorspheres kunne bli gjen avledet fra xenotransplanted tumorer (fig. 3D), og de kan danne tumor igjen (figur 3E.). Disse dataene derfor signalisert at de tumorsphere cellene representert CSLCs som hadde tumorigent kapasitet.

3. SHH veien ble høyere uttrykt i tumorsphere celler enn i heftende celler

For å undersøke sammenhengen mellom SHH sti og CSLCs kjennetegn tumorsphere celler, må vi først undersøkte mRNA uttrykk for Shh pathway-relaterte molekyler, inkludert Shh, ptch, Smo, Gli1 og Gli2 ved RT-PCR. Resultatene viste at alle mRNA ble uttrykt i høye HGC-27 tumorsphere celler. Sammenlignet med tumorsphere celler, uttrykket nivåer av Shh, ptch, Smo og Gli1 var betydelig lavere i heftende celler, mens uttrykket nivåer av Gli2 var lik tumorsphere celler. I MGC-803 og MKN-45, uttrykket nivåer av Shh, ptch og Gli1 var også signifikant lavere i adherente celler enn i tumorsphere celler, mens uttrykket nivåer av Smo og Gli2 hadde ingen signifikant forskjell mellom adherente celler og tumorsphere celler (Fig . 4A).

I SHH vei, ptch og Gli1 er målet gener, de anses som viktige markører for SHH pathway unormal aktivering. Så, vi videre undersøkt uttrykket nivåer av ptch og Gli1 av Western blot og kvantitativ real-time PCR.

Når du bruker Western blot, fant vi at uttrykket nivåer av ptch og Gli1 var også høyere i tumorsphere celler enn i adherente celler (fig. 4B). Vi neste vurdert uttrykket nivåer av ptch og Gli1 i xenografter fra HGC-27 av kvantitativ real-time PCR. Kvantitativ real-time PCR-analyser av Shh målgener (ptch og GLI1) viste samme resultat på over halv kvantitativ RT-PCR (fig. 4C).

4. SHH pathway blokkering redusert selvfornyende kapasitet og chemoresistance av HGC-27 tumorsphere celler

For å teste for en mulig rolle SHH sti i selvfornyende kapasitet på tumorsphere celler, vi brukte cyclopamine eller kontroll tomatidine, 5E1 eller kontroll PBS for å blokkere reaksjonsveien.

resultatene viste at cyclopamine behandling førte til en signifikant reduksjon i kapasitet for dannelsen av sub-tumorspheres i HGC-27 tumorsphere-celler på en doseavhengig måte, men ingen slik virkning Det ble ikke observert i adherente celler (fig. 5A). Vi vurderte videre om behandling med cyclopamine vil påvirke koloniene dannelsen kapasiteten HGC-27 tumorsphere celler ved forankrings-uavhengig vekst analysen. På lignende måte ble det evne til å danne kolonier reduseres mer i de tumorsphere cellene på en doseavhengig måte i forhold til de adherente celler (Fig. 5B).

Deretter undersøkte vi effekten av SHH veien på chemoresistance av HGC -27 tumorsphere celler, behandlet vi de dissosierte cellene med cyclopamine eller kontroll tomatidine i 48 timer, og deretter medikamentresistens av tumorsphere celler ble evaluert. Når cyclopamine ble etterfulgt av legemidler, behandling resulterte i en betydelig forbedret total celledød hastighet. De beste resultater ble oppnådd når cyclopamine ble kombinert med oksaliplatin pluss Mitomycin (fig. 5C). Ingen slik synergistisk effekt ble observert i adherente celler etter eksponering for medikamenter med cyclopamine i 48 timer (fig. 5D).

analyseres også effekten av forskjellige konsentrasjoner av cyclopamine (2,5 um, 5 um, 10 uM) på celledød. Resultatene viste at cyclopamine alene til tumorsphere celler kan gjøre en liten, men konsekvent reduksjon i levedyktig celleantall. Sammenlignet med HGC-27 tumorsphere celler, effekten av cyclopamine på celledød å heftende celler var mer betydning (Fig. 5C, D).

Når SHH veien ble blokkert av 5E1 eller kontrollere PBS, resultatene av selv -renewing kapasitet og chemoresistance av tumorsphere celler og adherente celler var lik de som er blokkert av cyclopamine eller kontroll tomatidine (fig. S2).

5. SHH veien blokkerer forbedret tumor respons på legemidler in vivo

For å teste denne hypotesen in vivo, analyserte vi om SHH pathway blokkerer forbedret kjemoterapi effekt, cyclopamine eller kontroll tomatidine ble brukt til å hemme Hysj pathway svar. HGC-27 tumorsphere cellene ble tillatt å vokse inn i begge de bakre flanker av nakne mus til den større diameter av tumoren nådde omtrent 2 mm. Musene ble deretter behandlet to ganger i uken i 3 uker med cyclopamine eller kontroll tomatidine 24 timer før Oxaliplatin levering. I alle behandlede mus, tumorer behandlet med oksaliplatin var betydelig mindre enn de som ikke ble behandlet med oksaliplatin. Videre tumorer viste betydelig større hemning av tumorvekst når de ble behandlet med oksaliplatin i kombinasjon med cyclopamine, ble tumorrespons til kjemoterapeutisk medikament forbedret ved cyclopamine (fig. 6A, B). Vi har også undersøkt om SHH veien blokkert av 5E1 eller tak PBS forbedret kjemoterapi effekt in vivo, viste resultatene at 10 ug /ml 5E1 behandling førte til en signifikant høyere tumorvekstinhibitering enn de som bare ble behandlet med oksaliplatin (fig. 6A, B).

Disse data antydet at selv om vanlige cellegifter forsinket svulst utvekst under behandlingen, da de ble kombinert med cyclopamine eller 5E1, ble effekten av kjemoterapi betydelig forbedret, og også mer vedvarende etter behandlingsavbrudd.

Neste, for å undersøke om blokkering SHH pathway in vivo hadde en spesifikk effekt på HGC-27 tumorsphere celler. Musene ble bare behandlet cyclopamine på høyre bakre flanke eller kontroll tomatidine på bakre venstre flanke (to ganger i uken i 3 uker) når svulster fra HGC-27 tumorsphere cellene nådde ca 2 mm, etter 3 uker, utførte vi en begrensende fortynning analysen for sfæroidene formasjon ved bruk av tumorceller behandlet med cyclopamine og behandlet med tomatidine, respektivt. Som vist i Tabell S2, kan omtrent 9-15% av cellene fra xenotransplanted tumor behandlet med tomatidine produsere kuler, mens mindre enn 2,5% av cellene fra xenotransplanted tumor behandlet med cyclopamine kan generere sfæroider. Derfor blokkerer SHH pathway in vivo kunne redusere antallet mage CSLCs.

6. SHH veien opprettholdes mage CSLCs kjennetegn tumorsphere celler fra primærtumorprøver

For å avgjøre om SHH veien kan være involvert i mage cscs kjennetegn tumorsphere celler fra magekreft vev, benyttet vi primære magekreft prøver å analysere funksjonelle aspekter av SHH veien i mage CSLCs.

Først vi vokste ferskt dissosierte bulk celler fra mage kreftprøver i serumfritt medium beskrevet i metodedelen, etter 10 dager, tumorspheres ble observert (fig. 7A, B). Deretter undersøkte vi chemoresistance og tumorigent kapasitet tumorsphere celler fra magekreft vev. Resultatene viste at tumorsphere celler fra magekreft vev viste signifikant større motstand mot medikamenter enn bulk-celler under de samme betingelser (Fig. 7C). Videre ferskt dissosierte bulkceller fra magekreftprøvene injisert med 2 x 10 ^{7 celler per mus var i stand til å etablere subkutane tumorer, mens så lite som 2 x 10 4 av de tumorsphere celler fra magekreft prøver kan danne svulster (tabell 1), de xenoimplantater svulster som resulterte fra injeksjon av tumorsphere celler presenteres de samme histopatologiske funksjoner som deres respektive human tumor (fig. 7F). Resultatene viste at tumorsphere celler fra magekreft vev besatt egenskapene CSLCs. Deretter observerte vi effekten av SHH veien blokkering på chemoresistance av tumorsphere celler in vitro og tumorrespons til legemidler in vivo. Resultatene viste at cyclopamine eller kunne 5E1 resulterte i en betydelig forbedret den generelle celledød hastighet (Fig. 7D) og svulsten reaksjon på stoffet (Fig. 7E).}

Diskusjoner

cscs deler mange egenskaper med vev stamceller, så som selvfornyelse, proliferasjon, chemoresistance, og er primært ansvarlig for å opprettholde veksten av tumorer [27], [28]. Mange forskere har brukt fluorescens-aktivert cellesortering for å identifisere og isolere cscs og fastslått at disse cellene kan danne kuler i spesialiserte serumfritt medium. I denne studien tok vi det motsatte tilnærmingen ved å utvikle tumorsphere celler og deretter bestemme om disse cellene kjøpt cscs egenskaper.

Vi brukte et definert serumfritt medium bestående av EGF, FGF-2, B-27 supplement og N-2-supplement for å opprettholde mage cancer-cellelinjer. Disse forholdene hadde blitt brukt før for å opprettholde endogene nevrale stamceller /stamceller og tumor stamceller fra menneskelige tumorer og tumorcellelinjer. For eksempel, Kondo et al. [24], karakterisert C6 rottetumorcellelinjer in vitro og in vivo, og har observert en liten populasjon av stilk-lignende celler avledet fra den vel-karakterisert side befolkning. Setoguchi et al. [29] viste kreft stilk lignende cellepotensialet i andre kreftcellelinjer, inkludert MCF7- brystkreft linje, B104 neuroblastom, og HeLa adenokarsinom.

I vårt eksperiment, vi brukte tre mage kreft cellelinjer (HGC- 27, MKN-45 og MGC-803) til kultur tumorspheres. HGC-27 cellelinje ble etablert av kulturen i metastatisk lymfeknute fra et magekreftpasient diagnostisert histologisk som udifferensiert karsinom. MKN-45 ble etablert i det dårlig differensiert adenokarsinom i magen av en 62 år gammel kvinne. MGC-803 er en epitelial dårlig differensiert human mage muco-adenokarsinom cellelinje fra en 74-år gammel mann.

To ulike tilnærminger har vanligvis blitt brukt til å identifisere cscs i publiserte studier [30], [31] . Den ene er en in vitro metode kalt "spheroid koloni formasjon," og en annen er in vivo metode som involverer implantering av kandidat cscs under huden på immunsvikt mus.

Den tidligere metoden innebærer dyrking kandidat cscs i kultur retter spesielt belegg for noncell vedlegg med serum-frie medier som inneholder epidermal vekstfaktor og grunnleggende fibroblast vekstfaktor. Veksten av kuleformede kolonier etter noen uker anses som indikerer selvfornyelse evne, og ville være i samsvar med en CSC fenotype. Den siste metoden-vekst av celler i immunsvikt mus-er nødvendig for å demonstrere sann tumorigenicity og er generelt ansett som gullstandarden for å bevise eksistensen av cscs. En rekke studier har antydet at disse to tilnærmingene generelt gi lignende resultater i vurderingen av kandidat cscs for mange solide svulster.

I dag, mage cscs har ikke spesifikke overflatestakere, så vi utviklet tumorsphere celler og deretter avgjøres om disse cellene ervervet cscs egenskaper, herunder selvfornyende kapasitet, chemoresistance og tumorigent kapasitet.

Våre data viste at magekreftcellelinjer (HGC-27, MGC-803, MKN-45) dyrket i et definert serum- fritt medium kunne danne tumorspheres som inneholdt cellene oppfører seg som CSLCs. In vitro tumorsphere celler viste en økt evne til å danne kolonier i myk agar etter forankringsuavhengig forhold og en økt evne til å danne under tumorspheres. Vi viste også at den selvfornyelse evne til å danne under tumorspheres av HGC-27 tumorsphere celler hadde en økning på passasjene 2 til 8 (fra 44,5% til 70,5%), og deretter det opprettholdes en forholdsvis stabil andel etter 8 eller mer passasjer når dyrket ved klonal tetthet (fig. S3). Disse data antydet at proliferativ potensialet i tumorsphere celler ble opprettholdt etter lengre passasjer. I tillegg tumorsphere celler in vitro var mer resistente overfor oksaliplatin og Mitomycin sammenlignet med adherente celler, disse dataene antydet at tumorsphere cellene bestå av anrikede antall CSLCs, noe som potensielt har gjort dem mindre utsatt for virkningene av både oksaliplatin og Mitomycin. In vivo, kan tumorsphere celler generere svulster ved xenotransplantasjon på en høyere rente enn heftende celler. Videre tumorsphere celler generert subkutane svulster med større volum og kortere tid sammenlignet med de som genereres fra heftende celler, Viktigere tumorspheres kan bli re-avledet fra xenotransplanted svulster, og de kunne danne svulst igjen, disse dataene antydet at tumorspheres ble beriket i CSLCs .

i vår studie adherente celler antagelig inneholdt en forholdsvis lav prosentandel av cscs, som ingen metode for isolering eller fjerning av disse cellene ble anvendt. Det kan argumenteres for at det er denne liten bestand av cscs som er ansvarlig for tumordannelse. Uansett, flere cscs var tydelig i de tumorsphere celler, noe som kan forklare det mer aggressiv atferd.

Deretter undersøkte vi om hva som kjennetegner CSLCs i tumorspheres ble opprettholdt ved unormal aktivering av SHH veien. Først må vi viste at mRNA ekspresjonsnivåer av shh sti-relaterte molekyler (Shh, ptch og Gli1) var signifikant høyere i tumorsphere celler enn i adherente celler, mens Gli2 var høyt uttrykt i begge celler. Vi videre undersøkt uttrykket nivåer av Hysj veien målgener (ptch og Gli1) av Western blot og kvantitativ real-time PCR, resultatene var lik de RT-PCR. For det andre, hemming av SHH pathway aktivitet ved cyclopamine eller 5E1 førte til redusert selvfornyelse kapasitet og økt følsomhet for narkotika i HGC-27 tumorsphere celler, men disse effektene ble ikke uttalt i heftende celler. In vivo, i alle behandlede mus, tumorer behandlet med oksaliplatin var betydelig mindre enn de som ikke ble behandlet med oksaliplatin, etter behandling med cyclopamine eller 5E1, ble tumorrespons overfor kjemoterapeutiske medikamenter forbedret. Disse data antydet at selv om vanlige cellegifter forsinket svulst utvekst under behandlingen, da de ble kombinert med cyclopamine, ble effekten av kjemoterapi betydelig forbedret, og også mer vedvarende etter behandlingsavbrudd.

Til slutt, vi utnyttet primære magekreft prøver å analysere de funksjonelle aspektene av SHH sti i mage CSLCs. Resultatene viste at tumorsphere celler fra magekreft prøven hadde også chemoresistance og tumorigent kapasitet, dess SHH pathway blokkering redusert chemoresistance av tumorsphere celler og forbedret tumor respons på legemidler in vivo.

Som for chemoresistance, flere funksjoner i cscs kan gjør dem vanskelige å eliminere. Cscs er relativt stille, og dette gir dem mulighet til å flykte fra kjemoterapeutiske regimer som vanligvis er rettet mot aktivt sykling celler. Dessuten, som vist i deres normale motstykke, cscs er blitt foreslått for å fremvise ekspresjon i høyt nivå av multi transporter familie gener, sannsynligvis som resulterer i mer effektiv utstrømning av kjemoterapeutiske medikamenter og medfødt multimedikamentresistens i tillegg signalveier, for eksempel Wnt, pinnsvin eller Notch, er dysregulerte i cscs fører til kreftutvikling. Utviklingen av en effektiv terapeutisk tilnærming vil derfor kreve identifikasjon av karakteristiske molekylære stier aktive i cscs og identifisering av agenter som kan enten blokkere CSC spredning eller indusere CSC differensiering, og dermed forsterke følsomheten til cellegifter. Så viktige faktorer som påvirker chemoresistance av cscs er iboende faktorer. Mikromiljøet, eller nisje, kan påvirke evnen til cscs å spre seg, migrere eller invadere. Nisjen er en oppankringsstedet for cscs og adhesjonsmolekyler eller microenvironmental løselige molekyler, inkludert vekstfaktorer og cytokiner, kan bidra vesentlig til den Ingen respons på behandling. Selv om hemming av SHH sti ved cyclopamine eller 5E1 vil være en nyttig strategi, i vår studie, viste vi at reseptorkomponenten ptch og transkripsjonsfaktor Gli1 ble også høyt uttrykt i tumorsphere celler. Så, ptch eller Gli1 kan være et alternativ mål for behandling av magekreft. En mulig strategi er å bruke små interfererende RNA (siRNA) eller shRNA spesifikt for ptch eller Gli1, men mage CSLCs i tumorsphere celler har ikke vært helt renset, må vi ytterligere rense mage CSLCs, så dette arbeidet vil bli gjort i vår videre studie.

i konklusjonen, viste vi at SHH veien kan være involvert i selvfornyelse, spredning, resistens og tumorigent av tumorsphere celler og foreslår at strategier som tar sikte på å hemme Shh trasé representerer en begrunnelse terapeutisk tilnærming til målet mage cscs.

Materialer og metoder

dyreetikk erklæringen

Mann atymiske nakne mus (nu /nu), 6 til 8 uker gammel, ble hentet fra Beijing Vital-elven Lab Animal Technology Co Ltd (SCXK JING 2007-0001) og ble holdt under patogenfrie forhold i barriere dyret anlegget. Alle mus ble gjennomført under godkjente retningslinjer Laboratory Animal Center of Military Academy of Medical Sciences (SYXK juni 2002-001).

Culture of heftende celler, tumorspheres og sub-tumorspheres

Menneskelig magekreft -cellelinjer (HGC-27, MGC-803 og MKN-45) oppnådd fra Peking Union Medical College ble dyrket i 1640 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og sådd ut med en tetthet på 1 x 10 ^{6 levende celler per 75-cm 2 kolbe. Når cellene festet, passert vi dem på samløpet. Tumorspheres ble utledet ved å plassere de adherente cellene i serumfritt 1640 dyrkningsmedium inneholdende 1% N-2-supplement (Invitrogen), 2% B-27 supplement (Invitrogen), 1% antibiotikablanding (Gibco), 20 ng /ml human FGF -2 (Chemicon), og 100 ng /ml EGF (Chemicon), og de adherente celler ble sådd ut i 24-brønners ultra-lav festeplate (Corning) på 500 celler per brønn. 2 uker senere, platene ble analysert for tumorspheres dannelse og ble kvantifisert ved hjelp av en invertert mikroskop (Olympus) på 40 × og 100 × forstørrelse.}

Etter primær tumorspheres nådd størrelse på ca 200-500 celler per sfære, den tumorspheres ble dissosiert med en tetthet på 1000 celler pr ml og 100 pl enkeltcelle-suspensjon ble podet i hver brønn av 24-brønners ultra-lav festeplate (Corning) i serumfritt medium er beskrevet ovenfor. Hver brønn ble kontrollert for enkel celle, og bare de brønnene som inneholdt enkelt celle ble merket. 2 uker senere, brønner ble analysert med hensyn til sub-tumorspheres formasjon. Normale adherente celler ble anvendt som kontroll for evne til å danne under tumorspheres. For å teste sammenhengen mellom SHH sti og dannelsen av under tumorspheres, behandlet vi de dissosierte celler med cyclopamine (2,5 mikrometer, 5 mikrometer, 10 mm) eller kontroll tomatidine, 5E1 (10 ug /ml) eller kontrollere PBS og observert dannelse under tumorspheres.

mage~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP vevsprøve

den menneskelige friske, sterile magekreft vevsprøver ble oppnådd i samsvar med de etiske standarder for institusjonskomiteen på menneskelig eksperimentering fra 15 pasienter (alder range 70-85 år) som gjennomgikk en magekreft reseksjon, etter å ha innhentet informert samtykke fra pasientene (tabell S3).

Da prøvene ble nedsenket i 95% etanol i 2-3 sekunder for å unngå forurensning, og vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS) og antibiotika flere ganger for å fjerne blodet. Etter dette, ble overflaten av vevsprøvene kreft fjernet og de indre deler ble skåret i 1-3 mm ^{3 store stykker. Deretter ble de spaltet i kollagenase og dispase oppløsning ved 37 ° C, etter 4 timers inkubering, ble oppløsningen inneholdende de fordøyde vevet sentrifugert for å fjerne den kollagenaseoppløsning. Cellepelleten ble vasket en gang med 1640-medium før den ble suspendert i serumfritt 1640 medium inneholdende 1% N-2-supplement, 2% B-27 supplement, 1% antibiotikablanding, 20 ng /ml human FGF-2, 100 ng /ml EGF og belagt i 24-brønnen ultra-lav festeplate. Alle kulturer ble inkubert ved 37 ° C i kuvøser som følger med luftfuktighet og 5% CO _2.}

Anchorage uavhengig vekst analysen

For å observere selvfornyende kapasitet ytterligere, myk agar-analysen ble anvendt for å bestemme dannelsen av kolonier tumorsphere celler og adherente celler i henhold til forankrings-uavhengig betingelser. Hver brønn i en seks-brønns plate ble belagt med 1 ml 10% FBS 1640 medium med 1% agarose. Etter 20 min inkubasjon ved 37 ° C, ble et likt antall (500) av tumorsphere celler eller adherente celler tilsatt i 1 ml 10% FBS 1640-medium med 0,5% agarose. For å teste sammenhengen mellom SHH sti og kolonier formasjon under forankringsuavhengig forhold, behandlet vi de dissosierte celler med cyclopamine (2,5 mikrometer, 5 pm, 10 uM) eller kontroll tomatidine, 5E1 (10 ug /ml) eller kontrollere PBS.

• PLoS ONE: Wnt /β-catenin Signa Forbedrer syklooksygenase-2 (COX2) transkripsjonen aktivitet i Gastric Cancer Cells
• PLoS ONE: En beregningsmetode for Prediksjon av Utløps Proteiner og Søknad til Identifikasjon av magekreft Markører i Urine