PLoS ONE: In vitro karakterisering av Rapid Cytotoksisitet av Anticancer Peptide HPRP-A2 gjennom Membran Destruction og Intracellulær Mechanism mot Gastric Cancer Cell Lines

Abstract

I denne studien HPRP-A2, et syntetisk 15-mer kationiske peptider med alle D-aminosyrer, effektivt hemmet overlevelsen av gastriske cellelinjer på en doseavhengig måte. Gastric kreftceller drap etter HPRP-A2 innebærer en rask kollaps av membranintegritet og intracellulære veier. Propidiumjodid (PI) og laktat-dehydrogenase (LDH) analyser viste at en times behandling med HPRP-A2 ført til membranen endringer i gjennomstrømningen av BGC-823-celler på en doseavhengig måte. Videre HPRP-A2-indusert apoptose i BGC-823 celler innebærer en markert økning i produksjon av reaktive oksygenarter (ROS), caspase-3, -8 og -9 aktivering, en reduksjon av mitokondriemembranpotensialet (MMP), og cellesyklus arrest i G1 fasen. I tillegg til den iboende cytotoksisitet, HPRP-A2 synergized sterkt med doxorubicin (DOX) for å øke effekten av å drepe gastrisk tumorceller i n vitro
. Vi tror at HPRP-A2 med alle D-aminosyrer kan være en potent kandidat av kreftbehandling, spesielt i kombinasjonsbehandling

Citation. Zhao J, Hao X, Liu D, Huang Y, Chen Y (2015 ) In vitro
Karakterisering av Rapid Cytotoksisitet av Anticancer Peptide HPRP-A2 gjennom Membran Destruction og Intracellulær Mechanism mot magekreft cellelinjer. PLoS ONE 10 (9): e0139578. doi: 10,1371 /journal.pone.0139578

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

mottatt: 02.07.2015; Godkjent: 15 september 2015; Publisert: 30.09.2015

Copyright: © 2015 Zhao et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir

Finansiering:. Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation National of China (No. 81373445, YXC og nr 21442001, YBH) og Foundation Natural Science of Jilin-provinsen (No. 20150101189JC , YC og nr 20140101042JC, YBH). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

i løpet av de siste tiårene, selv om gjennombrudd har blitt oppnådd i utviklingen av kreft terapi, motstand og ikke-spesifikk toksisitet av konvensjonelle legemidler er fortsatt flaske-hals problemer for potensielle klinisk praksis [1-3]. Derfor er det sterkt behov for å utvikle nye medikamenter med ulike virknings som kan overvinne svakhetene ved mange tilgjengelige medikamenter.

I dag er den potensielle anvendelser av kreft peptider (ACPS) som terapeutiske midler for behandling av kreft progresjon tiltrekke mer oppmerksomhet enn konvensjonell kjemoterapi hovedsakelig på grunn av de følgende egenskaper: (1) høy spesifisitet. De positivt ladede peptider selektivt målet kreftceller som bærer negative ladninger og har ulike membrankomponenter fra normale celler [4, 5], (2) roman virkningsmekanisme. Det kan unngå etablert multiresistensmekanismer [5-7]; (3) synergistisk anticancer virkning med kjemoterapeutika. Det har blitt rapportert at visse ACP-posisjoner kan produsere synergistisk anticancer aktivitet når kombinert anvendelse sammen med forskjellige konvensjonelle anticancer legemidler [8-10].

Den generelle mekanismen for peptid-indusert celledød er cytoplasmisk membran avbrudd via micellization eller poredannelse selv om noen av ACP-posisjoner er rapportert å utløse apoptose etter døden reseptor sti og /eller mitokondriell sti [8, 11]. Videre kan poredannelse på cellemembranen og endringen av membranpermeabilitet tilveiebringe en bedre kanal for oppføring av andre anticancer legemidler inn i celler og forbedre deres anticancer aktivitet [8, 12].

Vårt tidligere studie har vist at HPRP-A2 kan indusere celledød og samtidig forbedret DOX /epirubicin (EPI) -indusert apoptose i HeLa og HepG2 cellelinjer [12]. I tillegg, på grunn av D-aminosyre-sammensetning, er HPRP-A2 resistent overfor proteolytisk spaltning og beholder tilsvarende anticancer aktivitet til dets L-enantiomerer [6, 12]. Basert på tidligere studier, har vi som mål å oppnå to mål i denne studien: å avgrense den underliggende anticancer mekanisme HPRP-A2 og å undersøke synergistisk anticancer effekt på BGC-823 og SGC-7901 celler kombinert HPRP-A2 med DOX.

Materialer og metoder

celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og cellekultur

Menneskelige magekreft cellelinjer BGC-823 og SGC-7901 ble hentet fra American Type Culture Collection som autentiserer cellen linjer ved korte tandem gjentagelse DNA-testing, ble anvendt i løpet av 6 måneder etter gjenoppliving og dyrket i DMEM med føtalt bovint serum (FBS; 10% v /v), penicillin (100 U /ml), og streptomycin (100 U /ml) i en fuktig atmosfære ved 37 ° C med 5% CO _2.

peptidsyntese og rensing

peptidet ble syntetisert ved fast-fase peptidsyntese ved bruk av Fmoc (9-fluorenyl -methoxycar-bonyl) kjemi som tidligere beskrevet [13]. Ytterligere karakterisering ble detektert ved massespektrometri og aminosyreanalyse. DOX-HCl ble kjøpt fra Meilun Biology Technology Co, Ltd (Dalian, Kina).

Celleviabilitet analyser

BGC-823 og SGC-7901-celler (5 × 10 ^{3) ble sådd i tre paralleller i 96-brønners mikrotiterplater. Komplett medium ble erstattet etter 24 timer med 100 ul friskt medium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av medikamenter. Etter ytterligere 24 timer ble cellene inkubert med 3- (4,5-dimetyl-2-tiazolyl) -2,5-difenyl-2H-tetrazolium-bromid (MTT) ved 37 ° C i 4 timer. Deretter ble dimetylsulfoksyd (DMSO) ble tilsatt for å oppløse formazankrystaller og absorbansen ved 492 nm ble målt med en mikroplateleser (GF-M3000; høy tetthet Caihong Analytical Instruments Co., Shandong). Jin formel ble anvendt for å kvantifisere ytterligere den synergistiske effekten av kombinasjonsbehandlingen av HPRP-A2 og DOX. Formelen er: Q = Ea + b /(Ea + Eb-Ea × Eb), hvor Q er kombinasjonen indeksen; Ea + b representerer cellens proliferative inhibering hastigheten av den kombinerte medikament; Ea og Eb er tegn på cellen proliferative hemming rate av hvert medikament. Etter beregningen. Q < 0,85, Q > 1,15 og 0,85 < Q < 1,15 indikerer antagonisme, synergi, og additiv effekt, henholdsvis [14]}

Hemolyse aktivitetsanalyse

Hemolyse aktivitet analyse var utført som tidligere beskrevet [13]. For å oppnå røde blodceller, ble friskt humant blod som er stabilisert med EDTAK sentrifugert ved 1000 rpm i 5 min, vasket to ganger med PBS og fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 2% i PBS. 70 pl 2% humane erytrocytter ble tilsatt til en rundbunnet 96-brønns plate, etterfulgt av 70 pl av forskjellige konsentrasjoner av HPRP-A2. Etter inkubering ved 37 ° C i 1 time, ble platen deretter sentrifugert ved 3000 rpm i 10 min og 90 ul av supernatanten ble overført til en flatbunnet 96-brønns plate. Frigjøringen av hemoglobin ble bestemt ved å måle absorbans av supernatanten ved 540 nm. Erytrocytter i PBS og destillert vann (dH _{2o) ble anvendt som negative og positive kontroller, henholdsvis. Den hemolytiske aktivitet ble beregnet som prosentandelen av forsøksgruppen og positiv kontroll, etter subtraksjon av negativ kontroll respektivt. Dataene er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter.}

PI assay

BGC-823-celler (1 x 106 celler /brønn) ble sådd ut i seks-brønns plater. Etter inkubasjon med HPRP-A2 (5, 10, 15 pM) i 1 time, ble cellene oppsamlet og deretter behandlet med 5 pg /ml PI ved 4 ° C i 10 minutter i mørket. Cellene ble vasket med PBS tre ganger og deretter oppdage fluorescens intensitet PI bruker flowcytometri (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

LDH utgivelsen

LDH utgivelse aktivitet ble målt ved LDH analysesett (Jiancheng bioteknologi, Ltd., Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. BGC-823-celler ble sådd ut i 5 x 10 ^{3 celler /brønn i en 96-brønners plate. Etter inkubasjon med HPRP-A2 (5, 10, 15 mm) i 1 time, ble utgivelsen av LDH i supernatanten målt med en mikroplateleser (GF-M3000; Gaomi Caihong Analytical Instruments Co., Ltd Shandong, Kina) på 450 nm. Celler uten behandling eller lysert med triton X-100 ble anvendt som negative og positive kontroller, henholdsvis. Alle forsøk ble utført in triplo. LDH-aktiviteten ble beregnet som prosentandelen av forsøksgruppen og positiv kontroll, etter subtraksjon av negativ kontroll respektivt.}

ROS-analyse

ROS analysesett (BestBio, Co. Shanghai, Kina) ble anvendt for å oppdage generasjon av ROS. -Celler (1 x 106) ble behandlet ved HPRP-A2 (5, 10, 15 pM) i 1 time. De etterfølgende prosedyrer ble utført i henhold til produsentens protokoll. I korte trekk ble celler fordøyd med trypsin sentrifugert ved 1500 rpm i 3 minutter, vasket tre ganger med PBS og deretter suspendert i 500 ul PBS. Etter inkubasjon med 2 ', 7'-dichlorofluorescin diacetat (DCFH-DA) fluorescerende probe i 20 minutter ved 37 ° C ble cellene vasket med PBS tre ganger, og har oppdaget den grønne fluorescensintensitet (i GEOMEAN) ved strømningscytometri. Den grønne fluorescens intensitet var positivt korrelert med nivået av ROS.

Måling av MMP

MMP ble bestemt av mitokondriemembranen mulig analysesett med 5,5 ', 6,6'-tetraklor -1,1 ', 3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine jodid (JC-1), som er en sonde av mitokondriell aktivitet (BestBio, Co, Shanghai, Kina). JC-1 blir alltid brukt for å detektere mitokondrie depolarisering som forekommer i de tidlige stadier av apoptose. Når celler med høy MMP, JC-1 samlet i mitokondrie matrise, forming J-aggregater og produsere rød fluorescens. Omvendt, celler som inneholder JC-1-monomer monomer monomermonomer har lav MMP og viser grønn fluorescens. Mitokondriell depolarisasjon ble bestemt ved en reduksjon i den røde (590 nm, FL-2 kanal) /grønn (530 nm, FL-en kanal) fluorescence intensitet forhold. I korthet, etter behandling med HPRP-A2 (5, 10, 15 pM) i 1 time, ble BGC-823 celler samlet og inkubert med 0,5 ml JC-1 arbeidsløsning i 20 minutter ved 37 ° C, deretter vasket to ganger med PBS, suspendert i PBS, og analysert ved flowcytometri (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

caspase aktivitetsanalyse

Celler ble behandlet med HPRP-A2 (10, 15 mm) i 24 timer og deretter nivåer av caspase aktiviteter ble målt ved hjelp av de tilsvarende caspase aktivitetsdeteksjon kits (BestBio, Co., Shanghai, Kina), i henhold til produsentens instruksjoner. Gjennomsnittlige data er presentert som gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter.

cellesyklusanalyse

BGC-823-celler (1 x 10 ^{6) ble sådd i 6-brønns plater i 24 timer. Etter induksjon med HPRP-A2 (5, 10, 15 mm) i 24 timer, ble cellesyklus distribusjon bestemmes av en FACScan cytometer og Cell quest software (FACS Calibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Alle forsøkene ble utført i tre paralleller.}

Statistisk analyse

Data er presentert som gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige bestemmelser. Statistisk signifikant forskjell mellom gruppene ble analysert ved t
-test, med betydning akseptert på P
< 0.005 (*) og P
< 0,001 (**).

Resultatene

Peptide og cytotoksisitet

Som vist i figur 1, er peptidet HPRP-A2 en 15-rest α-helisk amfipatisk membran aktive peptid sammensatt av alle D-aminosyrer. Sammenligning av den selektive toksisitet av HPRP-A2 mot magekreftceller og normale celler (humane røde blodceller), kan vi lett finne at IC _{50 (konsentrasjon av medikament ved hvilken cellelevedyktigheten ble redusert med 50% sammenlignet med ubehandlet celler) verdier er langt mindre enn den minimale hemolytiske konsentrasjonen (den konsentrasjon av medikament som resulterte i 20% celle hemolyse) av HPRP-A2. Disse resultatene indikerte at HPRP-A2 kan selektivt drepe mage kreft celler og spare normale celler (figurene 2 og 3). Lignende anticancer aktivitet for de to cellelinjer (BGC-823 og SGC-7901) indikerte at det var en bredspektret virkning på anticancer virkning av HPRP-A2. På grunn av den membran-aktiv karakteristikk, viser HPRP-A2 anticancer terapeutiske potensiale, siden det er mer selektivt toksisk overfor tumorceller enn normale celler.}

HPRP-A2-induserte forsterkning av membranpermeabilitet

for å bekrefte endringen av membran permeabilitet etter inkubasjon med HPRP-A2, den cellulære opptaket av PI og ekstracellulære frigjøring av LDH ble undersøkt med flowcytometri og -mikroplateleser mot BGC-823 celler. Som vist i figur 4, er de strømningscytometriske grafer av PI bevege seg gradvis til retningen av høy fluorescensintensitet på en konsentrasjonsavhengig måte, og den økte frigjøring av LDH ble også observert i celler inkubert med HPRP-A2. Det vil si, HPRP-A2 kan føre til skade på cellemembranen og resultere i forbedring av cellemembranen permeabilitet.

HPRP-A2 forårsaket skader av mitokondrienes funksjon

Den intracellulære reaktive oksygen arter (ROS) slipper og mitokondriemembranen potensial (MMP) ble påvist med FACS å reflektere mitokondriene funksjon BGC-823 celler in vitro
. Som vist i figur 5A, er strømningscytometrisk histogram av celler inkubert med høyere konsentrasjon av HPRP-A2 viste høyere fluorescensintensitet etter inkubering i 1 time. Den tilsvarende strømningscytometrisk kvantitativ sammenligning av fluorescens-intensitet i GEOMEAN på disse forskjellige konsentrasjoner viste en lignende trend, nemlig at den økte frigjøring av ROS i BGC-823-celler i nærvær av HPRP-A2 var konsentrasjonsavhengig. Lignende konsentrasjonsavhengig endring trend ble også observert i figur 5B, er forholdet mellom FL2-H /FL1-H markert redusert, noe som indikerer en depolarisering av MMP.

Caspase-aktivering og cellesyklusanalyse

aktivering av kaspase-3, -8 og -9 i HPRP-A2-induserte celler ble målt ved hjelp av en med en mikroplateleser ved 405 nm. Som vist i figur 5C, caspase-3, -8 og -9 alle ble øket etter behandling med HPRP-A2 i 24 timer i BGC-823-celler, noe som antyder at induksjon av apoptose ved HPRP-A2 kan være caspase-avhengige . Som vist i figur 6, BGC-823-celler behandlet med ulike konsentrasjoner av HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) i 24 timer resulterte i en økning i sub-G1 arrest og i G1 arrest. Disse funnene styrker også den økte caspase-3-aktivitet etter behandling av HPRP-A2.

HPRP-A2-indusert økning i DOX cytotoksisitet

BGC-823 og SGC-7901 celler ble valgt til studere synergistisk anticancer effekten av HPRP-A2 og kjemoterapeutisk stoff DOX. Celler ble behandlet med HPRP-A2 (6 uM), og /eller Dox (1,6 ug /ml) i 4, 24 og 48 timer. MTT-analyser ble brukt for å evaluere den kombinatoriske kreft effekter på celler. De medikamentkonsentrasjoner som er valgt i denne studien var basert på IC _{50 verdiene for hvert medikament alene. Det var ingen åpenbare cytotoksisitet eller vekstreduksjon ved hvert medikament ble anvendt alene. I motsetning til dette, når det brukes i peptid /medikamentkombinasjoner (HPRP-A2 /DOX) ved de samme doser som brukes alene, er kombinasjonen oppviste signifikant cytotoksisitet (figur 7). Det er også klart at anticancer aktivitet av HPRP-A2 ble ikke mye påvirket av inkubasjonstiden; i motsetning til dette med økning av inkubasjonstiden til 48 timer, viser DOX mye større anticancer aktivitet enn den til 4 timer, noe som indikerer de dramatisk forskjellige virkningsmekanismer mellom ACP og kjemoterapeutisk medikament. I henhold til Jin formel, alle Q (kombinasjon indeks) verdier var større enn 1,15, hvilket indikerer at det var signifikante synergistiske effekter mellom α-heliks peptid HPRP-A2, og de konvensjonelle anticancer medikament DOX i BGC-823 og SGC-7901-celler .}

Diskusjoner

Anticancer peptider (ACPS) nylig har fått stor oppmerksomhet som lovende kjemoterapeutika som unngår ulempene med dagens medisin. Mange studier har bekreftet at visse syntetiske og naturlige kationiske peptider som har en hurtig og bredt spekter av anticancer aktivitet mot tumorceller i stedet for normale celler så som humane røde blodlegemer [4, 15]. Videre ACP-posisjoner ble også verifisert å ha evne til å overvinne den multimedikamentresistens mekanisme, og synergistiske effekter i kombinasjonsbehandling [11].

HPRP-A2 besitter en hurtig og bredt spekter av anticancer aktivitet, men noen forskjeller også forekomme i følsomheten av HPRP-A2 til forskjellige cellelinjer. Basert på den annen IC _{50 verdier for HPRP-A2 til BGC-823 (8,65 ± 0,38 mm), SGC-7901 (10,42 ± 0,30 mm), PC3 (21,38 ± 0,56 mm), og B16 (19,16 ± 0,38 mikrometer ), valgte vi BGC-823 og SGC-7901 celler som forskningsmålene. Dessuten, har anticancer aktivitetene til HPRP-A2 til andre kreftcellelinjer så som HeLa og HepG2 blitt publisert i vår tidligere papir [12]. Begge BGC-823 og SGC-7901 celler tilhører mage cellelinjer, og dermed valgte vi BGC-823 som et eksempel for å undersøke anticancer mekanisme HPRP-A2 in vitro
.}

i denne studien har vi vist at HPRP-A2 er en amfipatisk α-heliks peptid med betydelig anticancer aktivitet til BGC-823 og SGC-7901 cellelinjer. Våre studier har indikert at HPRP-A2 oppviste en kreft-selektiv toksisitet, hovedsaklig fordi at cancercellene er sammensatt av flere anioniske fosfolipider og inneholder O-glycosylert mucin, noe som øker den negative ladningen på kreftcelleoverflaten [16, 17]. Videre kan flere mikrovilli på kreftceller øke konsentrasjonen av bindingen peptid ved å utvide membranoverflaten og derved vise sterkere cytotoksisitet mot kreft cellemembraner [11, 18].

ACP-posisjoner er i stand til å forstyrre cellemembranen, noe som kan forårsake cellemembran endringer permeabilitet. I denne studien ble det endring av BGC-823 cellemembranen observert ved å detektere PI-permeabilization og LDH utgivelse. Den gradvise økninger på PI permeabilization og LDH utgivelsen er i konsentrasjonsavhengig oppførsel etter behandling med HPRP-A2. Videre HPRP-A2-indusert celledød er forbundet med generering av reaktive oksygenarter, den depolarisering av MMP, aktivering av kaspase-aktivitet og blokken i G1 fase av cellesyklusen.

I tillegg til den cytotoksisitet av HPRP-A2, viste vi at det kunne øke effekten av DOX mot BGC-823 og SGC-7901 celler, noe som er i tråd med vår forrige undersøkelse. I vår forrige undersøkelse, har vi utforsket kombinatoriske kreftbehandling ved hjelp av α-heliks peptider HPRP-A1 og HPRP-A2 med de kjemiske stoffene DOX og EPI i HeLa og HepG2 cellelinjer [12]. Synergien vist tillater bruken av relativt lave konsentrasjoner av peptider og narkotika for å oppnå betydelige kreft effekter in vitro Hotell og in vivo
. Dette dosereduksjon minimerer narkotika bivirkninger på normale celler og muliggjør en effektiv apoptose-mediert kreft effekt. Vår nåværende studie har implikasjoner i at HPRP-A2 kan bli en lovende kreft terapeutisk middel med høyt kreft selektivitet og sterk synergistisk effekt i kombinasjonsbehandling. Våre studier hovedsakelig illustrere mekanismen for HPRP-A2-indusert celledød og kan være nyttig i utformingen av kjemoterapeutika mot mage cellelinjer.

Konklusjoner

HPRP-A2 viser sterk anticancer aktivitet til BGC- 823 og SGC-7901 cellelinjer og lav toksisitet mot humane røde blodceller. HPRP-A2-indusert kreft celledød gjennom både direkte membran-ødeleggende effekt og intracellulære mekanismer, inkludert en dramatisk økning av caspase-3, -8 og -9 aktivering, en reduksjon av mitokondriemembranpotensialet (MMP), og generering av ROS og cellesyklus arrest i G1. Dessuten HPRP-A2 synergized sterkt med DOX å forbedre effekten av å drepe mage tumorceller in vitro
. Våre resultater understreker den brede anticancer potensialet i HPRP-A2 og belyse virkningsmekanismen. Vi tror at endowing ACP-posisjoner med mer effektive og tumor målretting egenskaper vil åpne opp nye måter å bekjempe kreft med hell.

• PLoS ONE: Intra-tumor heterogenitet av HER2, FGFR2, cMET og ATM i Gastric Cancer: Optimalisere Personlig Health gjennom nyskapende Patologisk and Statistical Analysis
• PLoS ONE: Kvantifisering av jod innhold Perigastric fettvev av Dual-Energy CT: A Novel Metode for Preoperativ diagnose av T4-Stage Gastric Cancer