PLoS ONE: Expression Profilering av stamcelle-relaterte gener i Neoadjuvant behandlet Gastric Cancer: En NOTCH2, GSK3B og β-catenin Gene Signatur Spår Survival

Abstract

Cancer Stem Cell (CSC) basert genekspresjonssignaturer er forbundet med prognose i forskjellige tumortyper og cscs er foreslått å være spesielt resistente. Målet for studien var første, for å bestemme prognostisk betydning CSC relatert genekspresjon i gjenværende tumorceller av Neoadjuvant-behandlede mage kreft (GC) pasienter. For det andre ønsket vi å undersøke, om uttrykk endringer mellom pre- og post-terapeutiske tumorprøver foreligger, i samsvar med en berikelse av medikamentresistente kreftceller. Uttrykket av 44 gener ble analysert i 63 formalinfiksert, parafininnebygd vevsprøver med delvis tumor regresjon (10-50% resttumor) etter neoadjuvant kjemoterapi ved kvantitativ real time PCR arrays lav tetthet. En signatur av kombinert GSK3B
^{høy, β-catenin (CTNNB1)
høy og NOTCH2
lav uttrykk var sterkt korrelert med bedre pasient overlevelse (p < 0,001). En prognostisk relevansen av disse genene ble også funnet å analysere offentlig tilgjengelige genuttrykk data. Uttrykket av 9 gener ble sammenlignet mellom pre-terapeutiske biopsier og post-terapeutiske resected prøver. En betydelig post-terapeutisk økning i HAKK
2, LGR5 Hotell og POU5F1
uttrykk ble funnet i svulster med forskjellige tumor regresjon karakterer. Ingen signifikante endringer ble observert for GSK3B Hotell og CTNNB1
. Immunhistokjemisk analyse viste et kjemoterapirelatert økning i intensiteten av NOTCH2 flekker, men ikke i prosentandelen NOTCH2. Til sammen GSK3B, CTNNB1 Hotell og NOTCH2
uttrykk signatur er en roman, lovende prognostiske parameter for GC. Resultatene av dette uttrykket analyse indikerer en fremtredende rolle for NOTCH2 og kjemoterapi motstand i GC, som synes å være relatert til en effekt av legemidlene på NOTCH2 uttrykk i stedet for til en anrikning av NOTCH2 uttrykkende tumorceller.}

Citation: Bauer L, Langer R, Becker K, Hapfelmeier A, Ott K, Novotny A, et al. (2012) Expression Profilering av stamcelle-relaterte gener i Neoadjuvant behandlet Gastric Cancer: En NOTCH2
, GSK3B Hotell og β-catenin
Gene Signatur Spår Survival. PLoS ONE 7 (9): e44566. doi: 10,1371 /journal.pone.0044566

Redaktør: Ju-Seog Lee, University of Texas MD Anderson Cancer Center, USA

mottatt: May 16, 2012; Godkjent: 08.08.2012; Publisert: 10.09.2012

Copyright: © Bauer et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Studien ble støttet av Deutsche Krebshilfe Mildred Scheel Stiftung, gi nummer 108 524 til GK og KB. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Avanserte mage karsinom (GC) er ofte behandlet av Platin /5-fluorouracil (5-FU) - basert neoadjuvant kjemoterapi [1]. Formålet med denne behandlingen er, blant andre, for å krympe svulsten før kirurgi for å øke sannsynligheten for fullstendig reseksjon og for derved å forbedre pasientens overlevelse. Men responsratene er lave, og fullstendig eller delsum tumor regresjon er observert i bare 20-40% av pasientene [1], [2]. Dermed er kjemoterapi motstand et stort hinder for vellykket behandling

Ifølge kreftstamcelle hypotese, kreftceller er heterogene, og en økt resistens er en bestemt fenotype av et mindretall av kreftceller -. Den såkalte såkalte kreft-initiering av celler eller kreft stamceller (cscs) [3] - [5]. En økning i CSC populasjonen etter kjemoterapi er blitt demonstrert [6], [7], og stamcellebaserte genekspresjonssignaturer var assosiert med dårlig prognose i forskjellige tumorer inkludert gastriske karsinomer [8] - [11]. CSC hypotese er fortsatt kontroversielt diskutert, men det er bevis for eksistensen av cscs i flere tumortyper og molekylære markører er blitt identifisert som fortrinnsvis finnes på disse cellene [4], [5]. Aktivering av embryonale signalveier, som Wnt, Notch og Hedgehog veier, har blitt foreslått som en pådriver for dannelsen av cscs [4], [12]. Data om kilden og eksistensen av mage cscs forbli ufullstendig [13] - [17]. I mus, benmarg-celler avledet eller en spesifikk cellepopulasjon i antrum som uttrykker Wnt målmolekylet LGR5, har vært assosiert med cscs i magen [17], [18]. I tillegg har CD44 og CD24 blitt foreslått som bestemte celleoverflatemarkører, men dataene er inkonsekvent [19], [20].

neoadjuvant behandling protokollen for GC gir en utmerket mulighet til å undersøke kreftceller før og etter kjemoterapi hos pasienter. I denne studien ønsket vi å belyse det første, om uttrykk for mulige CSC-relaterte gener i post-terapeutiske resttumor spår pasient overlevelse og andre, om genene er uttrykt forskjellig mellom pre-terapeutiske biopsier og post-terapeutiske vevsprøver , i samsvar med en berikelse av kjemoterapi-resistente kreftceller som spådd av CSC-konseptet. Gruppen av pasienter, som viste betydelig svulst krymping etter neoadjuvant kjemoterapi, men fortsatt hadde tilstrekkelig gjenværende kreftceller som er tilgjengelige for analyse (10-50% resttumor) ble betraktet som den mest aktuelle gruppen til å begynne med en screening analyse for prognostiske relevante gener og deretter identifisere relevante forskjeller i genuttrykk mellom pre- og post-terapeutiske tumorprøver. Å analysere disse resttumorceller vi identifisert et gen uttrykk mønster som omfatter GSK3B, CTNNB1 Hotell og NOTCH2
, som sterkt spår prognose for pasientene. Vi viser at effekten av GSK3B Hotell og CTNNB1
til denne signaturen er ikke avhengig av kjemoterapi og mer sannsynlig reflekterer en egenskap av primærtumor og våre data antyder videre at spesielt NOTCH2
kan spille en rolle for kjemoterapi motstand i GC.

Materialer og metoder

pasienter

i alt 480 pasienter med lokalavansert GC (CT3 /4 ) ble behandlet av neoadjuvant, platin /5FU-basert kjemoterapi ved Kirurgisk avdeling ved Technische Universität München mellom 1991 og 2007 og ble evaluert for respons basert på en standardisert histopatologisk protokollen [2] - [22]. Tumor regresjon ble klassifisert i 3 karakterer: tumor regresjon Karakter (TRG) 1, som består av TRG1a (total tumor regresjon) og TRG1b (delsum tumor regresjon: < 10% resttumor celler /svulst seng), TRG2 (partiell tumor regresjon: 10-50% resttumorceller /svulst seng) og TRG3 (minimal eller ingen tumor regresjon: > 50% rest tumor /svulst seng). Av de 480 pasientene, 121 pasienter viste TRG2 og 63 av disse ble analysert i denne studien. Inkluderingen kriteriet var tilgjengeligheten av tilstrekkelige tumorvev for analyse av pasienter behandlet med minst 50% av den beregnede dose av kjemoterapi. Pasient egenskaper og behandlingsprotokoller er vist i tabell 1. For å bekrefte den representative arten av de 63 analyserte pasientene, ble fordelingen av deres clinicopathological parametere sammenlignet med 121-pasientmateriale og viste ingen statistisk signifikante forskjeller.

Følg -up ble beregnet ut fra den første dagen av behandling før datoen for siste kontakt med pasientene. Median oppfølgingstid på 77,1 måneder (variasjon: 28,5 til 108,5). Den kliniske endepunktet i studien var total overlevelse (OS), som ble definert som tiden mellom den første dagen av kjemoterapi og død av enhver årsak. Median OS var 50,9 måneder (range: 4,5 til 108,5, 95% KI: 25,6 til 76,3), og 37 av de 63 pasientene døde under oppfølging. Dette utvalgsstørrelse og antall hendelser er tilstrekkelig stor for en konsistent estimering av alle effektstørrelser undersøkt i denne utforskende studie [23], [24].

Sammenligningen av genuttrykk mellom tilsvarende pre- og post-terapeutisk tumorprøver ble utført for pasienter med TRG2 og TRG3 (hver n = 22).

for immunhistokjemisk analyse, pre- og post-terapeutiske tumorprøver fra 21 pasienter med TRG1b, 21 pasienter med TRG2, 22 pasienter med TRG3 og av 16 pasienter behandlet med kirurgi alene ble inkludert. Utvalget kriteriet for disse analysene var tilgjengeligheten av tilsvarende pre-terapeutiske biopsier og post-terapeutiske svulster.

Etikk erklæringen

Studiet og bruken av menneskelig vev ble godkjent av den lokale Institutional Review Board ved Technische Universität München (referanse: 2158/08), og informert samtykke ble innhentet i henhold til institusjonelle regler

RNA Utvinning og revers transkripsjon

Total RNA ble ekstrahert fra formalinfiksert,. parafininnstøpte (FFPE) vev etter manuell mikrodisseksjon av tumorområder som består av minst 50% kreftceller. RNA ble renset ved fenol og kloroform ekstraksjon og ble reverstranskribert som beskrevet [25].

Gene Expression Analysis

De 44 gener som ble valgt for analyse basert på deres potensielle rolle i CSC biologi er inkludert i tabell 2. Gene uttrykk ble analysert ved hjelp av kvantitativ real time PCR (QRT-PCR) på TaqMan® lav tetthet arrays skreddersydde (Applied Biosystems Inc., Foster City, USA). Passende referanse gener ble bestemt ved en analyse av ti kandidat referanse gener i 8 mage karsinom bruker geNorm-algoritmen [26]. IPO8
, POLR2A Hotell og UBC
ble bestemt til å være de mest egnede referanse gener og normalisering basert på geometrisk gjennomsnitt av disse tre genene ble utført som beskrevet [26] . Reagenser, er sykkelforholdene og programvare inkludert i saksdokumenter. Relativ genekspresjon ble kvantifisert ved hjelp av komparative ΔΔCt metoden [27].

Immunohistochemistry

Det monoklonale NOTCH2 antistoff (C651.6DbHN) ble hentet fra utviklingsstudier hybrid Bank (DSHB, The University of Iowa, Institutt for biologi, Iowa City, USA). Fargingsprosedyren og undersøkelse av antistoff spesifisitet ved Western blotting er beskrevet i saksdokumenter og Figur S1A.

Immunhistokjemisk farging ble scoret på en blindet måte av to uavhengige forskere (L.B. og R.L.). Cytoplasmisk og nukleær farging ble evaluert separat. Negative, svak, middels eller sterk farging intensiteter ble scoret som 0, 1, 2 og 3, henholdsvis. Prosentandelen av tumorceller med farget cytoplasma /nucleus ble scoret som 0 (negativ), en (< 10%), 2 (10 til < 50%), 3 (50 til < 80%) og 4 (≥80 %).

Statistical Analysis

Betingelses inferens tester ble benyttet for å bestemme de optimale cut-off-verdier av genuttrykk for foreningen med pasienten overlevelse og for å bestemme p-verdiene passer for maksimalt utvalgte statistikk [28]. Genuttrykk-verdier over eller lik den optimale cut-off verdi ble definert som høy uttrykk og genuttrykk verdier under cut-off-verdien ble definert som lav uttrykk. Overlevelse ble beregnet i henhold til Kaplan-Meier-kurver og ble sammenlignet med log-rank tester. Relativ risiko ble beregnet ved å bestemme hazard ratio (HRS) fra Cox proporsjonal fare modeller. I multivariat analyse ble trinnvis frem variabel utvalg utført basert på likelihood ratio tester. Forholdet for antall variabler i modellen til antallet hendelser var begrenset til 1:10 [24].

Sammenligninger av clinicopathological variabler mellom grupper ble utført ved Mann-Whitney-U-test. Den χ ^{2-test og Fishers eksakte test ble anvendt for sammenligning av relative frekvenser der dette er hensiktsmessig. Statistiske forskjeller i genekspresjon mellom sammenkoblede Prøvene ble analysert ved bruk av Wilcoxon signert rank test.}

Unsupervised hierarkisk klyngeanalyse ble utført med Cluster 3.0 programvare [29] og Java Treeview programvare (versjon 1.1.5r2) [30]. Relative mRNA uttrykk data ble log-transformert, median-sentrert og normalisert før påføring av komplett kobling clustering med en avstand matrise basert på Pearsons korrelasjon (usentrert).

En risikoscore ble beregnet ved å sammenfatte de produkter av multiplikasjon av Cox regresjonskoeffisienten av hvert gen i modellen med normaliserte genuttrykk verdier for hver pasient i hovedsak som beskrevet [31] (detaljer i Materiale og metode S1 og tabeller S4 og S6).

Alle statistiske tester var to -sided og gjennomføres på en utforskende måte med et signifikansnivå på 0,05 hjelp av SPSS 18.0 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL 11.5) og R (R Foundation for Statistiske Computing, Wien, Østerrike).

studien er i samsvar med rapporterings anbefalinger for svulst markør prognostiske studier (REMARK kriterier) [32].

Analyse av offentlig mikroarray data

offentlig tilgjengelig genuttrykk array-data av mage karsinom med beskrivelser av kliniske kjennetegn og pasient overlevelse [33] ble innhentet fra BRB-Array Tools dataarkivet (http://linus.nci.nih.gov/~brb/DataArchive_New.html) og analysert ved hjelp av BRB-Array Tools [34] (saksdokumenter) . Bare avanserte gastriske karsinomer (T3 /4) (n = 58) ble inkludert i analysen. Den optimale cut-off verdier av GSK3B
, CTNNB1
, og NOTCH2
uttrykk ble bestemt for en forening med pasientens overlevelse av de betingede inferens tester for maksimalt utvalgte statistikk som beskrevet ovenfor.

Resultater

Gene Expression og pasient Survival

genuttrykk profilering av de 63 svulster hos pasienter med TRG2 viste, at høyt uttrykk nivåer av GSK3B
, DNMT1 Hotell og CTNNB1
var signifikant assosiert med bedre overlevelse (betinget slutning test: p = 0,006, 0,041 og 0,043, henholdsvis). En moderat assosiasjon med bedre overlevelse observert i høy uttrykk for ABCG2 Hotell og OLFM4 product: (p = 0,051, p = 0,055) og for lavt uttrykk for NOTCH2 plakater (p = 0,071) (tabell 3). Univariate Cox-regresjonsanalyse viste ca samstemmige resultater (Tabell 4).

En multivariat Cox regresjonsanalyse inkludert GSK3B
, CTNNB1
, DNMT1 Hotell og standard prognostiske variabler i GC, nemlig YPT, yPN, YPM og reseksjon kategorien avslørt GSK3B
som den nest viktigste uavhengig prognostisk faktor (HR: 0,128, 95% KI: 0,033 til 0,492, p = 0,003) etter fjernmetastaser (tabell S1).

en klynge analyse som omfatter alle de analyserte genene viste ingen pasientgrupper som viste en sammenheng med OS. En klynge analyse av Wnt- og Notch signaleassosierte gener produsert den mest signifikant sammenheng med OS når GSK3B
, CTNNB1 Hotell og NOTCH2
ble inkludert (p = 0,002) (Figur 1A og B). Ifølge resultatene av klyngeanalyse, gruppert vi pasientene i tre grupper med ulike kombinasjoner av høyt eller lavt uttrykk for GSK3B
, CTNNB1 Hotell og NOTCH2
, som ble definert av de optimale cut-off-verdier for genuttrykk i forbindelse med pasientens overlevelse. Gruppen med GSK3B
^{høy, CTNNB1
høy og NOTCH2
lav uttrykk viste best overlevelse, mens gruppen med GSK3B
lav, CTNNB1
lav og NOTCH2
høy uttrykket hadde den verste samlede utfallet (p < 0,001, figur 1C).}

Beregning av et risiko resultatet basert på en multivariat Cox proporsjonal fare regresjonsmodell av disse tre genene og dichotomisation av pasientene i henhold til den optimale cut-off-verdi for OS inn i en høy (n = 37) og lav (n = 26) risikogruppe viste en statistisk signifikant forskjell for OS (median overlevelse av lav- og høyrisikopasienter: ikke nådd, og henholdsvis 37 måneder, p < 0,001). I tillegg forskjellen i de respektive overlevelse på 1, 2, 3 og 5 år mellom lav og høy risiko gruppen var statistisk signifikant (tabell S5).

Differensial Gene Expression Analysis mellom Tilsvar før og etter -therapeutic Tumorprøver

Vi neste fastslått, om uttrykket nivåer av genene som viste en betydelig eller moderat assosiasjon med OS (p < 0,1, tabell 3 og 4) skiller mellom pre-terapeutiske biopsier og deres tilsvarende post -therapeutic kreftprøve. I tillegg POU5F1
, LGR5 Hotell og CCND1
ble analysert, og viste prøver av pasienter med TRG2 eller TRG3 (hver n = 22) ble undersøkt.

Hos pasienter med TRG2, uttrykk for NOTCH2
, POU5F1 Hotell og LGR5
økt betydelig mellom pre- og post-terapeutiske prøver (p = 0,002, 0,028 og 0,017, henholdsvis) og uttrykk for DNMT1
redusert (p = 0,009). I gruppen med TRG3, POU5F1
viste en betydelig økning (p = 0,002), mens DNMT1 Hotell og CCND1
betydelig redusert (p = 0,002 og 0,007, henholdsvis) .

Når det gjelder uttrykket av prognostiske relevante gener GSK3B Hotell og CTNNB1, etter ble det ikke observert noen statistisk signifikante forskjeller mellom pre- og post-terapeutiske tumorprøver ( Tabell 5 og tabell S2 og S3).

Analyse av offentlig tilgjengelig Array data

for å vurdere den generelle prognostisk verdi av GSK3B
^{høy, CTNNB1
høy og NOTCH2
lav uttrykk mønster, brukte vi et offentlig tilgjengelige uttrykk array-datasett av mage karsinom [33]. Datasettet inkluderte gener av interesse og den relevante klinisk informasjon (OS, tumorstadium) som er nødvendig for å utføre en tilsvarende analyse. Fastsettelsen av de optimale cut-off verdier av genuttrykk for korrelasjon med overlevelse og evaluering av den kombinerte uttrykk signaturen til GSK3B
høy, CTNNB1
høy og NOTCH2
lav identifisert en gruppe på 10 pasienter som hadde en betydelig lengre OS (p = 0,017, median OS: ikke nådd) sammenlignet med de 47 gjenværende pasientene (median OS: 14,0 mo, 95% KI: 8,7 -19,4) (figur 1D).}

Beregning av risiko score for denne pasientgruppen og dichotomisation av pasientene i henhold til den optimale cut-off verdi for OS viste en betydelig lengre OS for lav risikogruppe (n = 27) i forhold til høyrisikogruppen (n = 30), selv om forskjellen ikke var statistisk signifikant (median overlevelse 21 versus 13 måneder, p = 0.110). Tatt i betraktning forskjellene i de respektive overlevelse på 1, 2 og 3 år demonstrert analoge resultater med den mest åpenbare forskjellen på 2 år med en overlevelse på 45% av de lave pasientene risiko og 21% av høyrisikopasienter (p = 0,071 ) (tabell S7).

Immunhistokjemisk analyse av NOTCH2

for å vurdere forskjeller i genuttrykk mellom de sammenkoblede pre- og post-terapeutiske svulster på proteinnivå, utførte vi immunhistokjemi og fokusert på NOTCH2 (figur S1B og C). Vi analyserte de samme pasientgruppene som var blitt studert på mRNA-nivå. I tillegg ble 21 pasienter med TRG1b og en kontrollgruppe med 16 pasienter behandlet ved kirurgi alene er inkludert.

En sammenligning av cytoplasmatisk fargeintensitetene mellom pre-terapeutiske biopsier og deres tilsvarende post-terapeutiske tumorer viste en statistisk signifikant økning i fargeintensitet i etter terapeutiske prøver fra pasienter med TRG1b, 2 og 3 (p = 0,016, 0,001, og 0,017, respektivt). I motsetning til dette ble ingen forskjell observert hos pasienter behandlet ved kirurgi alene (p = 0,438) (figur 2). Prosentandelen av fargede celler ble ikke signifikant endret. Når det gjelder nukleær farging, ble en signifikant reduksjon i fargeintensitet i de post-terapeutiske kreftprøve funnet i gruppen med TRG2 (p = 0,007), TRG3 (p = 0,015) og i kontrollgruppen behandles ikke ved kjemoterapi (p = 0,016) . En betydelig reduksjon i prosentandelen av celler med fargede kjerner ble observert i gruppen med TRG1b (p = 0,005), TRG2 (p < 0,001), TRG3 (p = 0,003), så vel som i kontrollgruppen (p = 0,001).

Diskusjoner

Vår studie analysere uttrykk for CSC relaterte gener i rest mage kreftceller etter neoadjuvant kjemoterapi identifisert et gen signatur med en høy prognostisk effekt består av GSK3B
, den β-catenin
genet CTNNB1 og NOTCH2
. Interessant, høy uttrykk nivåer av CTNNB1 Hotell og GSK3B
var assosiert med økt overlevelse. Β-catenin er et nøkkel-molekyl i overføring av Wnt signalering til kjernen og driver flere cellulære prosesser [35]. Avvikende Wnt signal er påvist i opptil 46% av GCer, og begge Wnt / β-catenin Hotell og spredning /stamcelle uttrykk signaturer som angir respektive pathway aktivisering, ble assosiert med redusert pasientoverlevelse [36]. CTNNB1
mRNA nivåer kan modulere Wnt signal [37], og Wnt aktivitet har blitt knyttet til kreft stemness i tykktarmen [38]. Gitt disse dataene, en negativ assosiasjon av CTNNB1
uttrykk i resttumorceller etter kjemoterapi og overlevelse av pasientene ville ha vært forventet. Men β
-catenin er også en del av E-cadherin-catenin kompleks og endringer i denne celle adhesjon komplekset har vært forbundet med dårligere prognose i ulike tumorer [39]. I GC, motstridende resultater når det gjelder sammenhengen mellom β
-catenin uttrykk og pasient prognose eksisterer [40], [41].

Det er viktig å merke seg at GSK3B er også en multifunksjonell protein involvert i forskjellige signaleringsnett og motvirker Wnt signalering ved å mediere degradering av β
-catenin, selv om en Wnt-aktiverende funksjon er også blitt beskrevet [42] - [44]. Økt uttrykk for GSK3B
var assosiert med en gunstig prognose i vår studie, som er konsistent med en rapport om høyere GSK3B
mRNA uttrykk forbundet med bedre overlevelse i eggstokkene høyverdig serøs karsinom [45 ].

Høyere NOTCH2
uttrykk nivåer korrelert med dårligere overlevelse i våre GC pasienter. Den Notch reseptor familien omfatter fire medlemmer, og NOTCH1 og NOTCH2 har vært innblandet å forbedre magekreft progresjon [46], [47]. Videre er en sammenslutning av NOTCH1 uttrykk med dårlig prognose er rapportert [48], som ikke er i samsvar med våre funn; Men på grunn av forskjeller i studiepopulasjoner, disse resultatene ikke er direkte sammenlignbare.

Gitt den svært signifikant sammenheng av genet signatur omfatter CTNNB1
, GSK3B Hotell og NOTCH2
med pasient overlevelse og betydelig risiko score-basert klassifisering av pasientene inn i en høy og lav risiko gruppe, var vi spesielt interessert, hvis dette var relatert til kjemoterapi. Sammenligningen av GSK3B Hotell og CTNNB1
uttrykk nivåer mellom pre- og post-terapeutiske tumorprøver viste ingen klare forskjeller, mens en betydelig økning i uttrykket av NOTCH2
ble funnet. Dette funnet tyder på at CTNNB1 Hotell og GSK3B
uttrykk kan gjenspeile en egenskap av primærtumor som ikke er endret av kjemoterapi og at NOTCH2
uttrykk i de gjenværende kreftceller er i det minste delvis i forbindelse med denne behandlingen.

en analyse av prognostisk betydning av de tre-genene i offentlig tilgjengelige på genom ekspresjonsdata avansert GC viste en signifikant sammenheng for det spesifikke gen-ekspresjon mønster av GSK3B
^{høy, CTNNB1
høy og NOTCH2
lav uttrykk og økt pasientoverlevelse og en tilsvarende tendens vurderer risikoen poengsum basert klassifikasjon.}

Dette funnet støtter tolkningen at prognostisk effekt observert i vår studie reflekterer i hovedsak en egenskap av primær mage svulst, tyder på en avgjørende rolle for disse genene i biologi av disse svulstene. I tillegg kan den prognostiske effekt som observeres økes ved en økning i ekspresjonen av NOTCH2
i resttumor etter kjemoterapi. Dermed, hvis validert i en prospektiv studie, kan dette tre gen signatur være nyttig for risikovurderingen av GC pasienter og i tillegg kan veilede postoperativ behandling etter neoadjuvant kjemoterapi.

Våre resultater er minner om en fersk undersøkelse analysere en CSC- avledet gen signatur som spår tumorresidiv i tykktarmen, og viser at forhøyet uttrykk av wnt målgener er et tegn på en gunstig prognose [48]. Forfatterne gir bevis for at denne foreningen mer sannsynlig reflekterer differensiering status for ondartet vev i stedet for antall cscs [49].

I vurderer endringer av NOTCH2
uttrykk mellom tilsvarende pre- og post-terapeutiske tumorer, er det viktig å merke seg at man sammenligner genekspresjon på mRNA-nivå, ikke kan skjelne hvorvidt disse endringene reflektere en relativ anrikning av celler som uttrykker dette genet, hvorvidt de er på grunn av de kjemoterapeutiske midler som påvirker gentranskripsjon i celler per se
, eller om endringene gjenspeiler bare prøvetaking forskjeller. For å avklare dette spørsmålet vi analysert NOTCH2 protein uttrykk ved immunhistokjemi og inkludert svulster fra pasienter behandlet med kirurgi alene. Basert på cytoplasma farging, bekrefter våre resultater en økning i NOTCH2 uttrykk på proteinnivået i post-terapeutiske svulster, og de viser at de observerte forskjellene er trolig bli begrenset til pasienter som behandles med cellegift. Av notatet, ble økningen i NOTCH2 uttrykk relatert til en økning i cytoplasmatisk fargeintensitet og ikke til en økning i antallet av celler som uttrykker NOTCH2. Dette resultatet argumenterer mot en berikelse av en subpopulasjon av NOTCH2-uttrykkende tumorceller og mer sannsynlig antyder en kjemoterapi-indusert økning i gen-ekspresjon i tumorceller, som kan være relatert til tumor biologiske egenskaper etter neoadjuvant behandling. Imidlertid kan et klart skille mellom disse mulighetene være begrenset av semikvantitativ evaluering av immunhistokjemisk farging. Som tilsvarende endringer i atom farging ble observert i alle kreftgrupper inkludert kontrollen vi vurdert disse endringene som ikke er relatert til kjemoterapi.

Uavhengig av mekanismen og den sanne natur av de gjenværende kreftceller uttrykker NOTCH2
, kan resultatene ha terapeutiske implikasjoner. Notch signale har dukket opp som en potensiell ny terapeutisk mål, og gamma-sekretase hemmere, som hemmer behandlingen av Notch reseptorer, blir nå evaluert i kliniske studier [50]. Vår studie tyder på at målretting Notch signale kan også representere en ny strategi for å behandle GC pasienter. Som en negativ prognostisk effekt ble bare forbundet med NOTCH2
og ikke NOTCH1
, våre data indikerer også at en detaljert karakterisering av de enkelte Notch reseptorer og en grundig funksjonell undersøkelse er obligatoriske og videre sterkt favorisere utvikling av Notch paralog spesifikke hemmende midler.

En betydelig økning i POU5F1
uttrykk ble observert etter kjemoterapi i resected prøvene i vår studie. Den POU5F1 transkripsjonsfaktor er vesentlig for opprettholdelse av selvfornyelse, og dens høy ekspresjon i gjenværende cancerceller etter radiochemotherapy er korrelert med dårlig prognose i tykktarmskreft [51]. Interessant vi også observert en økt uttrykk for LGR5
, en lovende intestinal CSC markør, etter kjemoterapi i tumorer med TRG2 [18]. Disse resultatene er forenlig med den potensielle anrikning av legemiddelresistente tumorceller som uttrykker POU5F1
eller LGR5
, men den underliggende mekanisme for disse endringene og de spesielle egenskapene til de celler som uttrykker disse genene forblir i bestemmes

i vår studie ble det observert noen sammenheng med overlevelse for celleoverflatemolekyler CD44 eller CD133, som begge har vært mye brukt for å identifisere mulige cscs i ulike tumorer [4] -. [11]. Dette resultatet støtter nyere funn viser at disse celleoverflatemolekyler ikke identifisere cscs i grunnskolen magesvulster [20].

Til sammen våre funn viser at uttrykket signaturen til GSK3B
^{høy, CTNNB1
høy og NOTCH2
lav i kjemoterapiresistent rest GC kreftceller er en sterk prediktor for gunstig pasient prognose. Dette prognostisk betydning ble også demonstrert for GC pasienter som bruker offentlig tilgjengelige genuttrykk data. Resultatene av differensial uttrykk analyse av pre- og post-terapeutiske kreft prøven antyder også at virkningen av GSK3B Hotell og CTNNB1
til denne signaturen er ikke avhengig av kjemoterapi, men heller relatert til en egenskap av primærtumor. De indikerer en fremtredende rolle for NOTCH2 og kjemoterapi motstand i GC, som er mer sannsynlig relatert til en effekt av kjemoterapeutika på NOTCH2
uttrykk snarere enn til en berikelse av NOTCH2
uttrykke svulst videre celler.}

Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Western blot og immunhistokjemi med anti-NOTCH2 antistoff. A) Et antistoff rettet mot NOTCH2 intracellulære domenet detekterer spesielt den fulle lengde NOTCH2 proteinet over 250 kDa markør, så vel som de spaltede formene HAKK ekstracellulær Trunkerte (NEXT) og HAKK intracellulære domenet (NiCd) på omtrent 110 kDa. B) En svak cytoplasmisk immunhistokjemisk farging i pre-terapeutiske biopsiprøve og C) en sterk cytoplasmatisk farge i den tilsvarende post-tumor terapeutiske med TRG2 er vist. Skala barer indikerer 50 mikrometer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0044566.s001 plakater (TIF)
Tabell S1.
multivariat Cox regresjonsanalyse. Genuttrykk av GSK3B, CTNNB1, DNMT1 Hotell og standard prognostiske variabler i GC, YPT, YPN, YPM og reseksjon kategorien ble inkludert i modellen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0044566.s002 product: (DOC)
Tabell S2.
Gene uttrykk data av pre- og tilsvarende post-terapeutiske tumorprøver av pasienter med TRG2
doi:. 10,1371 /journal.pone.0044566.s003 plakater (DOC)
tabell S3.

• PLoS ONE: Den prognostisk verdi på slaktet lymfeknuter og metastatisk Lymph Node Ratio for magekreft pasienter: Resultater fra en studie av 1,101 Pasienter
• PLoS ONE: N-myc Nedstrøms regulert Gene 1 (NDRG1) Fremmer metastasering av menneskelig scirrhous Gastric kreftceller gjennom Epitelial Mesenchymale Transition