PLoS ONE: N-myc Nedstrøms regulert Gene 1 (NDRG1) Fremmer metastasering av menneskelig scirrhous Gastric kreftceller gjennom Epitelial Mesenchymale Transition

Abstract

Vår fersk studie viste at høyere uttrykk av N-myc downregulated gen 1 (NDRG1) er nært korrelert med dårlig prognose i mage kreftpasienter. I denne studien, spurte vi om NDRG1 har sentrale roller i ondartet progresjon inkludert metastasering av mage kreftceller. Ved genekspresjon microarray analyse uttrykk for NDRG1 viste større økning blant totalt 3691 oppregulert gener i en svært magekreft med spredning cellelinje (58As1) enn foreldre lav metastatisk motstykke (HSC-58). Den svært metastatisk cellelinjer viste redusert uttrykk av E-cadherin, sammen med forbedret uttrykk for vimentin og Snail. Dette reduserte uttrykk for E-cadherin ble restaurert av Snail knockdown i svært metastatisk cellelinjer. Vi neste etablerte stabile NDRG1 knockdown cellelinjer (AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54) fra svært metastatisk cellelinje, og begge disse cellelinjene viste forbedret uttrykk for E-cadherin og redusert uttrykk for vimentin og Snail. Og også, E-cadherin promoter-drevet luciferase-aktivitet ble funnet å være økt ved NDRG1 knockdown i det svært metastatisk cellelinje. NDRG1 knockdown i magekreft celle viste trykkes invasjon av kreftceller i surround vev, undertrykt metastaser til peritoneum og redusert ascites akkumulering i mus med betydelig forbedret overlevelse. Dette er den første studien som viser at NDRG1 spiller sin avgjørende rolle i ondartet progresjon av magekreft gjennom epitel mesenchymale overgang

Citation. Ureshino H, Murakami Y, Watari K, Izumi H, Kawahara A, Kage M , et al. (2012) N-myc Nedstrøms regulert Gene 1 (NDRG1) Fremmer metastasering av menneskelig scirrhous Gastric kreftceller gjennom epithelial Mesenchymale Transition. PLoS ONE syv (7): e41312. doi: 10,1371 /journal.pone.0041312

Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA

mottatt: 08.12.2011; Godkjent: 22 juni 2012; Publisert: 23.07.2012

Copyright: © 2012 Ureshino et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Denne studien ble støttet av et stipend-i-aid for kreftforskning fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi fra Japan (Dr. Ono), og ved den tredje Term omfattende kontroll Forskning for Cancer fra Helsedepartementet, Arbeiderpartiet og velferds av Japan (Dr. Kuwano). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste kreftformen hos Japan og andre asiatiske land. Pasienten prognose scirrhous magekreft er spesielt dårlig. Scirrhous gastrisk karsinom er ofte ledsaget av peritoneal formidling og metastasering til lymfeknutene og leveren, som er alvorlige problemer som må bli kontrollert. Genekspresjon profil avslørte genet amplifikasjoner av K-sam og c-Met i 30-40% av scirrhous mage kreft, og at overekspresjon av forskjellige vekstfaktorer, såsom transformerende vekstfaktor-β (TGF-β), blodplateavledet vekst faktor (PDGF), insulin-lignende vekstfaktor (IGF) og fibroblastvekstfaktor-2 (FGF-2) [1]. Nyere DNA microarray analyse viste spesifikk oppregulering av flere gener inkludert SPARC
, RGEIII
, S100A10
, og kollagen type I [2] - [4].

Dyremodeller modeller~~POS=HEADCOMP som gjenspeiler egenskapene til kreft peritonitt og metastaser til peritoneum er viktig for å forstå utviklingen av ondartet progresjon av magekreft. Yanagihara et al. Product: [5] først etablert HSC-58 cellelinje fra menneske scirrhous magekreft, og deretter etablert to underlinjer, 58As1 og 58As9, med et stort potensial for peritoneal formidling og lymfeknutemetastase ved gjentatte ortotopisk inokulering av HSC-58 celler i den gastriske vegg i atymiske mus [6], [7]. Disse underlinjer ofte føre til akkumulering av ascites etter ortotopisk implantasjon og viser økt ekspresjon av gener som koder for proteaser og proteiner som er involvert i celleadhesjon, celle motilitet, proliferasjon og angiogenese [6]. De har også vokser selektivt i den gastriske submucosa, og invadere det dypere laget for å nå den serosale planet i magen [7]. Imidlertid er det fortsatt uklart hvorfor de har fått et så høyt potensial for metastasering under valget.

I denne studien har vi brukt disse svært metastatisk cellelinjer for å undersøke hvordan menneskelige mage kreftceller kan skaffe metastatisk potensial. Vi først sammenlignet genuttrykk profiler mellom høyt metastatiske og lave metastatiske foreldrecellelinjer av microarray analyse. Vi fokuserte på ett gen som heter N-myc nedstrøms regulert gen 1 (NDRG1) fordi det ble funnet å være markert oppregulert i svært magekreft med spredning cellelinjer forhold til sin kollega celler. Det ble også tidligere rapportert at NDRG1 uttrykk var en prediktiv markør for ondartet progresjon og dårlig prognose i mage pasienter [8]. I samsvar med denne studien, observerte vi at høy NDRG1 uttrykk var signifikant korrelert med tumor angiogenese og ondartet progresjon sammen med dårlig prognose i magekreft [9]. Vi rapporterte også at NDRG1 knockdown induserer redusert produksjon av potente angiogene faktorer og tumor angiogenese ved lungekreft celler, og også at NDRG1 er en prediktiv markør for tumor angiogenese og dårlig prognose for pasienter med ikke-småcellet lungekreft [10]. NDRG1, en av de fire NDRG familie gener, viser således forskjellige funksjoner [11], og NDRG1 fungerer enten som metastase demper eller som onkogen og ondartet promoter, avhengig av tumortyper, [11], [12]. Videre er uttrykk for NDRG1 genet tett kontrollert av N-myc og relaterte MYC familie proteiner [13] og overekspresjon av c-myc indusert epitelial mesenchymale overgang (EMT) i mammary epitelceller [14]. Den viktige rolle EMT er ofte referert i dens nære forbindelse med utvikling og tumorprogresjon inkludert kreft metastase [15], [16]. Men i disse studiene ble det regulatoriske rolle NDRG1 ikke undersøkt. I vår nåværende studie undersøkte vi metastatisk potensial av magekreftceller ved sin sammenheng med EMT-baserte rollen NDRG1.

Resultater

Sammenligning av cellevekst, Cell morfologi, tumorvekst, Formidling og genuttrykk profiler mellom meget magekreft med spredning cellelinjer og deres lav metastatisk Motparts

i samsvar med tidligere studier [6], [7], de svært metastatisk kreft cellelinjer 58As1 og 58As9 viste høyere vekst enn foreldre motstykke, HSC-58, med dobling tider av 23-26 timer, sammenlignet med 30 timer for foreldre celler (Figur 1a). 58As1 celler ble enkelt frittliggende og viste suspensjon-type cellevekst med rund morfologi, mens HSC-58 og 58As9 celler ble festet og viste lagdelt cellevekst med en fibroblastisk morfologi (Figur 1B). Begge 58As1 og 58As9 celler viste mye høyere svulst vekst i en subkutan xenograft modell i forhold til foreldre HSC-58 celler (figur 1C). Tidligere studier har vist at det orthotopic transplantasjon av 58As1 celler indusert mye høyere peritoneal formidling og ascites opphopning enn for HSC-58 celler [6], [7]. Vi har videre bekreftet peritoneal spredning av cellene ved å implantere dem inn i bukhulen til mus. Mus implantert med 58As1 celler viste utseendet til et gjennomsnitt på 8 ± 3 synlige noduler i mesenterium av hver enkelt mus og akkumulering av ascites (varierende fra 0.7-2.5 ml /mus) (figur 1D, E). I motsetning til mus implantert med foreldre HSC-58 celler viste dannelsen av få, om noen små knuter, og tilsynelatende uten akkumulering av ascites.

Deretter undersøkte genuttrykk profiler mellom 58As1 celler og deres foreldre motstykke, HSC- 58, ved hjelp av DNA microarray analyse. Av de 41.000 RNA transkripsjoner og varianter, identifiserte vi 3691 differensielt uttrykte gener som ble oppregulert til to ganger, og 3536 gener som ble nedregulert til 0,5 ganger eller mindre i 58As1 celler sammenlignet med HSC-58 celler. Figur 1F presenterte gener som er differensielt uttrykt i 58As1 celler sammenlignet med HSC-58-celler, begrenset til de som tilhører den NDRG familien, og gener relatert til metastase, inkludert matriks-metalloproteinaser (MMP) /katepsiner, adhesjon og epitelial-mesenchymale-overgang ( EMT). Av de fire genene i NDRG familien [17], ble ekspresjonen av NDRG1 og NDRG4 oppregulert i den svært metastatisk cellelinje (58As1) sammenlignet med den parentale cellelinje (HSC-58). Uttrykket av EMT-relaterte gener i 58As1 celler ble spesielt påvirket av oppkjøpet av en høy metastatisk potensial. Uttrykket av epitel-spesifikke gener, inkludert E-cadherin ( CDH1
), P-cadherin ( CDH3
) og β-catenin ( CTNNB1
) ble nedregulert . I motsetning bare MMP1 ( MMP1
) uttrykk ble markert oppregulert; uttrykket av cathepsin L ( CTSL1
) ble økt, men at av cathepsin B ( CTSB
) var det ikke. Uttrykket av mesenchyme-spesifikke gener, vimentin ( VIM
) og Snail ( SNAI1
), en nøkkel transkripsjonsfaktor for undertrykkelse av E-cadherin uttrykk, ble oppregulert.

Forbedret NDRG1 genuttrykk i Highly magekreft med spredning cellelinjer

Vi ytterligere sammenlignet protein uttrykk av flere gener i HSC-58, 58As1 og 58As9 celler (figur 2A). Ekspresjon av NDRG1 ble markert forsterket, og det av vimentin, snegle, p-ERK1 /2, p-Akt, og p-GSK-3β ble også øket, i både 58As1 og 58As9 celler sammenlignet med HSC-58-celler. Det var ingen tydelig uttrykk for Wnt3a og Wnt5a i disse cellelinjer (data ikke vist). Derimot, observerte vi redusert uttrykk av E-cadherin og β-catenin i 58As1 og 58As9 celler sammenlignet med HSC-58 celler (figur 2A). Fosforylering av β-catenin Ser33 /37 og Ser552 ble funnet å være mye mindre i 58As1 og 58As9 enn HSC58. I samsvar med protein uttrykk nivåer, mRNA uttrykk nivåer av NDRG1, vimentin, Snail og MMP-1 var høyere i begge svært metastatisk cellelinjer enn foreldre motpart (figur 2B). Det var mye mindre mRNA uttrykk for E-cadherin og β-catenin i både 58As1 og 58As9 enn HSC-58.

immunocytokjemisk analyse viste at lokalisering av E-cadherin både i cytoplasma og membran, og β-catenin var hovedsakelig lokalisert i cytoplasma i både HSC-58 og 58As9 celler (Figur 2C). Immunocytokjemisk analyse for 58As1 kunne ikke utføres som 58As1 vokser i suspensjon. Videre er ekspresjon av β-catenin var forholdsvis lavere både i cytoplasma og cellekjernen, men det fra snegle ble funnet å være mye høyere i kjernen av 58As1 og 58As9 enn HSC-58 (figur 2D). Vi undersøkte også E-cadherin promoter-aktivitet (figur 2E) og β-catenin indusert rapportøraktivitet, ved TopFlash reporter-analyse (figur 2F) og fant at det var signifikant nedgang i luciferase-aktivitet drevet av E-cadherin-promoteren og også ved β-catenin både 58As1 og 58As9 sammenlignet med HSC-58, i samsvar med mRNA nivåer av både gener.

NDRG1 knockdown induserer oppregulering av E-cadherin og nedregulering av vimentin og Snail i Highly Metastatisk Cells

Vi neste undersøkt om NDRG1 knockdown spesielt påvirket uttrykk for EMT-relaterte gener i den svært metastatisk cellelinje, 58As1. Vi etablerte to stabile NDRG1 knockdown celle kloner, AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 ved trans NDRG1 shRNA inn 58As1 celler. Begge AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 celler viste lignende vekstrater til hverandre og deres foreldre motstykke AS1 /Mock3, med dobling tider av 25-27 timer i kultur (figur 3A). Begge NDRG1 forstummet cellelinjer viste tett adhesjon av celler til kulturen fatet og fibroblastisk morfologi, mens AS1 /Mock3 celler viste en suspensjon-type cellevekst med rund celle morfologi (Figur 3B). Vi neste undersøkt effekten av NDRG1 stanse på den tumorgene aktiviteten av 58As1 celler ved hjelp av en forankrings-uavhengig vekst analysen. Begge NDRG1 stilnet cellelinjene viste signifikant reduksjon av deres forankrings-uavhengig vekst, som indikert ved koloni-nummer i bløt agar ( ^{* p <
0,01). (Figur 3C)}

Deretter vi sammenlignet de genuttrykk profiler mellom AS1 /Mock3 og AS1 /Sic50 celler ved hjelp av DNA microarray analyse (Figur 4A). NDRG1 knockdown resulterte i økt uttrykk av E-cadherin ( CDH1
) og P-cadherin ( CDH3
), men redusert uttrykk for vimentin ( VIM
) og Snail ( SNAI1
). Vi neste utførte western blot og QRT-RCR analyser for flere molekyler som ble modulert av NDRG1 knockdown i microarray analyse (figur 4B, C). Disse to cellelinjene viste mye lavere ekspresjon av både NDRG1 mRNA og protein sammenlignet med de AS1 /Mock3 celler. Forbedret uttrykk for E-cadherin ble konsekvent observert i AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 celler sammenlignet med AS1 /Mock3 celler ved western blot analyse. I AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 celler, både western blot og QRT-PCR-analyser bekreftet redusert uttrykk for vimentin og Snail uten å påvirke uttrykket av p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-Akt, Akt, p-GSK-3β og GSK-3β (figur 4B, C).

på den annen side er NDRG1 vel kjent for å undertrykke metastase og celleproliferasjon ved prostata og kolon kreftceller. Nylige studier har vist at NDRG1 modulerer Wnt-β-catenin signalveien med øket ekspresjon av E-cadherin i human prostata og tykktarm kreftcelle [18], [19]. Imidlertid har NDRG1 knockdown i 58As1 celler ikke påvirker β-catenin ekspresjon både protein og mRNA nivå (figur 4B, C). Og også β-catenin drevet promoter aktivitet ved TopFlash reporter analysen viste ingen forskjell i promoter aktivitet mellom AS1 /Mock og NDRG1 forstummet cellelinjer. Derfor β-catenin ekspresjon ble ikke påvirket av NDRG1 knockdown. NDRG1 knockdown dermed konsekvent økt uttrykk av E-cadherin og redusert uttrykk av sneglen og vimentin i svært metastatisk cellelinje. Men det var ingen synlig endring i uttrykket av β-catenin av NDRG1 knockdown.

Enhanced E-cadherin Arrangøren aktivitet ved NDRG1 knockdown gjennom sneglen i magekreft Cells

Av ulike transkripsjonsfaktorer som undertrykker uttrykk for E-cadherin inkludert Snail, Slug, Twist, TCF4 og SIP1 [20], uttrykk for Snail ble spesielt modulert av NDRG1 i magekreftceller. Vi undersøkte om uttrykk for E-cadherin og /eller vimentin kunne være regulert av Snail i HSC-58 celler. Forbigående behandling med snegle siRNA resulterte i økt ekspresjon av E-cadherin, men ikke den av vimentin og NDRG1, i tidsavhengig måte (figur 5A). Det var bare en liten om noen økning i β-catenin uttrykk ved Snail knockdown. Videre E-cadherin promoter-drevet luciferase-aktivitet ble betydelig undertrykt ved transfeksjon av snegle komplementære DNA i to cancercellelinjene som ble testet (figur 5B). Vi sammenlignet neste E-cadherin promoter aktivitet mellom AS1 /Mock3 og dets NDRG1 forstummet cellelinjer. Som vist i figur 5C, var signifikant (* p
< 0,05) økning av E-cadherin promoter-aktivitet ved NDRG1 knockdown

GSK-3β er et nøkkelenzym for aktivering av EMT. pathway [20], [21], og også for fosforylering av NDRG1 [22], [23]. Ekspresjon av p-GSK-3β ble øket i den svært metastatisk cellelinje, 58As1 (se figur 2A). Vi undersøkte om GSK-3β var involvert i NDRG1 indusert endret uttrykk for E-cadherin og vimentin. Behandling med en inhibitor (CT99021) av GSK-3β resulterte i redusert ekspresjon av p-NDRG1 og p-GSK-3β, og også økt ekspresjon av E-cadherin og β-catenin i 58As1 celler (figur 5D). Som vist i figur 5E, gjorde β-catenin knockdown ikke påvirke uttrykket av E-cadherin, vimentin og Snail.

NDRG1 knockdown induserer Mesenchymale Epitelial Overgang og undertrykker metastaser til peritoneum av høyt magekreft med spredning Cells

Sammenligning svulst vekst på AS1 /Mock3, AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 celler i en xenograft modell avslørte tregere svulst vekst på både AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 av NDRG1 knockdown (Figur 6A, B). NDRG1 knockdown fortrengt lokal infiltrasjon i AS1 /Mock3 tumorceller inn i det omkringliggende stroma og tilstøtende adipose og /eller muskelvev, og innkapsles tumorvekst (figur 6C). Høy uttrykk for E-cadherin ble observert i AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 svulster, mens høy uttrykk for vimentin ble observert i kreftceller av AS1 /Mock3 tumorer (Figur 6D). Derimot, var det nesten ingen endring i uttrykket av β-catenin i AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 svulster sammenlignet med AS1 /Mock3 svulst.

For å undersøke om NDRG1 knockdown kan påvirke metastaser til peritoneum og akkumulering av ascites, sammenlignet vi metastatisk potensial til AS1 /Sic50 og AS1 /Mock3 celler etter orthotopic transplantasjon. Figur 7A viser representative bilder av det forstørrede bukhulen og tilstedeværelsen av kreft knuter i peritoneum. Etter orthotopic inokulering av AS1 /Sic50 celler, antall knuter som vises i bukhinnen var ca 30% mindre enn de som følger av AS1 /Mock3 celler, men denne nedgangen var ikke statistisk signifikant ( p
= 0,21) (figur 7B). Men knuter som følge av AS1 /Sic50 celler viste mye mindre størrelser enn de fra AS1 /Mock3 celler (figur 7A). Oppbyggingen av ascites ved AS1 /Sic50 celler var signifikant (* p < 0,01) ble redusert til ca. 10% av det som blir indusert ved AS1 /Mock3 celler (figur 7C). Videre var det en signifikant (* p
< 0,01) økning i overlevelsen av mus inokulert med AS1 /Sic50 celler (51 ± 16 dager) sammenlignet med 35 ± 14 dager for mus inokulert med AS1 /Mock3 celler, noe som indikerer at NDRG1 knockdown forlenger overlevelse (figur 7D).

Diskusjoner

Vi har tidligere rapportert at NDRG1 er nært korrelert med tumor angiogenese og dårlig overlevelse hos pasienter med magekreft, noe som tyder på at NDRG1 er en prediktiv biomarkør for ondartet progresjon av magekreft [9]. Fra vår nåværende studie, observerte vi følgende egenskaper ligger til grunn for kjøpet av en høy metastatisk potensial i magekreft: microarray, western blot og RT-PCR-analyser sammen avslørte oppregulering av NDRG1 i de svært metastatisk cellelinjer, 58As1 og 58As9, sammenlignet med deres lav metastatisk foreldre motstykke, HSC-58; høyere uttrykk av vimentin, sneglen, og MMP-1, og lavere uttrykk for E-cadherin og β-catenin var tydelig i de svært metastatisk cellelinjer i forhold til foreldre motstykke; av genene nedregulert i det svært metastatisk cellelinje, NDRG1 knockdown resulterte i oppregulering av E-cadherin, og nedregulering av vimentin og snegle, men nesten ingen virkning på ekspresjon av β-catenin; E-cadherin promoter aktivitet ble betydelig utvidet med NDRG1 knockdown; NDRG1 knockdown også undertrykt peritoneal spredning og akkumulering av ascites, og invasjon av høyt metastatiske celler til omkringliggende normalt vev.

I denne studien, NDRG1 knockdown resulterte i undertrykkelse av metastase av høyt magekreft med spredning celler (Figur 6 , 7), noe som tyder på at NDRG1 kan være en metastase promotor-gen i stedet for en metastase suppressorgen i magekreft. Vår nåværende studie støtter sterkt ideen om at om NDRG1 fremmer eller undertrykker ondartet progresjon av kreft hos mennesker avhenger av tumortyper og /eller differensiering status [11], [12]. Imidlertid er det fortsatt uklart hvorfor NDRG1 fungerer som tumor suppressor eller arrangøren avhengig av tumortyper eller histologiske typer. Vår tidligere studie viste at NDRG1 undertrykker tumorvekst og angiogenese av bukspyttkjertelen kreft gjennom NDRG1 drevet demping av NF-kB signalveien [24], [25]. Fersk studie har rapportert at uttrykket av metastaser suppressor genet, KAI1
genet, er involvert i NDRG1 mediert metastaser undertrykkelse av prostatakreft gjennom ATF3-NF-kB vei [26]. Videre studier er nødvendig for å forstå hvilke reguleringsmekanisme er spesielt ansvarlig for NDRG1 drevet markedsføring av ondartet progresjon av magekreftceller.

EMT er en fersk høydepunkt som kan være nært forbundet med kreft ondartet progresjon inkludert tilegnelsen av høyt metastatisk potensial [15], [16]. I vår nåværende studie, NDRG1 knockdown forbedret uttrykk for E-cadherin og undertrykte uttrykk for vimentin både in vitro Hotell og in vivo
. NDRG1 kan spille en nøkkelrolle i overgangen fra en polarisert epitelial fenotype til en svært bevegelige mesenchymale fenotype. Delvis eller fullstendig tap av E-cadherin er ofte observert under progresjon mot malignitet i en rekke tumorer, inkludert magekreft [27], [28]. Oliveira et al. [29] rapporterte en nær sammenheng mellom E-cadherin tap og høy metastatisk potensial i magekreft. Chan et al. [30] rapporterte også løselig E-cadherin som en biomarkør for forlenget overlevelse av mage kreftpasienter. NDRG1 knockdown resulterte i relativt høyere E-cadherin uttrykk i AS1 /Sic50 svulster enn i AS1 /Mock3 svulster, noe som tyder på at NDRG1 kan spesielt kontrollere EMT eventuelt gjennom transkripsjonsfaktor sneglen av mage kreftceller (Figur 7E).

Wnt signal har sentrale roller i ondartet progresjon og metastasering av lunge- og brystkreftceller [31], [32], og Wnt signal induserer også EMT som innebærer metastatisk progresjon av epitelial kreft [31], [33]. NDRG1 er kjent som en metastase suppressorgen i prostata og tykktarmskreftcelle [11], [12]. Liu et al [18] har rapportert at NDRG1 undertrykker metastase gjennom Wnt /β-catenin signalveien i prostatakreftceller. En relevant studie av Chen et al [19] har også vist at NDRG1 modulerer TGF-β-indusert EMT gjennom endret ekspresjon av β-catenin og E-cadherin i tykktarmskreftcellen. Vår nåværende studie viste redusert uttrykk av β-catenin i begge svært metastatisk cellelinjer i forhold til foreldre motstykke, HSC-58. Men analyser både western blot og QRT-PCR viste ingen markant endring i uttrykket nivåer av β-catenin og også β-catenin drevet promoter aktivitet mellom høyt metastatiske 58As1 celler og sine to NDRG1 forstummet cellelinjer. Det synes mindre sannsynlig at β-catenin spiller en sentral rolle i undertrykkelse av metastase av NDRG1 knockdown i svært metastatiske kreftceller.

På den annen side er GSK-3β også kjent for å spille en rolle i kontrollen av EMT [20], [21], og GSK-3β er et viktig enzym for fosforyleringen av NDRG1, et utmerket substrat av GSK-3β [22], [23]. Ekspresjonen av p-GSK3P var forholdsvis høyere i den svært metastatisk cellelinjene enn foreldrecellelinje (figur 2B). Behandling med en potent inhibitor av GSK-3β resulterte i en undertrykket ekspresjon p-NDRG1, ledsaget av oppregulering av E-cadherin og β-catenin (figur 5D). Imidlertid var det nesten ingen forskjell i ekspresjonen av GSK-3β og p-GSK-3β ved NDRG1 knockdown i de høyt metastatiske celler (figur 4B), som antyder at GSK-3β ikke kan spille en vesentlig rolle i induksjon av EMT gjennom NDRG1 i mage kreftceller.

sneglen er et representativt transkripsjonsfaktor som styrer uttrykket av E-cadherin [20]. Av ulike regulatoriske faktorer som transcriptionally styrer E-cadherin, uttrykk for Snail ble spesielt modulert av NDRG1 i mage kreft cellelinjer brukt i denne studien. Snail knockdown indusert oppregulering av E-cadherin (figur 5A), og eksogene tarnsfection av Snail cDNA trykt E-cadherin promoter aktivitet (figur 5B).

I svært magekreft med spredning cellelinjer, var uttrykk for Snail oppregulert som sammenlignet med deres lave metastatiske motstykke, HSC-58 (figur 2A, B). Begge NDRG1 silenced cellelinjer, AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54, viste redusert uttrykk for Snail i forhold til sine svært metastatisk motstykke, AS1 /Mock3 (figur 4B, C). Videre E-cadherin promoter aktivitet ble betydelig stimulert både NDRG1 forstummet cellelinjer i forhold til sine svært metastatisk motstykke (figur 5C).

I konklusjonen, NDRG1 knockdown indusert oppregulering av E-cadherin og nedregulering av vimentin og sneglen, og undertrykt invasjonen, metastaser og akkumulering av ascites av svært magekreft med spredning celler. Dette NDRG1 mediert regulering av E-cadherin og /eller vimentin uttrykk påvirket epitel mesenchymale overgang av mage kreftceller. Dette NDRG1 induserte modifikasjon av EMT synes å være i det minste delvis kan tilskrives den transkripsjonelle faktor sneglen. NDRG1, i sin nære sammenheng med EMT-relaterte gener, kan delta i oppkjøp av et høyt metastatisk potensial ved progressive mage kreftceller.

Materialer og metoder

Materialer og cellelinjer

HSC-58 ble etablert fra humane scirrhous gastriske karsinomer og 58As1 og 58As9 ble uavhengig er etablert ved gjentatt ortotopisk implantering av HSC-58 celler i den gastriske vegg i atymiske mus, som beskrevet tidligere [5], [6]. AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 celler ble etablert av stabil transfeksjon av NDRG1 shRNA inn 58As1 celler. Alle cellelinjer ble holdt i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). BxPC-3, a human bukspyttkjertel cancer-cellelinjer ble erholdt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Anti-NDRG1 antistoff ble dannet som tidligere beskrevet [34]. Andre antistoffer ble innkjøpt som følger: anti-β-aktin-antistoff og anti-snegle-antistoff var fra Abcam; anti β-catenin antistoff, anti-β-catenin (Ser 33/37), anti-β-catenin (Ser 552), anti-Wnt, anti-Ki-67, anti-GSK-3β antistoff, anti-EGFR-antistoff, anti-GAPDH-antistoff, anti-p-GSK-3β antistoff, anti-ERK1 /2 antistoff anti-p-ERK1 /2-antistoff, anti-AKT-antistoff, anti-p-AKT-antistoff var fra Cell Signaling Technology; anti-vimentin antistoff var fra Calbiochem; anti-E-cadherin antistoff var fra BD. CT99021 ble kjøpt fra Axon medchem BV (Nederland).

genuttrykk Mikromatriser

Komplementær RNA ble forsterket, merket og hybridisert til en 44K Agilent 60-mer oligomicroarray i henhold til produsentens instruksjoner (Agilent Technologies). Alle hybridiserte microarray lysbilder ble skannet av en Agilent skanner. Relative hybridisering intensiteter og bakgrunns hybridisering verdier ble beregnet ved hjelp av Agilent Feature Extraction Software. For å identifisere opp eller ned-regulerte gener, vi beregnet forholdstall (non-log skalert fold-endringer) fra de normaliserte signal intensiteter av hver probe for sammenligning mellom kontroll og eksperimentelle prøver. Vi etablerte kriterier for regulerte gener: oppregulert gener, forholdet ≥2 ganger; nedregulert gener, forholdet ≤0.5.

Konstruer av NDRG1 shRNA og Etablering av NDRG1 Knockdown cellelinjer

For å oppnå menneskelig en U6 siRNA vektor basert på pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, California), menneske U6 promoter (som inneholder Hind
III og Bam
HI kloning nettsteder) ble amplifisert fra humant genomisk DNA med primerpar 5'-AGATCTGAATTCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGC og 5'-AGATCTAAGCTTCTCGAGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAG, og ligert inn i Bgl
II stedet pcDNA3. Den delvise DNA-fragmenter av menneskelig NDRG1 DNA ble kjemisk syntetisert og klonet inn pcDNA3-hU6siRNA spaltet med Hind
III og Bam
HI å produsere pcDNA3shNDRG1. De syntetiserte DNA for pcDNA3shNDRG1 var: 5'-GATCCGCGTGAACCCTTGTGCGGAATTCAAGAGATTCCGCACAAGGGTTCACGTTTTTTGGAAA og: 5'-AGCTTTTCCAAAAAACGTGAACCCTTGTGCGGAATCTCTTGAATTCCGCACAAGGGTTCACGCG. Den snegl cDNA ble fremstilt som tidligere beskrevet [35]. Snail cDNA ble ligert inn i pcDNA3 (pcDNA3-Snail). Cellene ble transfektert med pcDNA3shNDRG1 eller pcDNA3-sneglen bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen) etter produsentens protokoll. Stabile transfekterte kloner ble etablert ved hjelp av G418 valg.

Transfeksjon av Small interfering RNA

siRNA tilsvarende nukleotid sekvenser av Snail og β-catenin ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California), henholdsvis siRNA tomannsboliger ble transfekterte hjelp Lipofectamine RNAiMAX og Opti-MEM medium (Invitrogen) i henhold til produksjon anbefaling.

Luciferase Assay

for å få E-cadherin-Luc vektor, E-cadhein promoter (-262 til 120) ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av de følgende primerpar: 5'- AGATCTTAGTGAGCCACCGGCGGGGC-3 'og 5'- AAGCTTGGCCGGGGACGCCGAGCGAGGG-3'. Understreking angir restriksjonsenzymkutteseter. Det amplifiserte fragment ble ligert inn i pGEM-T enkel vektor (Promega) og overført til pGL3-basisvektor (Promega) i Bglll og Hindlll setene. E-cadherin-luc og pcDNA3-snegl ble transfektert ved bruk av Lipofectamine LTX og Opti-MEM-medium (Invitrogen) i overensstemmelse med fremstillingen anbefaling. Etter 24 timer ble luciferase-aktiviteten målt i henhold til produsentens instruksjoner (Promega). Videre har vi også undersøkt luciferase aktivitet drevet av β-catenin hjelp TopFlash reporter vektor som beskrevet tidligere [18].

Soft Agar kolonidannende analyse

4 × 10 ^{3 celler ble sådd i 1 ml kulturmedium inneholdende 0,36% (vekt /volum) toppagar lagt over en basal laget av 0,72% (w /v) agar i 6-brønners plater og tillatt å vokse i 3-4 uker. Kolonier ble fotografert og telt i ti tilfeldige synsfelt på 50X forstørrelse ved hjelp av lysmikroskopi. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer.}

Western blot-analyse og fraksjonering av Nucleus og Cytoplasma

Cellene ble lysert i buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl, 350 mM NaCl, 0,1% NP40, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 10 ug /ml aprotinin, 10 ug /ml leupeptin, og 1 mM Na3VO4. Totale cellelysater ble utsatt for SDS-PAGE og blottet på Immobilon-membraner (Millipore Corp., Bedford, MA), som beskrevet tidligere [24], [25]. For å fremstille cytosol og atom fraksjon ble cellene lysert i bufferA (10 mM Hepes, pH 7,9, 10 mM KCl, 10 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,4% Igepal og proteaseinhibitorer) og inkuberes i 20 min på is. Etter sentrifugering (3 min, 5000 rpm), ble supernatanten anvendt som cytoplasmafraksjonen. De resulterende pelleter ble resuspendert i bufferB (20 mM Hepes, pH 7,9, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glycerol, 1 mM DTT og proteaseinhibitorer) og inkubert videre i 2 timer med kontinuerlig omrøring ved 4 ° C. Etter sentrifugering (5 minutter, 15.000 rpm), ble supernatanten anvendt som atomfraksjon.

• PLoS ONE: Expression Profilering av stamcelle-relaterte gener i Neoadjuvant behandlet Gastric Cancer: En NOTCH2, GSK3B og β-catenin Gene Signatur Spår Survival
• PLoS ONE: Role of vascular endothelial growth factor (VEGF) og VEGF-R Genotyping i Føring av metastatisk Process i pT4a resected Gastric Cancer Patients