PLoS ONE: Honokiol induserer kalpain-mediert Glukose-regulert Protein-94 Cleavage og apoptose i Human Gastric kreftceller og reduserer tumorvekst

Abstract

Bakgrunn

Honokiol, en liten molekylvekt naturlig produkt, har vist seg å ha kraftige anti-neoplastiske og anti-angiogene egenskaper. Dets molekylære mekanismer og evnen til anti-magekreft er imidlertid ukjent. Det er blitt vist at anti-apoptotiske funksjon av glukoseregulerte proteiner (GPR) forutsier at deres induksjon i neoplastiske celler kan føre til kreft progresjon og medikamentresistens. Vi utforsket effekten av honokiol om reguleringen av GPR og apoptose i humane mage kreftceller og tumorvekst.

Metodikk og hovedfunnene

Behandling av ulike menneskelige mage kreftceller med honokiol førte til induksjon av GRP94 cleavage, men ikke påvirke GRP78. Stanse av GRP94 av små interfererende RNA (siRNA) kan indusere celle apoptose. Behandling av celler med honokiol eller kjemoterapeutika agenten etoposid forbedret økning i apoptose og GRP94 degradering. Den kalpain aktivitet og kalpain-II (m-kalpain) protein (men ikke kalpain-I (μ-kalpain)) nivå kan også økes ved honokiol. Honokiol-indusert GRP94 nedregulering og apoptose i magekreftceller kan bli reversert av siRNA målretting kalpain-II og calpain hemmere. Videre er resultatene av immunfluorescens farging og immunopresipitering viste en spesifikk interaksjon av GRP94 med kalpain-II i celler etter honokiol behandling. Vi neste observert at svulsten GRP94 over-uttrykk og tumorvekst i BALB /c nakne mus som ble inokulert med menneskelige magekreftceller MKN45 er markert redusert med honokiol behandling.

Konklusjoner og Betydning

Disse resultatene gir det første bevis på at honokiol-indusert kalpain-II-mediert GRP94 cleavage forårsaker human magekreft celle apoptose. Vi foreslår videre at honokiol kan være en mulig terapeutisk middel for å forbedre kliniske resultatet av magekreft

Citation. Sheu ML, Liu SH, Lan KH (2007) Honokiol Induserer kalpain-mediert Glukose-regulert Protein-94 Cleavage og apoptose i human Gastric kreftceller og reduserer tumorvekst. PLoS ONE 2 (10): e1096. doi: 10,1371 /journal.pone.0001096

Academic Redaktør: Hany El-Shemy, Kairo Universitet, Egypt

mottatt: 26 juni 2007; Akseptert: 10. oktober, 2007; Publisert: 31 oktober 2007

Copyright: © 2007 sheu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler fra National Science Council of Taiwan (NSC95-2320-B040-005). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den nest vanligste årsaken til kreftdød i verden [1]. Nesten to tredjedeler av tilfellene oppstår i utviklingsland og 42% i Kina alene [1], [2]. De molekylære mål og mekanismene bak dårlig prognose er ikke godt forstått. Behandling av lokalavansert magekreft er fortsatt en stor utfordring. Til tross for nylige fremskritt i behandling, kliniske utfall for mage kreftpasienter fortsatt dårlig. Bortsett fra kirurgi, rollen adjuvant behandling er fortsatt uprøvd [2], [3]. Dermed behovet for å identifisere potensielle nye terapeutiske og chemopreventive agenter er åpenbar.

Honokiol, en aktiv komponent isolert og renset fra Magnolia officin
, har vist seg å ha effekten av anti-oksidasjon [4], mot lipidperoksidasjon [5] og anti-inflammatorisk in vitro Hotell og in vivo product: [6], [7]. Honokiol har også vist seg å være en systemisk tilgjengelig og ikke-toksisk hemmer av angiogenese [8]. Den nylige studier har rapportert at honokiol induserer caspase-avhengig apoptose i B-celle kronisk lymfatisk leukemi-celler og overvinner konvensjonelle legemiddelresistens i humant multippelt myelom ved induksjon av caspase-avhengige og apoptose-uavhengig [9], [10]. Selv om en fullstendig vurdering av den kliniske potensialet av forbindelsene er ennå ikke mulig, har farmakokinetikk honokiol blitt grundig undersøkt, avsløre at honokiol er tilgjengelig på klinisk kreftbehandling. Flere naturlige produkter inneholdende en rekke terapeutiske forbindelser som er nyttige i å hindre utvikling av maligniteter fortsetter å bli oppdaget; Men svært lite er kjent om de underliggende virkningsmekanismer eller deres molekylære mål.

Glukose regulerte protein (GRP) 94 er en mest tallrike glykoprotein i endoplasmatisk retikulum (ER) og bare bli identifisert i virveldyr. Over-uttrykk anti og Ribozyme tilnærminger i vev kultur systemer direkte demonstrert at GRP78 og GRP94 kunne beskytte cellene mot døden [11] - [13]. Den beskyttende funksjon av GPR har også blitt observert i motstand mot stråling i livmorhalskreft [14]. Den anti-apoptotiske funksjon av GPR forutsier også at deres induksjon i neoplastiske celler kan føre til kreft progresjon og medikamentresistens [15] - [18]. Patologiske tilstander som tumorvekst og malignitet har blitt foreslått å korrelere med cytoprotective protein GRP94 over-uttrykk [19]. I metastatiske ondartede sykdommer modell, ble en signifikant effekt av den GRP94-baserte gen /immunoterapi strategi vises når det ble kombinert med strålebehandling [20]. ER spiller en direkte rolle i aktivering av en undergruppe av caspase under aktivering av apoptose som oppstår under ER stress [21]. På den annen side, calpainer er en familie av Ca ^{2 + -avhengige intracellulære cysteinproteaser. Ubikvitært uttrykt calpain-I (μ-kalpain) og kalpain-II (m-kalpain)-proteaser er implisert i utviklingen av apoptose. En fersk studie har vist at stedsnærværende calpainer fremme caspase-12 og JNK-aktivering under ER stress-indusert apoptose [22]. Det har også blitt antydet at GRP94 med Ca 2 + -binding og anti-apoptotiske egenskaper er et proteolytisk mål for calpain i løpet av etoposid-indusert apoptose [23]. Videre, i en rekke eksperimentelle modeller av apoptose, har det vist seg at den amino-terminale kalpain hemmende enhet calpastatin kan spaltes av kaspaser, noe som tyder spaltingen er viktig for regulering av kalpain-aktivitet i løpet av celledød [24] - [28] . Caspase-7, som er rekruttert til ER i stressede celler, kan likeledes spalter og aktiverer caspase-12 [29] - [31]. Effektene av honokiol på GPR relatert signalering og apoptose fortsatt ukjent. I denne studien, utforsket vi de molekylære mekanismene for honokiol på human magekreft celle apoptose og tumorvekst in vitro Hotell og in vivo
. Uventet, fant vi at GRP94 gjennomgår bestemte proteolysespalting av kalpain under honokiol-indusert apoptose. Disse observasjonene kan gi bevis på at honokiol er en mulig terapeutisk middel for å forbedre kliniske resultatet av magekreft.}

Resultater

Kinetics av ​​GRP94 proteolytisk spalting i humane mage kreft cellelinjer som behandles med honokiol

Vi først undersøkte effekten av honokiol på de uttrykk for GRP94 og GRP78 i ulike menneskelige mage kreft cellelinjer. Honokiol markert reduserer nivåene til GRP94 i en dose- og tidsavhengig måte, men grp78 nivåer er ikke påvirket (fig. 1 og 2). Kinetikken for honokiol-indusert GRP94 spalting i forskjellige humane magecancerceller er vist i fig. 2. MKN45 eller SCM-1 celler ble mer motstandsdyktig mot honokiol-induserte svar enn AGS eller N87 celler; nivåene av GRP94 ble redusert til omtrent 50% for dobbelt så mye tid. Nivåene av grp78 proteiner forblir uendret i alle fire mage kreft cellelinjer. Dessuten er det lite GRP94 protein uttrykk i normal mus gastrisk epitel vev og humane endotelceller sammenlignet med mage kreftceller (Fig. 1C).

Honokiol induserer GRP94 cleavage-forbundet apoptotisk respons

som vist på fig. 3, honokiol økte poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) spalting og DNA-skade induserbar gen CHOP /GADD153 (et protein har blitt identifisert til å mediere ER stress-indusert apoptose) nivåer i MKN45 celler i en dose- og tidsavhengig måte. Honokiol 20 og 40 M også utløses uttrykkene spaltet kaspase-12 og caspase-7 (p20), som omfanget av økningen var proporsjonal med den timing (Fig. 3B). Videre, for å forstå hvorvidt GRP94 cleavage var involvert i menneskemagekreft celle apoptose, ble apoptose påvist i GRP94-siRNA-transfekterte celler. Stanse av GRP94 av siRNA indusert celle apoptose (fig. 4A) og redusert GRP94 protein uttrykk (Fig. 4B-en). Vi sammenlignet også effekten av honokiol på apoptose og GRP94 nedbrytning i menneskelige mage kreftceller med kjemoterapeutika agenten etoposid. Resultatene viste at behandling av celler med honokiol eller etoposid forbedret økning i apoptose (Fig. 4A) og GRP94 degradering (Fig. 4B-b). Når cellene ble samtidig behandlet med 40 M etoposid og 20 M honokiol, en større økning i GRP94 degradering enn de gjorde ble vist (fig 4B-b.); disse resultatene antyder at kombinasjonen av honokiol med andre kreft narkotika kan være en potensiell terapeutisk strategi.

kalpain er nødvendig for honokiol-mediert celle apoptose

Vi neste fastslått om aktiviteten til kalpain (kalsium -avhengige tiol proteaser) ville bli indusert av honokiol i fire mage kreft cellelinjer. Som vist på fig. 5A, øket honokiol 20 M kalpain-aktivitet i en tidsavhengig måte, som startet å øke i 15 minutter, og nådde en topp ved 60 min, og deretter falt ned til et lavere nivå på 4 timer. Celler forble tilhenger over tid selvfølgelig, uten tap av levedyktighet (data ikke vist). På fig. 5B, viste resultatene at økningen av kalpain aktivitetsnivået til honokiol (20 og 40 M) i 60 minutter i fire mage cancer-cellelinjer. Videre calpain-inhibitorer, N-acetyl-leu-leu-norleucinal (ALLN), N-acetyl-leu-leu-methioninal (ALLM), og Z-Leu-Leu-CHO, effektivt hemmet økning av kalpain-aktivitet indusert ved honokiol i N87 og SCM-1 celler (fig. 5C).

Vi testet nærmere om redusert kalpain aktivitet kan svekke evnen til honokiol på apoptose induksjon. Som vist på fig. 6A, honokiol (40 M) indusert celle apoptose i SCM-1-celle, som kan bli reversert ved calpain-inhibitorer (ALLN eller ALLM). Videre honokiol forbedrede kalpain-II-protein, men ikke kalpain-I-protein uttrykk i SCM-1-celler (fig. 7A). Ved hjelp av et siRNA tilnærming til knockdown kalpain-II-aktivitet førte til en betydelig reduksjon av honokiol (20 M)-indusert apoptose i humane magecancerceller etter 4 timers behandling (Fig. 6B). SiRNA-kalpain-jeg ikke påvirke honokiol-indusert apoptose (Fig. 6B).

Lokalisering og samspillet mellom kalpain-II og GRP94 følgende honokiol behandling

Neste skritt var å klargjøre rollen av kalpain-II i honokiol-indusert GRP94 degradering. I laser confocal mikroskopisk undersøkelse ble lokalisering av kalpain-II protein bestemmes av grønn fluorescens, mens lokalisering av GRP94 ble bestemt av rød fluorescens. Som vist på fig. 7B, både kalpain-II og GRP94 ble oppdaget i cytoplasma med samlokalisering i menneskelige mage kreftceller. Fluorescens kalpain-II ble gradvis økt, men fluorescens av GRP94 ble gradvis redusert i menneskelige mage kreftceller i henhold honokiol behandling. For ytterligere å bekrefte resultatene fra immunocytokjemisk flekker som kalpain-II samhandler med GRP94, ble testene av co-immunoprecipitation og Western blotting i mage kreftceller utført. Som vist på fig. 7C, kalpain-II ble spesifikt assosiert med GRP94 i forskjellige magekreftceller i nærvær av honokiol (20 og 40 M) sammenlignet med IgG-kontroll. Videre har vi testet om de proteolytiske aktiviteter caspase, proteasome eller cathepsin var involvert i spalting av GRP94. Våre resultater viste at behandling av celler med kaspaseinhibitorer (Ac-DEVD-CHO, Z-VAD-FMK og Z-DEVD-FMK, 50 M) ved høy dose delvis blokkert spalting av GRP94 under honokiol-indusert apoptose (fig. 8A ) sammenlignet med calpain-inhibitor ALLM 25 M, som kan fullstendig blokkere GRP94 spaltning. Forbehandling av celler med cathepsin B-hemmer CA-074-Me 25 og 50 M og cathepsin L inhibitor cathepsin L inhibitor II 25 og 50 M og proteasominhibitor MG132 0,1-10 M var ikke i stand til å blokkere GRP94 cleavage (fig. 8B og 8C) . Videre kunne den spesifikke spaltingen av GRP94 av kalpain holdes ved hjelp av cellelysatene fremstilt fra humane magecancerceller (data ikke vist).

neste undersøkt om kalpain-aktivering er nødvendig for honokiol-indusert celle-apoptose. På fig. 9, var økningene av kalpain-II-protein ekspresjon og GRP94 degradering og caspase-7 og caspase-12-aktivering indusert av honokiol (40 M) forhindres ved farmakologiske calpain-inhibitorer og forbigående transfeksjon av siRNA-kalpain-II i SCM-1-celler.

honokiol demper svulst GRP94 over-uttrykk og tumorvekst i nakne mus

Nude mus ble inokulert med 4 × 10 ^{6 udifferensierte adenokarcinomceller MKN45 og behandlet med honokiol 0,5 og 1,5 mg /kg eller kjøretøy når svulsten ble tydelig. Immunhistokjemi og Western blotting-analyse viste at GRP94 over-ekspresjon og akkumulert i tumor-regionen, men ikke i normal gastrisk vev (fig. 10A-en og 10A-b). Honokiol markert redusert akkumulering av GRP94 i tumorer sammenlignet med bærerkontroll (fig. 10A-en og 10A-b). Ekspresjon av GRP78 ble ikke påvirket (data ikke vist). For å avgjøre om honokiol kunne undertrykke tumorvekst in vivo
, solide tumorer ble etablert i mus og anti-tumor effekt av gjentatte ganger injisert honokiol ble studert. Som vist på fig. 10B, administrasjon av honokiol 0,5 og 1,5 mg /kg viste en signifikant anti-tumor aktivitet.}

Diskusjoner

Vi rapportert her for første gang at kalpain, en nonlysosomal Ca ^{2 + -aktiverte cystein protease, spesielt kalpain-II, spiller en nøkkelrolle i spalting av GRP94, men GRP78 er ikke berørt, og i reguleringen av apoptose indusert av honokiol i menneskelige mage kreftceller. Spesielt vi gitt funksjonelle bevisene for at spalting av GRP94 på honokiol behandling fungerer som en terapeutisk effekt, hemme tumorvekst i musemodell for menneskelig magekreft. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten som viser at honokiol kan manipulere kalpain-induserbar anstand protein GRP94 degradering være målet i løpet av apoptose.}

Studier fra flere laboratorier pekte på ER som et mål rommet ved terapeutiske midler innblandet i apoptose utførelse. Cytosoliske Ca ^{2 + har vært innblandet som en andre budbringer av proapoptosis involvert i både utløser apoptose og regulerings caspases eller calpainer [32] - [34]. En fersk studie har vist at kalpain er en viktig formidler av resveratrol (en naturlig plante polyphenol) indusert apoptose i brystkreft [35]. De fant at resveratrol kan føre til en økning i intracellulær Ca 2+, og aktiverer kalpain-mediert apoptose, som fører til nedbrytning av plasmamembranen Ca 2 + -ATPase isoformen 1 og fodrin i caspase-3 mangelfull MCF- 7 celler. Honokiol har også blitt rapportert å indusere Ca 2 + mobilisering i rotte kortikale nevroner og human neuroblastom SH-SY5Y-celler, antagelig gjennom aktivering av fosfolipase C og IP _{3-reseptorer [36]. I denne studien fant vi at honokiol er i stand til å øke kalpain aktivitet og kalpain-II protein uttrykk, men ikke kalpain-I løpet honokiol gastrisk kreft celle apoptose. Videre calpain hemmere og stanse av kalpain-II av siRNA betydelig reversert honokiol-indusert apoptose. Disse funnene antyder at Ca 2 + -triggered kalpain-II aktivering kan spille en potensiell rolle i honokiol-indusert apoptose.}}

GRP94 /gp96 er ER bosatt medlem av HSP90 familien. GRP94 spiller en viktig rolle i å opprettholde cellulære homeostase. Denne konvensjonelle begrepet GRP94 som proteinfolding anstand blir oppdatert av de funn som GPR fremme svulst spredning, metastase, narkotika motstand, og immunterapi, som har store kliniske implikasjoner i prognosen og behandling av kreft [3]. GRP94 har vist seg å være forbundet med tumorgenisitet i kreftcellelinjer, gnager tumormodeller og humane kreft biopsier [37] - [39]. Dette er i samsvar med funnene at induksjon av GPR bevirker en beskyttende funksjon som overlevelses reaksjoner på næringsstoff sult, acidose, og hypoksi betingelser, som er vanlige i dårlig vaskulariserte faste tumorer [11], [40]. Det har også blitt vist seg at de fleste av de GPR i tumorceller er engasjert i fler anstand komplekser, mens det ikke er i normale celler [41]. Vaksinasjon av mus med tumor-avledede stressproteiner, GRP94, kan fremkalle anti-tumor immunresponser, hvilket ga en markert hemming av tumorvekst og metastase. Aktiviteten av HSP90-inhibitorer har blitt godt validert i prekliniske brystcancermodeller, både mono studier og i kombinasjon med konvensjonell kjemoterapi [41]. Videre har det blitt foreslått at GRP94 er et fysiologisk substrat for calpain [23]. Kalpain er vist å bli aktivert ved den ER-membranen, hvor den kommuniserer med GRP94, noe som resulterer i sin spesifikk proteolytisk spaltning som cellene som gjennomgår apoptose utløses av etoposid [23]. I denne studien fant vi at honokiol-indusert GRP94 spalting og apoptose i humane mage kreftceller kan være helt reverseres ved kalpain hemmere og stanse av kalpain-II av siRNA. Kaspaseinhibitorer ved høy dose delvis reversert honokiol-indusert GRP94 cleavage. Forbehandling av celler med cathepsin B og L-hemmere og proteasominhibitor var ikke i stand til å blokkere honokiol-indusert GRP94 cleavage. Vi viste også at å kneble av GRP94 av siRNA kan indusere magekreft celle apoptose. Videre er resultatene av immunocytokjemisk farving og immunopresipitering viste en spesifikk interaksjon av GRP94 med kalpain-II i magekreftceller etter honokiol behandling. Den spesifikke spaltning av GRP94 av kalpain kan også bli observert ved anvendelse av cellelysatene fremstilt fra humane magecancerceller. Disse funnene derfor foreslå at kalpain-II-mediert GRP94 cleavage spiller en viktig rolle i honokiol utløst magekreft celle apoptose.

calpainer og caspases er to familier av cystein proteaser som de er involvert i regulering av patologiske celle død [22], [31]. Disse proteaser dele flere dødsrelaterte underlag, inkludert caspases seg, cytoskeletal proteiner, Bax, og Bud [42]. Kalpain-formidlet proteolyse forløper på en begrenset måte, men krever ikke en bestemt aminosyrerest som det av caspaser. Selv om både kalpain og caspase har blitt foreslått å spille viktige roller i regulering av patologisk celledød, interaksjoner av disse to familier av proteaser i henhold patologiske tilstander er ikke klart. I foreliggende studie har knockdown og farmakologiske inhibitorer tilnærminger bidratt vesentlig til vår kunnskap kalpain biologi, spesielt med hensyn til sin spesifikke funksjon på celle apoptose, noe som gjør det mulig at caspaser 7 og 12 er nedstrøms fra kalpain i mediering honokiol-indusert gastrisk cancer celle apoptose.

naturprodukt narkotika har blitt foreslått å spille en dominerende rolle i farmasøytisk omsorg [43]. Naturlige produkter er en av de viktigste kildene til potensiell kreft kjemoterapeutika og chemopreventive agenter [43]. Honokiol har vært mye brukt i tradisjonell kinesisk og japansk medisin i flere tusen år, hovedsakelig, for behandling av anti-trombocytopen, anti-bakterielle, anti-inflammatorisk, og anxiolytiske virkninger. Tidligere rapporter har vist at honokiol er også i besittelse av potente anti-neoplastiske og anti-angiogene egenskaper [6], [19], [38]. Imidlertid er den nøyaktige molekylære mekanismen for oppviste antitumoraktivitet ved honokiol ikke godt forstått. Således resultatene av denne undersøkelsen gir bevis for den anti-tumor aktivitet av honokiol i magekreft, og enda viktigere, den molekylære basis for dens virkning. Vi fant at honokiol induserer aktivering av kalpain, GRP94 spalting, og apoptose i humane magecancerceller. Dessuten, etter administrasjon av honokiol i naken hyggelig implantert med MKN45 mage kreftceller viste signifikant anti-tumor aktivitet. Dette preklinisk studie kan fungere som et rammeverk og representerer en lovende ny målrettet tilnærming. I tillegg har de naturlige forbindelsene er vist å kombinere med konvensjonelle cytotoksiske midler kan være klinisk fordelaktig med anticancer legemidler. Denne fordelen pluss den nye bevis for sin anti-tumor mekanismer gjør honokiol pågående kliniske programmet for å være en effektiv og sikker anti-tumor agent.

Materialer og metoder

Cells, Kultur betingelser og reagenser

humane cellelinjer inkludert kaukasiske mage kreft cellelinjer (AGS, en moderat dårlig differensiert adenokarsinom cellelinje, og N87, et godt differensiert karsinom cellelinje) og asiatiske mage kreft cellelinjer (MKN45 og SCM-1, den udifferensierte adenokarcinomceller) ble hentet fra cellen bank i kreft sentrum av Taipei veteraner general Hospital (Taiwan). Celler ble opprettholdt i RPMI 1640-medium inneholdende 10% varme-inaktivert FCS (Life Technologies) og streptomycin /penicillin (Life Technologies) i en fuktet 5% CO _{2 atmosfære. Honokiol ble innhentet fra Wako Chemical Company (Japan), og dets renhet ble bestemt til å være minst 99% av væskekromatografi.}

Western blot analyse og immunoutfellinger

Hele cellelysater ble fremstilt som tidligere beskrevet [44]. Proteiner ble separert ved prefabrikerte 8-20% SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese, og deretter elektroforetisk overført fra gelen til polyvinylidendifluorid-membraner. Etter blokkering, ble blottene inkubert med anti-GRP94, anti-GRP78, anti-kaspase 12, anti-kaspase 7, anti-PARP, anti-GADD153 (Santa Cruz Biotechnology), anti-kalpain-I (μ-kalpain), anti-kalpain-II (m-calpain) (Santa Cruz Biotechnology), og anti-β aktin (Sigma) antistoffer i PBS innen 0,1% Tween 20 i 1 time, etterfulgt av tre vaskinger 10 min i PBS med 0,1% Tween 20. membranene ble deretter inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer for 60 min. I immunoutfelling, ble proteiner (500 g) ble inkubert med spesifikke antistoffer og immobilisert på protein A-Sepharose-perler. Kulene ble vasket grundig med Baccos immunoprecipitative buffer, kokt, og mikrosentrifugert. Input 10% av cellelysat for IP og 50 g proteiner ble analysert ved Western blotting. Deteksjon ble utført med Western blotting reagent ECL (Amersham), og kjemiluminescens ble avslørt av Kodak X-omat filmer.

kalpain aktivitetsanalyser

Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC er en kalpain protease substrat. Kvantifisering av 7-amino-4-metylkumarin (AMC) fluorescens tillater overvåkning av enzymhydrolyse av peptid-AMC konjugat og kan brukes til å måle enzymaktiviteten. Celler ble fremstilt og behandlet på 24-brønners Corning /Costar-plater. Før tilsetning av inhibitorer celler ble lastet med 40 M Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Biomol) og behandlet med honokiol for angitte tids ved 37 ° C i en fuktet 5% CO _{2 inkubator. Proteolyse av fluorescerende probe ble overvåket ved hjelp av en fluorescerende plate avlesningssystem (HTS-7000 Plus Series bioassay, Perkin Elmer) med filterinnstillingene for 360 ± 20 nm for eksitasjon og 460 ± 20 nm for utslipp.}

siRNA og transfeksjon Analyser

siRNA duplekser spesifikk for inhibering av kalpain-i (μ-kalpain) og kalpain-II (m-kalpain) uttrykk i humane celler ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology: kalpain-i, katalognr . sc-29885, en pool av tre mål spesifikke 20-25 nt sirnas; kalpain-II, katalog nr. sc-41459, en target-spesifikke 20-25 nt siRNA. Kontroll siRNA (katalog nr. Sc-37007) er en ikke-måls 20-25 nt siRNA utformet som en negativ kontroll. Dessuten, tomannsboliger siRNA spesifikk for inhibering av GRP94-ekspresjon ble syntetisert kommersielt ved MWG Biotech (Tyskland). Den følelse (øverst) og antisense (nederst) sekvenser av GRP94 siRNA duplex var som følger: 5'-GAAGAAGCAUCUGAUUACCTT-3 '; 3'-TTCUUCUUCGUAGACUAAUGG-5 '. Som en uspesifikk kontroll, NC et siRNA dupleks med tilfeldige sekvenser ble konstruert som følger: 5'-AGUUCAACGAGUAUCAGCATT-3 '; 3'-TTUCAAGUUGCUCAUAGUCGU-5 '. De sirnas ble anvendt ved en konsentrasjon på 100-200 nM for transient transfeksjon av celler med Lipofectin (Invitrogen) per brønn i en 6-brønns plate med friskt medium. Etter 24 timer fra den første transfeksjon og 24-36 h behandling ble cellene eller cellelysatene samlet og analysert for apoptose eller protein uttrykk, henholdsvis.

immunfluorescens og Laserskanning Konfokalmikroskopi

Celler ble vasket to ganger med PBS, fiksert i 4% paraformaldehyd i 30 minutter og deretter blokkert ved inkubering i 1% bovint serumalbumin i PBS. Primære antistoffer som indikert ble anvendt på objektglassene i en fortynning på 1:500 og inkubert ved 4 ° C over natten. Prøvene ble behandlet med FITC-konjugert eller TRITC-konjugerte sekundære antistoffer (Sigma). Det FITC-merket eller TRITC-merkede celler ble så analysert ved fluorescens mikroskopi. For laserskannemikroskopi, ble immunfluorescens-merkede celler analysert ved hjelp av et invertert laser scanning mikroskop (Zeiss LSM 410 invertere, Tyskland), som er utstyrt med både argon-ion (488 nm) og HeNe (543 nm) lasere. Samlokalisering av to merkede antigener ble oppdaget som et enkelt bilde når bildene fra begge kanaler ble kledde. Confocal bilder var bakgrunnen korrigert og fusjonert med Confocal Assistant programmet, og behandlet med Adobe Photoshop-programvare.

Annexin-V FITC og PI Double Farging

annexin V /propidiumjodid (BD Clontech) ble brukt til å kvantifisere antallet apoptotiske celler som tidligere beskrevet [44]. Cellene ble vasket to ganger med PBS og farget med annexin V og PI i 20 minutter ved romtemperatur. Nivået av apoptose ble bestemt ved å måle fluorescensen av cellene ved flow-cytometer (Becton Dickinson). Datainnsamling og analyse ble utført av Cellquest program (Becton Dickinson).

Dyr

Dyreforsøk ble utført i henhold til retningslinjer gitt av komiteen av dyreforsøk, National Chung Hsing University, Taichung, Taiwan. Mann BALB /c naken mus ( nu /nu
) ble kjøpt fra NLAC Taiwan, Inc., Taipei, Taiwan. Musene ble avlet og holdt under spesifikke patogenfrie forhold, forsynt med sterilisert mat og vann ad libitum, og som ligger i en barriere anlegg med tolv timers lys /mørke sykluser. Eksperimentelle prosedyrer ble utført på seks uker gamle mus. Dyrene ble avlivet da de dukket opp døende.

tumorvekst analysen

Cell tumorigenicity ble undersøkt i seks uker gamle BALB /c nakne mus. I korthet, 4 x 10 ^{6 av celler (MKN45) i en eksponentiell vekstfase ble suspendert i 1 ml kulturmedium med 10% føtalt bovint serum. En enkeltcellesuspensjon av MKN45 ble inokulert subkutant inn i den dorsale side av musene. Svulster ble etablert i 14 dager etter MKN45 celler inokulasjon og etterfulgt av behandling med bilen, 0,5 og 1,5 mg /kg honokiol hver dag i 10 dager (7 mus /gruppe). Volumet av den implanterte svulst i ryggsiden av mus ble målt to ganger i uken med en caliper, ved hjelp av formelen V
= ( LW
2) n /6: der V
, volum (mm 3); L
, største diameter (mm); W
, minste diameter (mm).}

Immunohistochemistry

uttrykk for GRP94 i mus solid tumor ble undersøkt ved immunhistokjemi. Thin tumorsnitt (5 mikrometer) var forberedt, festet med kald aceton, blokkert med 3% hydrogen peroxidase, og farget med for primær GRP94 antistoff.

Statistiske analyser

De som er gitt i denne studien verdier er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Alle analyser ble utført ved analyse av varians etterfulgt av Fishers minste signifikante forskjell-test. P
verdi på mindre enn 0,05 ble betraktet som statistisk signifikans.

• PLoS ONE: Galectin-3 Forenkler cellemotilitet i Gastric Cancer av Up regulerende Protease-reseptor-1 (PAR-1) og matriksmetalloproteinase-en (MMP-1)
• PLoS ONE: Høy Mannose-Binding Antiviral lektin PFL fra Pseudomonas fluorescens Pf0-1 Fremmer Cell Death of Gastric Cancer Cell MKN28 via Interaksjon med α2-Integrin