Stomach Health > magen Helse >  > Stomach Knowledges > undersøkelser

Scanning elektronmikros observasjoner av pinnsvinet magen ormen, Physaloptera clausa (Spirurida: Physalopteridae)

scanning elektronmikros observasjoner av pinnsvinet magen ormen, Physaloptera clausa plakater (Spirurida: Physalopteridae)
Abstract
Bakgrunn
Physaloptera clausa
(Spirurida: Physalopteridae) nematoder parasitter i magen av det europeiske pinnsvinet (Erinaceus europaeus
) og føre til vekttap, anoreksi og helsefare. Denne studien gir den første morfologisk beskrivelse av voksen P. clausa
fra magen av infiserte piggsvin, ved hjelp av scanning elektronmikroskopi (SEM).
Metoder
Fra juni til oktober 2011, 10 P. clausa
fra piggsvin var fikset, tørket, belagt og utsatt for SEM undersøkelse.
Resultater
Menn og kvinner (22-30 mm og 28-47 mm, henholdsvis) var stout, med skjellaget reflektere over leppene til danne en stor hodecolla og viser gode tverrgående striper i begge kjønn. Munnen var preget av to store, enkle trekantede side pseudolabia, begge armert med eksterne og interne tenner. Inne i munnhulen, kan en sirkel av interne små tenner holdes. Rundt munnen, ble fire sub-median hode papiller og to store amphids også observert. Den fremre enden av både mannlige og kvinnelige fødte en excretory pore på ventral side og et par side ciliated cervical papiller. I den kvinnelige ormen ble vulva plassert i midten og egg var preget av glatte flater. Den bakre enden av den kvinnelige ormen var Stumpy med to store phasmids i nærhet til sitt ytterpunkt. Den bakre enden av hann hadde stor lateral alae, sammenføyd anteriorly over ventral overflaten, med subequal og ulike spicules, samt fire par forfulgt pre-cloacal papiller, tre par post-cloacal papiller, og to phasmids. Tre fastsittende papiller oppstått anteriort og fire baktil til Cloaca.
Konklusjoner
stede SEM studien gir den første i dybden morfologiske karakterisering av voksen P. clausa
, og fremhever likheter og forskjeller med P. bispiculata P . herthameyerae, Heliconema longissimum Hotell og turgida turgida
.
nøkkelord
Hedgehog nematode Physaloptera clausa
morfologi Scanning elektronmikros Bakgrunn
Voksen nematoder av slekten Physaloptera
Rudolphi 1819, forekomme i magesekken, og sjelden i tynntarmen hos amfibier, reptiler, fugler og et bredt spekter av insectivorous og planteetende pattedyr over hele verden [1-6]. Den første posten i Physaloptera
fra et pungdyr var som Ortlepp [1], som beskrev en art fra en lang-nosed Bandicoot Perameles nasuta
Geoffroy, som døde i London Zoo. Ortlepp ikke navnet art, fordi asymmetri av den ventrale, kaudale papiller på halen av den mannlige var unormal [1, 7]. I 1999, Norman og Beveridge redescribed den Physaloptera
arter (P. peramelis
, P. thalacomys, etter og Physaloptera
sp. Fra både Perameles nasuta Hotell og Isoodon macrourus
) i bandicoots (Marsupialia: Perameloidea) i Australia [7]. Voksne kvinner er ovoviviparous, og livssyklusen innebærer insekter, inkludert biller, kakerlakker og gresshopper som mellomverter og reptiler som paratenic verter [8-13]. Parasitten er vanligvis godt festet til slimhinnen i definitive verten, hvor de beiter på blod. Det har blitt rapportert [14] som parasitter kan noen ganger endre deres område feste, og derfor forårsaker dannelse av mange små magesår ødematøse, og følgelig blødning, betennelse og øket slimproduksjon. Tunge infeksjoner føre til anemi, svakhet, anoreksi, diaré, kakeksi, og vekttap. Diagnosen baserer seg ofte på observasjon av kliniske tegn og parasittegg i avføringen til virveldyr verten [14].
Physaloptera clausa
forårsaker alvorlige mage lesjoner i det europeiske pinnsvinet (Erinaceus europaeus
), og har vært rapportert fra Israel, Italia, Tyskland, Tyrkia og Polen [15-19]. Til dags dato er det et sparsomt med informasjon om morfologi av arter innen familiene Physalopteridae og Spiruridae [6, 20-30]. Denne studien tar for seg dette gapet i kunnskap ved å rapportere den første SEM beskrivelse av voksen P. clausa
fra magen av infiserte pinnsvin.
Metoder
piggsvin er spiny pattedyr som har blitt populært som eksotiske kjæledyr i denne område. Disse dyrene spille en rolle i overføring av et bredt utvalg av virus, bakterier, sopp og parasitter, hvorav noen har zoonotisk viktighet [31]. For eksempel er det foreslått at pinnsvin kan være mange Trichinella spp
i noen deler av verden [32]. Disse dyrene er smittet med gastrointestinale nematoder. En av parasitter i piggsvin er Physaloptera clausa
en vanlig art i familien av Physalopteridae. Voksne kvinner er ovoviviparous og leddyr arter fungerer som mellomverter. I de infiserte infiserte dyr, kan et stort antall parasitter fører til svakhet, kakeksi, anemi, lys diaré og vekttap. I tillegg, P. clausa
kan tjene som en vektor av leptospirose tilveiebringe en forurensning kilde for dyr og mennesker [15]. Derfor både pinnsvin og P. clausa
kan være viktig å bli undersøkt.
Fra juni til oktober 2011, tolv skrotter (noen ble funnet død i gårder og noen ble drept av motorkjøretøy på veien) av piggsvin (6 kvinner og 6 menn) ble henvist til Institutt for patobiologi, ved fakultet for veterinærmedisin, Urmia University, Iran. Parasitological og histopatologiske undersøkelser ble utført spesielt for innsamling av mage nematoder. Ved obduksjon ble observert opphopning av festestedet nematoder og ødem, erosjon og en tykkere magesekken. Totalt 10 ormer (5 kvinner og 5 menn) ble valgt for SEM undersøkelse. Ormene ble vasket i 2% natrium-kakodylat-buffer (pH 7,2), og deretter fjernet med laktofenol-oppløsning (25% glycerol, 25% melkesyre, 25% fenol, 25% destillert vann). Prøvene ble identifisert som P. clausa
basert på morfologiske funksjoner som cephalic arrangement; avstand av vulva fra fremre enden av kvinne; antall, størrelse og plassering av mannlig hale papiller; cuticular ornamentikk av ventrale del av posten hale; Formen og størrelsen på spicules [2, 3, 33-37]. Ormene ble deretter plassert i 4% glutaraldehyd og undersøkt ved Avdeling for patologi og molekylærmedisin, McMaster University, Canada. De nematoder ble satt i friskt 4% glutaraldehyd i 2 timer, etter fiksert i 1% osmiumtetraoksyd i kakodylat-buffer (pH 7,2) ved 4 ° C i 1 time og dehydratisert gjennom en serie av økende etanolkonsentrasjoner (50, 75, 96 og 100%). Ormene ble deretter tørket med flytende CO 2 i et kritisk punkt tørkeapparat (Kritisk PointDrier, Modell nr. 2800, Ladd Forsknings Industries, Burlington, VT, USA). Hver orm ble plassert på et nummerert aluminium stump, som var belagt med gull i en ion belegg frese anordning (frese Coater, Modell nr. E5100, Polaron Instruments, USA) og undersøkt med et JEOL JSM-840 Scanning Electron Microscope operert ved 20 kV . Bildene ble tatt med et digitalt oppkjøpet system for analoge SEM (GW Elektronikk, Norcross, GA, USA).
Resultater
Alle ormer fjernet fra magen av de undersøkte pinnsvin ble identifisert som P. clausa
. Ormene var hvit i fargen, stout og skjellaget ble reflektert over leppene for å danne en stor cephalic colla (Figures1A-C). Rundt munnåpningen, ble fire hode papiller og to store amphids observert (Figures1B, C). Kinnhulen, omgitt av en tykk vegg, var sylindrisk og karakterisert ved to store, enkle trekantede side pseudolabia, begge armert med eksterne (figur 1B) og interne (Figures1C, D) tenner. Figur 1 Scanning elektronmikros viser fremre enden av kvinnelige Physaloptera clausa. A, Cephalic papiller (tynne piler), cephalic colla (tykk pil), og ciliated cervical papilla (CP). Bar = 150 mikrometer. B, trekantede side pseudolabia (LPL), eksterne tenner (T), en av to amphids (A), to av fire cephalic papiller (CP), og cephalic colla (stjerne). Bar = 42,9 mikrometer. C, to amphids (A), fire cephalic papiller (CP), cephalic colla (stjerne), og en sirkel av interne små tenner i munnen (pilspiss). Bar = 100 mikrometer. D, Høyere forstørrelse av innsiden av munnen (stjerne), og innvendige små tenner (T). Bar = 5 um.
Et utførsels pore og et par av sideveis prikk cervical papiller med en klynge av liten papiller ble observert på den ventrale overflaten av den fremre enden av både mannlige og kvinnelige (Figures2A, C). Hårstråene ble preget av fine tverrgående striper i begge kjønn (Figures2B-D). I en kvinnelig ormen ble en unormal ciliated cervical papilla observert (figur 2B). Alle kvinnelige ormer fødte en enkelt papilla 589 mikrometer fra fremre enden (figur 2D). Figur 2 Scanning elektronmikros viser fremre enden av kvinnelige Physaloptera clausa. A, Høyere forstørrelse av prikk cervical papilla (CP), og en klynge av små papiller (P). Bar = 10 mikrometer. B, Høyere forstørrelse av en unormal ciliated cervical papilla (pilspiss), og cuticular tverrgående striper (TS). Bar = 20 mikrometer. C, Høyere forstørrelse av excretory pore (EP), og cuticular tverrgående striper (TS). Bar = 20 mikrometer. D, Høyere forstørrelse av en enkelt papilla (stjerne), og cuticular tverrgående striper (TS). Bar = 7,5 mikrometer.
Hunnene var 28-47 mm lang og 1.3-1.6 mm bred. Den kvinnelige vulva var plassert foran midten av kroppen. Mønsteret av skjellaget rundt vulva skilte seg fra de cuticular tverrgående striper (figur 3A). Egg var oval, med glatte overflater og målte 38 × 52 mikrometer (Figur 3B). Anal pore var plassert på bakre enden (Figur 3C). På avstumpet avrundet bakre ende, ble to subterminal store phasmids observert, ca 222 mikrometer fra bakparten (figur 3D). Figur 3 Scanning elektronmikros viser kvinnelige Physaloptera clausa. A, Vulva (V), og skjellaget rundt vulva (stjerner). Bar = 20 mikrometer. B, Egg (EGG). Bar = 3 mikrometer. C, Anal pore (AP). Bar = 75 mikrometer. D, Høyere forstørrelse av phasmids (Ph). Bar = 85,7 mikrometer.
Hannene var 22-30 mm lang og 0.82-1.31 mm bred. Den mannlige tail fødte stor lateral alae, møte ventralt foran Cloaca; de spicules var subequal og ulikt (figur 4A, B, D). Mens den høyre spicule var preget av en skarp spiss (figur 4B), venstre spicule hadde en tykk ekstremitet (Figures4A, D). Anteriort og posteriort til Cloaca, tre og fire fastsittende papiller, henholdsvis, ble observert (Figur 4D). Den bakre ende av hann ble karakterisert ved nærværet av fire par av stilk pre-cloacal papiller (figur 4B-D), tre par etter cloacal papiller (figur 4D-F) og to phasmids (figur 4E, F). Figur 4 scanning elektronmikroskopi viser bakre enden av mannlige Physaloptera clausa. A, kaudal alae (CA), og spicule (S). Bar = 429 mikrometer. B, Caudal alae (stjerne), fire forfulgt precloacal papiller (PrCP), tre postoacal papiller (POCP-), og cuticular rygger (CR). Bar = 375 mikrometer. C, Høyere forstørrelse på fire av forfulgt precloacal papiller (PrCP), og cuticular rygger (CR). Bar = 75 mikrometer. D, Forfulgt precloacal papiller (PrCP), postcloacal papiller (POCP-), tre (pilspiss) og fire (piler) fastsittende papiller direkte til fremre og bakre til Cloaca henholdsvis venstre spicule (LS), og cuticular rygger (CR). Bar = 100 mikrometer. E, forfulgt precloacal papiller (PrCP), postcloacal papiller (POCP-), og phasmids (Ph). Bar = 150 mikrometer. F, Høyere forstørrelse av postcloacal papiller (POCP-), og phasmid (Ph). Bar = 60 mikrometer.
Diskusjon
stede SEM Studien gir morfologiske karakterisering av både mannlige og kvinnelige P. clausa
, for første gang. Den hode regionen, ble kvinnens vulva, egg, anal pore og phasmids vist. I den mannlige ormen, ble morfologiske detaljer om bakenden inkludert pre-cloacal og post-cloacal papiller, fastsittende papiller, spicules, phasmids, og cuticular rygger beskrevet. Også ble likheter og forskjeller med P. bispiculata, P. herthameyerae, Heliconema longissimum Hotell og Turgida turgid
diskutert.
Cephalica strukturer av P. clausa
var lik de av P. bispiculata
[22]. Munningen av P. clausa
har to store, enkle trekantede side pseudolabia, begge armert med eksterne tenner, med en sirkel av interne små tenner inne i munnhulen; i motsetning til dette cephalica enden av P. bispiculata
er kuppelformet, sammensatt av to halvsirkelformede lepper sideveis rundt den orale åpningen. Leppene er avflatet på den indre flaten og udelte. Hver leppe bærer et par av kommaformede cefalisk papiller symmetrisk beliggende på overflaten av et hemi kuppel [22]. I likhet med P. bispiculata
, i tillegg til den store tredelt tann, flere mindre de er tilstede langs den indre kant av hver leppe av P. clausa product: [22]. I en annen SEM studie av P. herthameyerae
n. sp., cephalica enden var sammensatt av to halvsirkulære pseudolips, sideveis rundt den orale åpningen [27]. Hver leppe bar et par av hode papiller, tre porøse lignende avgrensede områder, med et skjel mønster som avviker fra overflaten av det fremre parti. De indre kanter av leppene ble karakterisert ved et par cuticular folder, med en tredelt tann projisert mellom seg, hver av dem bærer en pore på den indre overflate, og en fjerde ytre tann [27]. Tilsvarende oral åpning av en annen Physalopterid nematode, Heliconema longissimum, etter er omgitt av to side pseudolabia. Hver pseudolabium bærer to store submedian hode papiller og ovale latero-terminal forsenkninger med en liten side amphid ligger ved foten av hver pseudolabium. Dessuten er den indre overflate av hver pseudolabium kjennetegnet ved en trekantet tann og enkel flat tann ved hver ekstremitet dorsoventral [26]. De mange denticles på innsiden av munnhulen av P. clausa
er lik de som ble observert i Turgida turgida
, en parasittisk nematode av Virginia opossum Didelphis virginiana
, først rapportert av Matey et al
. [23]. Funksjonen til disse denticles er ennå uklar, enskjønt en funksjon for feste til veggen i magesekken har vært en teori [38]. I den foreliggende studien ble to side amphids observert. Nematode amphids eksistere i en rekke former og størrelser, noe sannsynligvis rent chemosensory og noen photoreceptive, med en tilhørende kjertel [39]. Den funksjonelle typen av amphids av P. clausa
er fortsatt ukjent. Dessuten ble et par av side ciliated livmorhals papiller med en klynge av små papiller observert ved fremre enden av både mannlige og kvinnelige P. clausa.
Livmorhals papiller er ofte veldig liten og uanselig, noe som har ført til den feilaktige konklusjon at de ikke er tilstede i noen arter. De større, iøynefallende cervical papiller varierer i form, fra tynne, nål-lignende vedheng til komplekse strukturer med denticulate bakre grenser. Posisjon, størrelse og form av den cervikale papiller anvendes som taksonomiske karakterer. Gitt deres struktur og posisjon, er det sannsynlig at de fungerer som Mekano-reseptorer [40], avgjørende for deres passasje gjennom en liten plass [41].
Vulva av P. clausa
lå foran midten av kroppen. Vulva åpning av P. bispiculata
er plassert i den fremre region, posterior til spiserøret [22], mens den vulvar åpningen av P. herthameyerae
var 5,71 til 10,1 mm fra den fremre ende [27]. I H. longissimum
er vulva ligger ved 39-66% av kroppslengden fra den apikale ytterste ende, mens det er plassert 1,14-1,36 mm fra den bakre ende av legemet av P. obtusus product: [24, 26]. Tilstedeværelsen av egg i det mannlige reproduksjonssystemet for P. bispiculata
ble beskrevet av Oliveira-Menezes et al.
I 2010 [42]. Så langt vi kjenner til, er dette den første rapporten om en mannlig physalopterid nematode husing egg i cloacal regionen, ejakulasjons kanal eller tarmen. Flere egg ble observert limt med sement til cloacal åpning, ved hjelp av scanning elektronmikroskopi [42]. Lysmikroskopi viste at noen menn hadde en lettelse antall embryonerte egg i ejaculatory kanalen cloaca og også i den bakre delen av tarmen [42]. Den sannsynlige forklaringen er at eggene utvikler seg i den kvinnelige livmor blir pumpet av den kvinnelige eller sugd av den mannlige til cloacal åpning og fra dette punktet til tarmen og ejakulasjonskanal. Den mannlige ormen kan være ute av stand til å utvise eggene og et stort antall ble funnet i disse organene. I tillegg kan dette være en viktig tilpasning for parasitten, for eksempel hannene utvist av verten kan bære et stort antall egg og spre dem til mellomverter ved inntak av disse vertene [42]. Vulva av T. turgida
er plassert i den fremre ende av legemet, og som i P. clausa
, det koniske haleboringen en analåpningen, med phasmids plassert baktil [23]. Phasmids er involvert i evalueringen av intensiteten av en gitt stimulus og hjelpe ormen for å opprettholde seg selv og stabilisere i et egnet miljø [41].
Antallet kaudale papiller av hann P. clausa
er forskjellig fra det av mannlige P. bispiculata, P. obtusus Hotell og H. longissimum product: [22, 24, 26], men lik som P. herthameyerae product: [27]. I denne studien, den mannlige halen fødte stor lateral alae møte ventralt foran cloaca, mens tre og fire fastsittende papiller ble observert anteriort og posteriort til Cloaca, henholdsvis. Også fire par forfulgt pre-cloacal papiller, tre par post-cloacal papiller, og to phasmids var tilstede. Den bakre enden av mannlige P. herthameyerae
var ventralt bøyd og skjellaget dukket løs, forming lateral hale alae. De tverrgående striper av kroppen terminert i korrespondanse til den alae og ventrale region boringsradene cuticular kule-lignende strukturer, som danner små rygger som flankerer cloaca og de tre precloacal papiller. Det sentrale området bakre til det andre paret av post-cloacal papiller var glatt mot halespissen. De 21 papiller var knapp-aktig. Tre ble plassert fremre av cloacal åpning, mens de fem par etter ventral papiller, ble to par plassert på et fremspring posteriort for cloaca og tre par mellom cloaca og enden av halen. Fire pedunculated papiller ble observert hver side av cloaca, sammen med to phasmids [27]. Den bakre enden av hann H. longissimum
var spiralformet kveil, støttet av fire doble par av pedunculate pre-anal papiller og seks enkelt par av post-anal papiller, hvorav hver av de fire første parene var store, mens de av de siste to parene var små og fastsittende; et ytterligere par av mindre post-anal fastsittende papiller ble plassert ventralt ved nivået for den første post-anal par. Hvert hale papilla var omgitt av en ring som består av tallrike cuticular, papilla lignende fremspring [26]. I den foreliggende studien, spicules av P. clausa
var subequal og ulik; rett spicule var preget av en skarp spiss, mens den venstre spicule av en fortykket slutt. Spicules av H. longissimum
var ulik og ulikt, venstre spicule med en kraftig pekte distal spiss og den distale halvdel alate bortsett fra en konisk spiss; rett spicule var bredere, båt-formet, og konisk mot den distale spissen [26]. Halen av den mannlige P. bispiculata
var ventralt bøyd og skjellaget dukket løs i regionen anterior til cloaca, med to folder. Mellom disse strukturene og Cloaca var det en dyp cuticular tverrgående brette [22]. Den 21-knappen lignende hale papiller ble også observert ved bakre enden av mannlige P. bispiculata
. De phasmids, som var godt avgrenset firkant strukturer med porer og ujevnheter på overflaten, ble plassert mellom de fjerde og femte par av posteroventral papiller [22]. I 2001 Matey et al.
Spekulert i at den generelle ordningen med mannlig hale papiller i T. turgida
er den samme som i P. praeputialis
, P. rara
, og P. bispiculata
[23]. Det unike med mannlig T. turgida
er tilstedeværelsen av 22 nd bred hale papilla, som allerede hadde blitt observert av Gray og Anderson i 1982 [11], som anså det et fastsittende papilla. Den brede papilla kan representere en distinkt type sanse struktur [23]. Som P. rara Hotell og P. bispiculata
, og i motsetning til P. praeputialis
, T. turgida
har sammenkoblede phasmids [11, 22, 43]. I denne studien, mønster av skjellaget av mannlige P. clausa
på cloacal regionen var annerledes og dekket med små cuticular rygger. Ornamentikken av ventral overflaten av den mannlige halen av T. turgida,
som P. bispiculata, etter inneholder tre forskjellige mønstre som presenterer noen likheter og forskjeller med cuticular funksjonene i den mannlige halen i andre physalopterids [22, . 23]
Konklusjoner
resultatene av tidligere og nåværende studier tyder på at morfologiske egenskaper; slik som cephalic arrangement; antall uteri; avstand av vulva fra fremre enden av kvinne; antall, størrelse og plassering av mannlig hale papiller; cuticular ornamentikk av ventrale del av den mannlige hale; Formen og størrelsen på spicules er viktige funksjoner som bør vurderes i klassifiseringen av physalopterids. Informasjonen som gis her vil bidra til klarlegging av biologien til denne lite kjent parasitten. Selv om funksjonen av eksterne og interne tenner på triangulære sideveis pseudolabiae, de mange denticles på innsiden av munnhulen av P. clausa
, er fortsatt ukjent, men de kan ha en viktig rolle i nematode mate under sin vedlegg til magesekken, og forårsake alvorlig skade på vev som ble observert ved obduksjon. I mellomtiden, strukturer som amphids, phasmids, ciliated livmorhals papiller med en klynge av små papiller, hale papiller, fastsittende papiller og spicules beskrevet her ved hjelp av SEM, fortjener ytterligere investgation bruker transmisjonselektron miscroscope (TEM) rettet mot å bestemme sine funksjoner og til ( ?) gir mer data på biologi av parasitten.
Erklæringer
Takk
forfatterne uttrykke sin takknemlighet til professor Larry A. Arsenault, leder av elektronmikroskop anlegget, Avdeling for patologi og molekylærmedisin, McMaster University, Canada, for hans hjelp i å gi alle fasiliteter i løpet av studien. I tillegg til verdifull hjelp av Mr. Ernie Spitzer, sjefstekniker, og alle teknikere i elektronmikroskopet anlegget er erkjent. Takk til Mr. Seyed Ali Hosseini, School of Electrical Engineering, Universitetet i Teheran, Iran for hans oppriktige hjelp til å ta noen mikrografer. Forfatterne er spesielt gjeld til Robin S. Houston, M.S., Clinical Laboratory Services, Klinisk parasittologi, School of Veterinary Medicine, University of California-Davis, CA, USA for hans konstruktive kommentarer som forbedret manuskriptet. Denne studien var en del av en doktorgradsavhandling av Dr. Tahmine Gorgani, og støttes økonomisk av Urmia University, Iran.
Forfatternes opprinnelige innsendte filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes originale innsendte filer for bilder . 13071_2013_891_MOESM1_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 1 13071_2013_891_MOESM2_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 2 13071_2013_891_MOESM3_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 3 13071_2013_891_MOESM4_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 4 Konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende interesser bidrag
Forfatternes
TG. undersøkt piggsvin, fjernet ormer og utført parasitological prosessen ved hjelp av lysmikroskop. SN: utformet prosjektet, overføres prøvene til McMaster University, Canada, og forberedt prøvene for SEM studie, redigert SEM mikrografer, og utarbeidet manuskriptet. AAF: deltatt i utformingen av studien og planlegging av arbeidet. DO: deltatt i utformingen av studien, kommenterte SEM mikrografer, utarbeidet manuskriptet, og revidert papiret. Alle forfatterne gjennomgått og godkjent manuskriptet.

Other Languages