PLOS ONE: Circulação MicroRNA-26a no plasma e seu valor diagnóstico potencial em Câncer Gástrico

Abstract

Fundo

Nas últimas décadas, uma boa dose de estudos tem proporcionado a possibilidade de os microRNAs circulantes (miRNAs) como biomarcadores não invasivos para diagnóstico de câncer. O objetivo do nosso estudo foi detectar os níveis de miRNAs em tecidos e plasmas de câncer gástrico pacientes (GC) em circulação e avaliar o seu valor diagnóstico.

Métodos

As amostras de tecido foram coletados de 85 GC pacientes. As amostras de plasma foram coletadas de 285 pacientes do GC e 285 controles pareados. miARNs expressos diferencialmente foram filtrados com por Agilent humano miARN Microarray e matriz de baixa densidade TaqMan (TLDA) com amostras reunidas, seguido pela validação quantitativa de transcrição reversa de reacção em cadeia da polimerase (qRT-PCR). operating characteristic (ROC) do receptor foram estruturados para avaliar a precisão do diagnóstico dos miRNAs. O nível plasmático de miR-26a em pacientes GC de diferentes estágios clínicos foi comparado.

Resultados

Quatro miRNAs (miR-26a, miR-142-3p, miR-148a, e miR- 195) revelou coincidentemente diminuição dos níveis no tecido e no plasma dos pacientes GC comparação com os controlos, e curvas ROC foram construídos para demonstrar que o miR-26a tinha uma maior área sob a curva ROC (AUC) de 0,882. Além disso, o miR-26a foi detectada de forma estável no plasma de pacientes GC com diferentes características clínicas.

Conclusão

Plasma miR-26a pode proporcionar um novo e marcador estável de câncer gástrico.

Citation: Qiu X, Zhang J, Shi W, Liu S, Kang M, Chu H, et al. (2016) Circulação MicroRNA-26a no plasma e seu valor diagnóstico potencial em câncer gástrico. PLoS ONE 11 (3): e0151345. doi: 10.1371 /journal.pone.0151345

editor: Zheng Li, Pequim College Hospital Union Medical, CHINA

Recebido: 29 de outubro de 2015; Aceito: 08 de fevereiro de 2016; Publicação: 24 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Qiu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi parcialmente financiado pela National Science Foundation Natural da China (81230068, 81373091, 81302502, 81302490 e 81473049), Natural Science Foundation da província de Jiangsu (BK2012842 e BK20130641), o Programa chave de Pesquisa básica de Jiangsu Departamento Provincial da educação (12KJA330002), Fundo de Investigação especializada para o Programa de Doutorado da educação superior da China (20130092120063), Jiangsu Provincial Programas de Treinamento de inovação e empreendedorismo para alunos de graduação (201412682004Y ), Jiangsu Provincial da Ciência e Tecnologia Innovation Team, ea prioridade Academic Programa de Desenvolvimento das Instituições de Ensino Superior Jiangsu (Saúde Pública e Medicina preventiva)

CONFLITO dE iNTERESSES:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (GC) é uma das neoplasias mais comuns no mundo. Embora a incidência global tem diminuído nos últimos anos, é a quarta neoplasia maligna mais comum (989,000 casos) ea segunda principal causa de morte relacionada ao câncer (738,000 mortes) em todo o mundo [1]. Mais de 70% dos casos ocorrem em países em desenvolvimento [2]. Em particular, os pacientes em estágio avançado ainda demonstram as taxas de sobrevivência extremamente pobres [3] data .Para, o diagnóstico de GC é baseado nos sintomas clínicos, e existem algumas técnicas de teste aplicadas, tais como endoscopia, e exame de bário refeição. No entanto, todas estas abordagens têm mostrado alguns defeitos na detecção de GC. Além disso, existem alguns marcadores tumorais, por exemplo soro de antigénio carcinoembrionário (CEA), antigénio de carbohidrato 19-9 (CA19-9) e antigénio de carbohidrato 72-4 (CA72-4), e existem algumas limitações da sensibilidade e especificidade para rastreio GC [4]. Por isso, damos mais atenção na descoberta novela, biomarcadores confiáveis ​​e não-invasivos de GC.

Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de curta duração (20 ~ 25 nucleotídeos), não codificante RNAs de cadeia simples [5]. Acredita-se que miARNs podem participar na regulação da expressão do gene, dando origem a ARNm de silenciamento tal como a clivagem alvo, a inibição de translação, e mRNA de decaimento [6]. Evidências acumuladas indicou que miRNAs foram envolvidos em vários processos fisiopatológicos e levar a mudanças fundamentais em várias doenças. Zhang et al
. encontrado que o miR-26a induzida apoptose endotelial e indicou um potencial terapêutico de miR-26a para a aterosclerose associada com morte celular apoptótica [7]. Leonov et al
. descrita a inibição de miR-132 resultou em alta ago2
expressão, que estava envolvido na angiogénese e inflamação durante a ativação de células endoteliais primário [8]. Numerosos estudos têm indicado que os miRNAs desempenham um papel indispensável na tumorigênese, agindo como oncogenes ou genes supressores de tumor [9]. Vários miRNAs têm relatado estar relacionada com o cancro pelas perfis de expressão miRNA [10-12]. Infelizmente, as amostras de tecido são difíceis de adquirir. Detectando miARNs em tecidos não é realista na aplicação clínica.

Além disso, cada vez mais provas que demonstrou miARNs circulantes são resistentes à digestão com RNase e de forma estável detectável no plasma e soro com a facilidade de medições [13-14]. Estudos anteriores confirmaram que a existência de miRNAs no sangue ea expressão associada ao câncer, incluindo o linfoma de grandes células B, câncer colorretal, câncer de bexiga e câncer de mama [15-18]. Estes estudos proporcionam colectivamente uma base para miARNs que actuam como novos biomarcadores para o rastreio do cancro circulantes.

Muitos estudos demonstraram o nível de expressão de miARN no plasma não é completamente consistente com que no tumor. miR-378 diminuiu de forma significativa em tecido GC e várias linhas de células [19], mas o miR-378 eram significativamente regulada para cima no soro dos pacientes GC [20]. Como o mesmo que o miR-486, o miR-486 pode funcionar como um supressor de tumor miARN no tumor gástrico [21], que foram sobre-expressos no soro dos pacientes GC [22]. No momento, vários miRNAs de soro /plasma pode distinguir dos pacientes do GC com os controles, no entanto, isso não pode representar a expressão de miRNA no tecido. Se pudermos descobrir os miRNAs tanto diferencialmente expressos em tecido de câncer gástrico e de plasma, ele deve ter mais significado clínico.

Para verificar se os miRNAs diferencialmente expressos tanto em tecidos e plasma, foram utilizados dois microarrays para miRNAs tela . Nas duas fases de validação, quatro miARNs candidatos foram significativamente regulada negativamente nos tecidos de tumor e amostras de plasma por qRT-PCR. Nosso estudo indicou que o miR-26a foi significativamente diminuído de forma estável no plasma de pacientes com câncer gástrico e pode distinguir pacientes com câncer gástrico dos controles, com boa sensibilidade e especificidade. Ele previu-se a ser um biomarcador circulando promissora de câncer gástrico no diagnóstico clínico de rotina.

Materiais e Métodos

Desenho do estudo e sujeitos

Este estudo foi autorizado pela revisão institucional conselho de Universidade médica de Nanjing, e cada participante, desde que o consentimento informado por escrito assinado. Todos os indivíduos foram recrutados pelo Hospital do Câncer Yixin, Hospital Tumor Nantong, Huai-An Hospital Popular primeira e na segunda Hospital Afiliado da Universidade Médica de Nanjing de março de 2006 e maio de 2013, na província de Jiangsu, China.

O tumor tecidos e os tecidos normais (localizado > 5 cm de distância do tumor) foram obtidos a partir de 55 pacientes submetidos a cirurgia de GC e congelados instantaneamente em azoto líquido. As amostras de plasma foram coletadas de 285 pacientes do GC e 285 sexo e plasma pareados por idade dos indivíduos saudáveis ​​foram coletadas como os controles. Todos os pacientes foram comprovados o diagnóstico histológico da GC no momento do diagnóstico inicial, e nenhum deles tinha recebido procedimentos terapêuticos, por exemplo quimioterapia ou radioterapia. Classificamos o estágio do tumor, de acordo com o sistema de estadiamento tumor-nódulo-metástase (TNM) da União de Controle do Câncer Internacional (UICC). As características clínicas dos participantes do estudo são apresentados na Tabela 1.

Um estudo multi-fase foi concebida para identificar os miARNs plasmáticos como os biomarcadores para pacientes de GC (Fig 1). Na fase de descoberta, miRNAs diferencialmente expressos foram avaliados nas amostras de tecido emparelhados a partir de 5 pacientes do GC (S1 tabela) por Agilent Humano miRNA Microarray (V12.0, Tecnologia Agilent, CA, EUA). As amostras de plasma de 5 pacientes de GC (Tabela S2) cujo sexo, idade estados clínicos combinados com as amostras de tecido e 5 controlos saudáveis ​​foram submetidos a TLDA (V2.0; Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) para identificar os miARNs expressos diferencialmente . Na fase de treinamento, os miRNAs significativamente alterados foram avaliados pela primeira vez por qRT-PCR em 50 amostras de tecidos emparelhados e 80 amostras de soro de GC e 80 controles pareados. Posteriormente, os miRNAs diferencialmente expressos entre o tecido e soro foram ainda examinadas em 400 participantes adicionais, que incluiu 200 pacientes do GC e 200 controles.

isolamento de ARN do plasma e do tecido

As amostras de sangue no cubos de vácuo separados foram centrifugados a 3000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Nós recolhido o sobrenadante e armazenou-se a -80 ° C. Antes de iniciar o procedimento de isolamento, nós adicionamos uma concentração final de 10 ^{-4 pmol /l de sintéticos C
. elegans
miR-39 (CEL-miR-39) (Takara, Japão) a cada amostra, a fim de controlar a variabilidade biológica. O ARN foi extraído a partir de 100 ul de plasma utilizando QIAGEN miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, EUA). O RNA total de tecidos foi isolado utilizando o reagente TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA).}

microarrays e qRT-PCR

Profiling foi levada a cabo usando Agilent humano miARN Microarray (V12.0 , Agilent Tecnologia, CA, EUA) e variedade de baixa densidade TaqMan (V2.0; Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Para o isolamento de ARN total a partir de tecidos, de qRT-PCR foi realizada utilizando o kit SYBR (R) PrimeScript ™ RT-PCR (Takara Bio). Uma descrição detalhada dos protocolos experimentais é depositada nos dados S1.

Análise estatística

As amostras de tecido emparelhados foram comparados usando um teste de Wilcoxon. Teste não paramétrico de Mann-Whitney foi realizado para determinar a significância dos níveis plasmáticos de miARN entre o grupo do cancro e grupo saudável. Receptor-operator characteristic (ROC) curvas e as áreas sob as curvas ROC (AUCs) foram obtidos para avaliar o potencial de detecção de GC de miRNAs. As análises estatísticas foram teste bilateral, e P Art < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas com SPSS versão de software 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).

Resultados

Descoberta de biomarcadores candidatos por microarrays

Nós usados duas plataformas de microarray para os miRNAs para analisar e comparar os padrões de expressão de miRNA de duas condições diferentes. TLDA análise foi completada para confirmar miARNs candidatos níveis de expressão. Um total de 142 miARNs foram detectados no plasma. 65 do total de miRNAs foram aumentadas e 77 foram diminuídos em pacientes do GC em comparação com controles

Para identificar miRNAs candidatos, a expressão de miRNAs entre pacientes e controles eram necessários para corresponder com dois critérios:. (1) a expressão desregulamentação no tecido tumoral foi consistente com TLDA resultado [23]; e (2) os níveis de plasma de miARN provando ≥ diferença de 2 vezes entre os pacientes e controles. Em última análise, quatro miRNAs plasma regulada para baixo (ou seja, miR-26a, miR-142-3p, miR-148a e miR-195) foram selecionados como candidatos para a validação de um punho etapa (Tabela 2).

confirmação de miARNs por qRT-PCR

Em primeiro lugar, os resultados das análises dos microarrays foram confirmados usando os tecidos emparelhados, o plasma GC e os controlos correspondentes para estas quatro miARNs por qRT-PCR. Os nossos resultados demonstraram que a tendência dos resultados de qRT-PCR foi semelhante para as micromatrizes de análises, ou em tecidos ou no plasma. O enredo mostrou que os níveis de quatro miRNAs expressão foram estatisticamente significativas nos tecidos GC ( P
= 0,001, P
= 0,002, P Art < 0,001 e P
= 0,003 para miR-26a, miR-142-3p, miR-148a e miR-195, respectivamente, figuras 2A-2D). Enquanto isso, realizamos qRT-PCR para verificar as expressões de miRNAs foram regulados negativamente em outro conjunto independente de 80 amostras de plasma GC e 80 controles saudáveis. As expressões de quatro miRNAs no plasma GC foram significativamente menores em relação aos de controles (todo o P Art < 0,001, figos 2E-2H). As expressões níveis dos quatro miRNAs no plasma foram consistentemente diminuiu, em comparação com amostras de tecido.

validação em larga escala dos microRNAs no plasma em pacientes GC

A fim de validar a estabilidade das expressões de plasma de miRNAs, realizamos qRT-PCR em uma grande escala de 200 amostras GC de plasma e 200 controles sem câncer combinados. Concordante com os resultados da fase de formação, os níveis de expressão mostraram quatro miARNs regulação negativa significativa no plasma de pacientes de GC (All P
< 0,001, Figura 3), sugerindo que estes quatro miARNs em plasma pode servir como biomarcadores candidatos para diagnóstico de GC.

Avaliação do potencial de diagnóstico de miRNAs para GC

para avaliar a eficiência acima de quatro miRNAs como marcadores de diagnóstico para a detecção de GC, foi realizada a curva ROC análise em cada miRNA. Fig 4 revelou que as curvas ROC de quatro miRNAs candidatos demonstraram os miRNAs de plasma foram de valor para distinguir pacientes GC dos controles normais. O valor de corte de 0,651 foi igual a sensibilidade + especificidade-1, que foi máxima para miR-26a (expressão relativa normalizada por células-39). Para miR-26a, a sensibilidade foi de 83,6% ea especificidade foi de 81,5%, com uma AUC de 0,882 (IC 95% = 0,847-0,916) (Fig 4A). No valor de corte de 0,585 para miR-142-3p, a sensibilidade foi de 74,4% ea especificidade foi de 84,1%, com uma AUC de 0,839 (IC 95% = 0,800-0,879) (Fig 4B). As AUC foram de 0,842 (Cl 95% = 0,803-0,882) e 0,765 (Cl 95% = 0,717-0,812) para miR-148a e miR-195, respectivamente. A sensibilidade e a especificidade foram de 75,4% e 83,1% para o miR-148a, 69,2% e 75,4% para o miR-195, respectivamente (Figura 4C e 4D). A combinação ROC análise da curva produziu o valor de AUC de (IC 95% = 0,836-0,908) 0,872 (Fig 4E).

Para verificar o valor diagnóstico do hospedeiro miRNA para o GC, combinamos qualquer um dos miRNAs de plasma e realizado as curvas ROC como mostrado na S1 e S2 Figs. Estes dados indicam que o miR-26a, que mostrou a maior capacidade para diferenciar os pacientes do GC de controles, poderia agir como um biomarcador adequado para a detecção de GC.

Discussão

Apesar de um declínio significativo na mortalidade GC na última década, a taxa de mortalidade é ainda maior do que muitas outras doenças malignas comuns [24]. Nos últimos anos, os biomarcadores tumorais por exemplo, CEA, CA19-9, CA74-2 com sensibilidade limitada e especificidade têm sido amplamente utilizados para o diagnóstico, monitorização e prognóstico de GC [4]. Ao todo, há é de grande importância para o diagnóstico de GC para procurar biomarcadores mais específicos e sensíveis.

miRNAs de tecidos como os biomarcadores de diagnóstico e prognóstico foram propostas pela primeira vez. Bandres et al
. revelou que miR-451 foi regulada para baixo na gástrico primário e tumores colorretais, e a regulação de miR-451 foi associada com baixa DFS e baixa sobrevida global [25]. Xiao et al
. identificada miR-106a como um miRNA dramaticamente sobre-regulada em GC [26]. Eles também descobriram que a expressão de miR-106a foi significativamente relacionado com o estágio do tumor, linfático, metástases à distância e invasão. No entanto, muitos tipos de pacientes com câncer têm sido incapazes de passar por uma cirurgia na prática clínica quando eles são diagnosticados. A confiança na secção cirúrgica e procedimento invasivo para coleta de amostra de tecido limita fortemente a aplicação de miRNAs no tecido do diagnóstico de câncer [27]. A qualidade de diagnóstico destes métodos é insatisfatória.

Emergentes evidências também implica que miRNAs circulantes estão relacionados ao câncer [28-30]. O estudo recente relatou que os miARNs eram detectáveis ​​no plasma e estável à temperatura ambiente e /ou vários processos de congelação-descongelação [31]. Numerosos relatos tinham iluminado que a utilidade dos miRNAs como novos biomarcadores não invasivos para cânceres, como câncer colorretal [32], o cancro da mama [33-34] e carcinoma de células renais [35] circulação.

Em nosso estudo, metodicamente exibiu o perfil miARN nos tecidos emparelhados e no plasma de pacientes de GC e controlos saudáveis. O plasma obtido a partir de 5 5 casos e controlos foram misturados em conjunto para formar duas amostras reunidas e foram usadas para TLDA. Este método de reunir amostras é uma técnica amplamente utilizada que foi demonstrado que são fiáveis ​​para perfilamento [36-38]. Comparando a análise TLDA eo resultado de tissue microarray, foram selecionados quatro miRNAs (miR-26a, miR-142-3p, miR-148a e miR-195) reduzidos em GC.

Posteriormente, foram identificados quatro miRNAs candidatos por qRT-PCR em duas etapas, e encontrou os níveis de quatro miRNAs expressão caiu no plasma de pacientes do GC, que estavam de acordo com as expressões nos tecidos. curva ROC, também conhecida como curva de sensibilidade, é amplamente reconhecido como um método de avaliação do teste de diagnóstico. É também um indicador integrado que reflecte a sensibilidade e especificidade de variáveis ​​contínuas. No estudo actual, a análise ROC indicaram que a combinação de quatro miARNs não foi mais eficaz do que o miR-26a individualmente. sozinho miR-26a poderia conseguir uma boa eficiência diagnóstica em pacientes GC distintivas dos controles saudáveis, com uma AUC de 0,882 (sensibilidade = 83,6% e especificidade = 81,5%). Um estudo anterior por Schneider et al
. exibidos os níveis séricos de CEA, CA19-9 e CA72-4 no GC elucidado uma sensibilidade de 45,5% para CA19-9, 23,8% para CEA e 60,7% para CA72-4 [39]. Estes foram muito menos do que a sensibilidade de miR-26a. Além disso, o nível de miR-26a no plasma expressão foi significativamente menor nos pacientes de GC, e não mostraram qualquer significância com a progressão de GC (Fig S3). Assim, miR-26a tinha um grande potencial como um biomarcador plasma de diagnóstico para GC.

Nas últimas décadas, os estudos anteriores não verificar se se a expressão miRNA de plasma ou soro poderiam representar os níveis de tecido. Comparado com estes estudos, o nosso estudo teve própria característica devido a razões como segue. Em primeiro lugar, foram seleccionados os miARNs que diferencialmente expressos tanto nos tecidos e no plasma, por comparação dos resultados de duas microarrays. Isto resultou em uma melhor oportunidade para identificar marcadores diagnósticos possíveis. Além disso, verificou-se que a expressão de miR-26a significativamente reduzida em doentes GC e manteve-se estável no plasma (S3 Fig).

Os resultados revelaram que a expressão plasma de miR-26a foi significativamente menor nos pacientes do GC em comparação com os controles saudáveis ​​( P Art < 0,05), que mostrou estabilidade em pacientes GC com quadro clínico diferente. A infra-regulação da expressão de plasma miR-26a pode indicar a probabilidade de diagnóstico de GC. Portanto, miR-26a pode ser uma melhor escolha para servir como potencial biomarcador para GC. Deng et al
. mostraram que os níveis de miR-26a em tecidos de GC foram mais notavelmente diminuída do que aqueles em tecidos não tumorais por qRT-PCR [40]. Eles também demonstraram que o miR-26a inibiu o crescimento de tumores e metástases em parte, orientando FGF9
in vivo. Estes consistiram com os nossos resultados. Esses achados confirmam que miRNA-26-A no plasma poderia ser um marcador diagnóstico potencial de GC.

No entanto, as limitações do nosso estudo são que as amostras para a microsséries de tecido e para o TLDA não eram dos mesmos pacientes, e os nossos tamanhos de amostra para os microarrays foram relativamente pequenas. Uma análise mais aprofundada dos microarrays para os mesmos pacientes e a confirmação amostra ampliada são obrigados a ser aplicado como um romance ferramenta de triagem para GC na utilização clínica de rotina. Além disso, nós não escolhemos os miRNAs-regulada por causa do fato de que não foram os miRNAs-regulada cujas mudanças vezes foram ≥ 2. Foram selecionados miRNAs candidatos que foram profusamente expressos em plasma para certificar-se da probabilidade de exame na prática clínica.

Conclusões

em resumo, nosso estudo revelou quatro miRNAs down-regulamentados, miR-148a, miR-142-3p, miR-26a e miR-195, no GC pacientes. Mais importante ainda, a expressão de plasma de miR-26a foi significativamente reduzida e estável em doentes com cancro gástrico. Como resultado, o miR-26a pode proporcionar um biomarcador não invasivo e estável do diagnóstico de câncer gástrico e de triagem.

Informações de Apoio
S1 Data. Protocolos experimentais de microarrays e qRT-PCR
doi: 10.1371. /Journal.pone.0151345.s001
(DOC)
S1 Fig. ROC análise da curva da combinação de dois miARNs entre os quatro miARNs candidatos.
A combinação de miR-26a e miR-142-3p (A), a combinação de miR-26a e miR-148a (B), a combinação de miR-26a e miR-195 (C), e a combinação de miR-142-3p e miR-148a (D), a combinação de miR-142-3p e miR-195 (e) e a combinação de miR- 148a e miR-195 (F) produziu as maiores AUC
doi:. 10.1371 /journal.pone.0151345.s002
(DOC)
S2 Fig. ROC análise da curva da combinação de três miARNs entre os quatro miARNs candidatos.
A combinação de miR-26a, miR-142-3p e miR-148a (A), a combinação de miR-26a, miR-142-3p e miR-195 (B), a combinação de miR-26a, 148a miR-195 e miR-(C) e a combinação de miR-142-3p, miR-148a e miR-195 (D) produziu o maior AUC.
doi: 10.1371 /journal.pone.0151345.s003
(DOCX)
S3 Fig. . nível plasmático de miR-26a em pacientes com câncer gástrico estratificados por estado clínico Terrenos Box mostrou os níveis plasmáticos de miR-26a em 200 controles saudáveis ​​e 200 pacientes com câncer gástrico em estado clínico diferente
doi:. 10.1371 /journal.pone.0151345.s004
(DOCX)
S1 Table. As características clínicas de triagem assuntos de tecido por Agilent Humano miRNA Microarray
doi: 10.1371. /journal.pone.0151345.s005
(DOC)
S2 Table. As características clínicas de triagem assuntos de plasma por TLDA
doi: 10.1371. /journal.pone.0151345.s006
(DOC)

Reconhecimentos

Estamos profundamente gratos pela participação de todos os assuntos que contribuem para esta pesquisa.

• PLOS ONE: superexpressão e função biológica da Protease ubiquitina-Specific 42 em gástrica Cancer
• PLOS ONE: associação entre perda de dentes e câncer gástrico: A Meta-Analysis of Observacional Studies