PLOS ONE: VEZT, um supressor de tumor Novel putativo, suprime o crescimento e de tumorigenicidade de Câncer Gástrico

Sumário

Vezatin (VEZT), uma proteína de junções aderentes transmembranar, foi identificado como um supressor tumoral putativo em nosso estudo anterior. No entanto, o papel de VEZT na tumorigénese permanece elusiva. Nosso objetivo foi esclarecer a sua regulação epigenética e funções biológicas no câncer gástrico. Neste estudo, nós mostramos que o nível de VEZT expressão está envolvido na metástase linfática, profundidade de invasão do câncer e do estágio TNM em 104 pacientes com câncer gástrico. Bissulfato de reação em cadeia da polimerase seqüenciamento (BSP) métodos mostrou que VEZT foi hipermetilado em tecidos e no sangue correspondente de pacientes com câncer gástrico em comparação com controles saudáveis. Helicobacter pylori
( H. Pylori
) infecção induz a metilação e silenciamento de VEZT em células GES-1. Restaurando a expressão VEZT em células de câncer gástrico MKN-45 e NCI-N87 inibiram o crescimento, invasão e tumorigênese in vitro e in vivo
. microarrays análise global foi aplicada para analisar a base molecular das funções biológicas de VEZT VEZT após transfecção combinado com PCR em tempo real e análise de imunoprecipitação da cromatina. proteína-G acoplada do receptor 56 (GPR56), o crescimento celular, o ciclo de divisão celular 42 (CDC42), a migração /invasão e factor de transcrição 19 (TCF19), progressão do ciclo celular, foram identificados como genes alvo VEZT directa. TCF19, um novo alvo de VEZT, foi funcionalmente validado. Superexpressão de TCF19 em células MKN-45 aumentou o progresso do ciclo celular e sua capacidade de crescimento. Este estudo fornece novos insights sobre a regulação do gene VEZT, o que pode representar um alvo potencial para estratégias terapêuticas anti-câncer

Citation:. Miao R, Guo X, Zhi Q, Shi Y, Li L, Mao X, et al. (2013) VEZT, um supressor de tumor Novel putativo, suprime o crescimento e de tumorigenicidade de câncer gástrico. PLoS ONE 8 (9): e74409. doi: 10.1371 /journal.pone.0074409

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 01 de abril de 2013; Aceito: 01 de agosto de 2013; Publicação: 17 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Miao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas do National jovem Science Foundation da China (81101858), o Natural Science Foundation da província de Shandong da China (ZR2011HM041, Y2007C102, ZR2011HM076), Projeto de Pesquisa chave de Shandong Comissão de Ciência e Tecnologia (2011GGB14158, 2007H2071), o jovem Science Foundation da província de Shandong da China (BS2010YY060). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer do sexo masculino ea terceira principal causa de morte feminina relacionada ao câncer em todo o mundo [1]. É um dos principais problemas de saúde pública em todo o mundo [2]. Na China, há 400.000 novos casos de câncer gástrico e 300.000 mortes por ano. Muitos casos que sofriam de câncer gástrico perderam oportunidade curativa com resultado extremamente pobres [3]. Portanto, o desenvolvimento de métodos terapêuticos novos e eficazes é essencial para reduzir a mortalidade por câncer gástrico. Sabe-se que a patogénese de carcinomas gástricos é multifactorial, que inclui a predisposição genética e factores ambientais. Há um número de alternâncias genéticos, incluindo os genes supressores de tumores, oncogenes, moléculas de adesão de células e factores de crescimento [4].

Embora os mecanismos moleculares de carcinogénese gástrica permanecem obscuros, epigenética silenciamento de genes relacionados com o tumor por hipermetilação do promotor surgiu recentemente como um importante mecanismo de desenvolvimento de neoplasias. O perfil de hipermetilação do promotor difere em cada tipo de cancro e dentro de cada gene, de tipo de tumor e proporcionando perfis hipermetilação específicos do gene que pode envolver no mecanismo molecular correspondente de tumorigénese. A identificação de um novo gene alvo por hipermetilação do promotor pode proporcionar perspectivas sobre os mecanismos para a inactivação dos caminhos-supressora de tumor e é importante para a identificação de marcadores de tumores em cancro gástrico [5,6]
.

Recentemente , identificámos, uma proteína transmembranar junções aderentes, VEZT como um gene supressor de tumor candidato. Nosso objetivo foi esclarecer a regulação epigenética e funções biológicas de VEZT no câncer gástrico. VEZT, uma proteína integrante onipresente, está indirectamente associada com o complexo E-caderina-catenina e citoesqueleto de actina [7,8]. As suas funções têm sido principalmente explorado em células epiteliais. Perda de VEZT é progressivamente prejudicial para o desenvolvimento embrionário [9,10], e VEZT é crítica para preservar a integridade das junções celulares durante o stress mecânico de longo prazo que ocorre no nível de células ciliadas do ouvido interno em resposta ao som. Além disso, o VEZT invalidação condicional específico do ouvido interno leva à surdez progressiva [7]. VEZT é altamente expressa no cérebro [8,11]. VEZT é enriquecido em espinhas dendríticas em neurônios de rato hipocampo. Usando VEZT knock-down e knockout condicional antes (D6cre) ou depois (CamKIIαcre) nascimento, VEZT regula a morfologia espinha. As alterações morfológicas não estão associados com os contactos sinápticos comprometida, mas VEZT pós-sináptica desempenha um papel crítico na maturação morfo-funcional de elementos excitatório pós-sináptico [12].

A inactivação do gene VEZT foi identificado no cancro gástrico, e a metilação de ilhas de CpG dentro da região do promotor do gene VEZT contribuir para a sua inactivação, como determinado por um estudo prévio, realizado pelo nosso laboratório [13]. O mecanismo da metilação e o papel exacto do VEZT no desenvolvimento do cancro gástrico são actualmente desconhecidas. Os genes alvo e vias relacionadas de VEZT ainda não foram identificados. Neste estudo, analisou-se sistematicamente o mecanismo de metilação e a metilação do estado do promotor do gene VEZT. Foram também analisadas as suas características funcionais após a reconstituição de expressão VEZT in vitro e in vivo
.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e amostras de tecido

MKN -45, MKN-28, SGC-7901, a linha de células da mucosa gástrica humana imortalizada GES-1 (fornecido pelo Instituto de cirurgia do Aparelho digestivo do Hospital Ruijin filiados a Shanghai Jiao Tong University) [13,14,15,16,17] e as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) foram preservados em nosso instituto. linhas celulares de cancro gástrico células SNU-1 e NCI-N87 foram obtidos de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). Resumidamente, as células foram cultivadas em RPMI1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitelo e 2 mM de L-glutamina. As células foram mantidas a 37 ° C na presença de 5% de CO _2.

tumor gástrico primário e tecidos normais da mucosa gástrica foram recolhidas a partir de qualquer cirurgia terapêutica de rotina ou endoscopia gastrointestinal no nosso departamento. O restante era H. pylori
estado de infecção foi determinado com base no teste rápido da urease, como descrito anteriormente [18].

Ética Declaração

consentimento informado por escrito no estudo foi obtido de todos os participantes. ratinhos nus macho de 4 semanas de idade BALB /c foram adquiridos a partir do Centro de animal Experimental da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China) e mantida no Centro de Animais de Laboratório do Provincial Hospital Filiado à Universidade de Shandong (Jinan, China) em um 12/12 h ciclo claro /escuro (luzes apagadas às 19: 00) com comida e água ad libitum disponíveis. Os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use na Provincial Hospital Filiado à Universidade de Shandong (número de autorização: SHANS87492). O protocolo do estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Provincial Hospital Filiado à Universidade de Shandong.

Processamento de microdissecção a laser para os tecidos e células

Os tecidos foram removidos o mais rapidamente possível após a ressecção e fixados em formalina, embebidos em parafina e cortados em secções de 8 um de espessura para hematoxilina e eosina (H & e) de coloração. Todos os tecidos foram examinados histologicamente e patologistas experientes confirmou os diagnósticos. Uma parte de cada amostra foi incorporado em Tissue-Tek ^{® Optimum Corte Temperatura ™ (OCT) médio composto (VWR Scientific Products, San Diego, CA, EUA) em um criostato e encaixar congelado por microdissecção.}

células e slides congelação foram coradas pouco antes microdissecção de captura de laser (LCM) em gelo. Resumidamente, as secções foram microdissecadas a laser utilizando um sistema de LM200 (Olympus, Japão /Arcturus Engineering Inc, EUA). Áreas de interesse foram selecionados sob a orientação microscópica, e coberto com filme termoplástico de vinil etileno (EVA) montado na tampa opticamente transparente. O laser infravermelho foi ativado pelo toque de um botão, que derrete o filme diretamente sobre as células-alvo. Esta fusão causou uma ligação para formar entre as células e a película de transferência que era mais forte do que a ligação entre as células e as corrediças. Os parâmetros usados ​​para o LCM incluído um diâmetro de laser de 7,5 pm, potência de laser de 50-60 mW. Cinco mil descargas pulso de laser por espécime foram usadas para "capturar" a cerca de 10 000 células morfologicamente a partir de cada caso. Cada população foi estimada em > 95% "homogéneo", tal como determinada por visualização microscópica das células capturadas. As tampas com células capturados foram, em seguida, montado em tubos de 0,5 mL microcentrifage. Após microdissecação, o ADN, ARN ou proteína pode ser extraída a partir de alíquotas de amostras microdissecadas.

análise de metilação

O ADN genómico obtidos a partir das linhas celulares microdissecadas, tecidos de cancro gástrico e de plasma (0,2 ml ) foi purificado utilizando DNAzol (Invitrogen). O ADN purificado foi tratada com bissulfito de sódio (Sigma, Phoenix, EUA) e, em seguida, analisadas por BSP ou reacção em cadeia da polimerase específica (MSP) como anteriormente descrito [13,15]. Os produtos de PCR amplificados foram bissulfito subclonada num sistema de vector TA (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. A sequenciação de ADN foi realizada em três clones individuais (Sangong). Os produtos de PCR foram confirmados por electroforese em gel de agarose e visualizado usando brometo de etídio. Os iniciadores utilizados estão resumidos na Tabela S1.

Electron observação microscópica

H. pylori
estirpes NCTC11637 (ambos cagA- e VacApositive) foram fornecidas pelo professor Guo do Departamento de Microbiologia Médica e Parasitologia, Institutos de Ciências Médicas da Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine. H. pylori
estirpes foram cultivadas rotineiramente durante 72 h sobre base de agar Columbia (bioMérieux, França), com 5% de sangue de carneiro no ar misto contendo 10% de CO _{2, 5% de O2, e N 2 85% em 37 ° C. Então, convertemos H. pylori
para meio líquido contendo infusão de cérebro e coração (BD, EUA), 10% de sangue de carneiro, e os mesmos antibióticos como os utilizados em base de ágar Columbia. O meio líquido foi agitada num agitador (Forma Scientific, EUA) com uma velocidade de rotação constante de 120 rpm. H. pylori
foram contadas utilizando um espectrofotómetro (BioSpec-min, Shimadzu Scientific Instruments, Japão) e lavou-se com PBS estéril (pH 7,4, 5.000 rpm, 10 min) antes da utilização. GES-1 de células (4 x 10 ^{5) foram cultivadas até à confluência em tampa de vidro desliza em placas de seis poços, e, em seguida, as células GES-1 foram infectadas com H. pylori
a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100: 1. Após incubação durante 24 h, as alterações morfológicas das células de GES-1 foram observadas utilizando um microscópio electrónico de transmissão H-800.}}

em tempo real qRT-PCR análise

ARN total purificado foi obtido microdissecadas a partir das células, o RNA total foi extraído usando solução Trizol. A transcrição reversa (RT) foi realizada numa reacção de 20-ul de acordo com as recomendações do fabricante (Qiagen). Análises em tempo real de qRT-PCR foram realizadas utilizando os iniciadores listados na Tabela S1. Os níveis de expressão de transcritos foram determinadas quantificando-se a intensidade do produto de PCR normalizadas para gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase expressão (GAPDH). A medição quantitativa de níveis de mRNA foi realizada utilizando o ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, EUA). Estes dados foram analisados ​​usando o método comparativo Ct.

Western blotting

A proteína total foi extraída das células microdissecadas. Sistema de sinal um tampão de extracção de proteína (430-7608-FDS) da Bio-Rad Corporation foi utilizado para extracção de proteína nas nossas experiências e a concentração foi medida pelo método de ensaio de proteína DC de Bradford (Bio-Rad). Um total de 100 ug de proteína de cada amostra foram separados por gel de SDS-PAGE 10% e transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno equilibrada (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido) As proteínas foram detectadas por quimioluminescência aumentada (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL , EUA) após incubação com o anticorpo primário específico VEZT (1: 2000), IL-6 (1: 2000), AKT (1: 1000), Cag A (1: 3000), IL-8 (1: 3000), ATF3 (1: 2000), e IRX5 (1: 2000) a 4 ° C durante a noite e, em seguida, o anticorpo secundário. Os níveis de proteína foram normalizadas para GAPDH total utilizando um anticorpo monoclonal anti-GAPDH (Sigma) como previamente descrito [15].

Construção de vector de expressão para VEZT e TCF19

e VEZT TCF19 superexpressão vector pEGFP -N1-VEZT e pEGFP-N1-TCF19 foram construídos utilizando a sobreposição de PCR ou PCR método, respectivamente, e os iniciadores utilizados para dois vectores encontram-se resumidos na Tabela S1. Os produtos de PCR foram confirmados através de sequenciação directa de ADN e clonado no vector de expressão de mamífero pEGFP-N1, como anteriormente descrito [15]. linhas celulares de cancro gástrico MKN-45 e NCI-N87 foram utilizados para os estudos superexpressão. Obtivemos estavelmente transfectadas clones por G418 selecção (Promega). Um transfectante estável da vazio vector pEGFP-N1 foi utilizada como um controlo. Para a transfecção, os complexos de Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp., Carlsbad, EUA) e um dos plasmídeos acima mencionados foi preparado de acordo com as instruções do fabricante, e estes complexos foram directamente misturados com as células em placas de 24 cavidades de cultura de células a uma densidade de 4 × 10 ^{4 células por poço. O nível de expressão ou VEZT TCF19 após transfecção foi analisada por PCR em tempo real.}

invasão, migração e ensaios de formação de tubo endotelial

invasão celular, migração e ensaios de formação de tubos endoteliais foram realizados utilizando MKN células -45 e NCI-N87. A cultura de células foi realizada em câmaras Transwell (Corning, NY, EUA). Para o ensaio de invasão, as membranas de pastilhas foram revestidas com Matrigel diluída (San José, CA, EUA). As células (1 x 10 ^{5) foram adicionadas à câmara superior e foram cultivadas durante 48 h. Para o ensaio de migração, as membranas de inserção não foram revestidas com Matrigel mas foram cultivadas sob as mesmas condições. Finalmente, as membranas de inserção foram cortadas e coradas com violeta de cristal (0,04% em água; 100 ml), e as células que migraram foram contadas sob um microscópio invertido e foram fotografadas}

angiogénese in vitro foi avaliada por meio de um. endotelial formação do tubo kit de ensaio (San Diego, CA, EUA). Resumidamente, a cada poço de placas de cultura de 96 cavidades previamente arrefecido foi revestido com uma camada fina de gel de ECM. As HUVECs foram ressuspensas em sobrenadantes recolhidos a partir de células transfectadas. HUVECs (2 × 10 ^{4 células /cavidade) foram adicionados ao gel de ECM polimerizado com 300 ml de sobrenadantes. Após 18 h de incubação, a capacidade de formação do tubo foi avaliada por determinação do número tubular, o comprimento tubular e o número de nós que se cruzam tubulares em cinco campos aleatórios utilizando software Image Pro Plus (Media Cybernetics Inc., Bethesda, MD, EUA) de acordo o método de Mirshahi [19].
células cancerosas gástricas}

crescimento celular e macio formação de colónias de agar ensaio

(2 × 10 ^{3 células) foram incubadas com 100 mL de meio de cultura em 96 placas -multiwell durante um dia a 37 ° C em 5% de CO _{2. As células foram transfectadas com o plasmídeo de 24, 48, 72, 96, e 120 horas. O número de células foi avaliada utilizando o kit de contagem de células-8 (CCK-8) (Dojindo, Japão). Resumidamente, CCK-8 (10 ul) foi adicionado a cada poço. Após 1 h de incubação a 37 °, a absorvância a 450 nm foi medida utilizando o leitor de placas de ARVO MX (PerkinElmer, Massachusetts, EUA). O número de células foi determinado pela absorvância relativa a 450 nm.}}

células de cancro gástrico foram tratadas com tripsina para as suspensões de células únicas de 3 x 10 ^{3 e, em seguida, as células foram plaqueadas em placas de seis poços em completa meio de cultura contendo 0,3% de agar em camadas em cima de 0,6% de agar. As placas foram incubadas a 37 ° C na presença de 5% de CO _{2 durante 16 dias. As colónias que contêm pelo menos 50 células foram contadas. Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão de cinco campos aleatoriamente marcado.}}

O crescimento do tumor em ratinhos nus

As células (1 x 10 ^{6 células em 100 mL) a partir de células cancerosas linhas transfectadas com vector vazio ou um vector de expressão VEZT foram colhidas e inoculadas subcutaneamente em regiões flanco direito de macho de 4 semanas de idade, ratinhos nus BALB /c (Academia chinesa de Ciências, Xangai, China). nódulos dos tumores foram medidos a cada 4 dias com compassos de calibre. Os ratos foram sacrificados após 1 mês. curvas de crescimento do tumor e as taxas de inibição do crescimento foram calculadas. Dois ratos foram usados ​​para os grupos experimental e controle, e três experimentos independentes foram realizados conforme descrito anteriormente [15,16].}

análise de cDNA microarray Global e gene alvo de verificação

RNA total purificada foi obtido a partir das células microdissecadas. Utilizou-se o microarray genoma humano inteiro oligo (Agilent, Santa Clara, CA, EUA). Após a hibridação e lavagem, as lâminas de microarray foram digitalizados com um digitalizador DNA microarray da Agilent. Os arquivos de texto resultantes extraídos da Agilent recurso de extração de Software (versão 9.5.3) foram importados para o software Agilent GeneSpring GX (versão 7.3) para análise posterior. Diferencialmente expressos genes foram identificados através de rastreio fold-change. Para verificação gene alvo foi utilizado PCR em tempo real e análise de imunoprecipitação da cromatina. Os iniciadores para genes alvo são listados na Tabela S1.

análise citométrica de fluxo de ciclo celular

Um dia antes da transfecção, 1 × 10 ^{6 células de MKN-45 as células foram semeadas em placas de cultura de 6 poços sem antibióticos. As células foram transfectadas com vector vazio ou um vector de expressão TCF19. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram colhidas e fixadas em etanol a 70% a -20 ° C durante a noite, e, em seguida, coradas com iodeto de propídio /ml 250 ug (Sigma-Aldrich), 5 ug /ml de RNase A (Sigma-Aldrich) e 5 mmol /L de EDTA em PBS (pH 7,4) durante 30 min. A análise do ciclo celular foi feito por FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, EUA).}

A análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando software SPSS15.0 (SPSS Inc, EUA). Os dados são expressos como a média ± desvio padrão de pelo menos três experiências separadas. A correlação entre a expressão VEZT nos tumores e variáveis ​​clínico-patológicas foi calculada com o teste de classificação de Kruskal-Wallis e o teste de Mann-Whitney. Diferenças entre os grupos foram analisados ​​por meio do teste t de Student e Qui-quadrado. Um valor de p Art < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Relação dos níveis de expressão VEZT e fatores clínico-patológicos em pacientes com câncer gástrico

Nós investigaram a relação entre os níveis de expressão VEZT em 104 gástrica emparelhado tecidos de câncer e fatores clínico-patológicos em pacientes com câncer gástrico. Verificou-se que o nível de expressão foi associada VEZT significativamente com metástases linfáticas, profundidade de invasão do cancro e fase TNM (Tabela 1, P
< 0,05). No entanto, os níveis de expressão VEZT não foram associados com sexo, idade, tamanho do tumor, diferenciação celular, aparência bruta, local do tumor e metástases à distância.
Fatores
No. dos pacientes
média da expressão de VEZT（mean±SD)
P
-value
GenderMale5714.87±2.031.382Female4715.47±3.15Age(year)<654918.62±2.150.584≥655513.11±3.45Tumor tamanho < 5cm5117.16 ± 3.052.682≥5cm5311.26 ± 3.52Cell differentiationPoor differentiation6818.21 ± 1.651.827Moderate differentiation3616.6 ± 2.46Gross appearanceBorrmann Ⅰ + Ⅱtype3217.25 ± 3.462.361Borrmann Ⅲ + Ⅳtype7215.21 ± 6.58Site de tumorCardia2119 0,34 ± 2.530.692Body3611.24 ± 2.61Antrum4717.35 ± 2.87Lymphatic metastasisPositive747.42 ± 7.250.027 * Negative3018.26 ± 9.32Depth de invasionT22518.35 câncer de ± 7.820.041 * T36322.12 ± 4.21T41624.78 ± 5,41 distal metastasisPositive249.34 ± 6.091.032Negative8012.35 ± 8.62TNM # StageⅠ156.35 ± 7.160.0385 * ⅱ2816.37 ± 4.56Ⅲ4817.24 ± 1.41Ⅳ137.41 ± 2.36Table 1. Relação entre os níveis de expressão VEZT em tecidos de câncer e correlação clínica fatores em pacientes com câncer gástrico.
Analisamos a relação entre os níveis de expressão VEZT em tecidos de câncer e fatores clínico-patológicos em amostras de câncer gástrico em comparação com o tecido normal adjacente (n = 104). Nós descobrimos que o nível de VEZT expressão foi significativamente associada com metástase linfática, profundidade de invasão do câncer e do estágio TNM (Tabela 1, P Art < 0,05). No entanto, os níveis de expressão VEZT não foram associados com sexo, idade, tamanho do tumor, diferenciação celular, aparência bruta, local do tumor e metástases à distância #:. TNM, tumor-nódulo-metástase; * p Art < 0,05. CSV Baixar CSV

análise de metilação de tecidos normais gástricos, tecidos com cancro gástrico primários e sangue periférico de pacientes com carcinoma gástrico e controles saudáveis ​​

Com base em um estudo anterior de nosso laboratório, postulamos que a metilação do promotor VEZT era diferente em pacientes com carcinoma gástrico e controlos saudáveis; utilizou-se o software on-line bioinformática para analisar o estado de metilação da região promotora e o gene de VEZT (Figura 1A). Foi examinado o nível de metilação do promotor VEZT em 30 amostras de tecido de pacientes com ADN tecidos de cancro gástrico primários, DNA plasmático e o controlo utilizando métodos BSP, que abrange as regiões de -171bp a -428bp (Figura 1A) correspondente. Os níveis médios metilado de VEZT em 30 tecidos de câncer gástrico primários e 30 tecidos gástricos normais foram 67,78 ± 25,90% e 42,42 ± 30,30%, respectivamente (Figura 1B). tecidos de cancro gástrico preliminares mostraram níveis mais elevados de metilação da região promotora da VEZT quando comparado com tecidos normais gástricas (Figura S1A, Figura 1B, P < 0,05). O nível médio de ADN metilado no plasma em doentes com cancro gástrico primários e os casos de controlo saudáveis ​​foram 69,00 ± 23,90% e 46,71 ± 26,31%, respectivamente (Figura 1C). O nível de ADN metilado no plasma em doentes com cancro gástrico primários mostraram níveis mais elevados de metilação da região promotora de VEZT quando comparado com o caso de controlo saudável (Figura S1B, Figura 1C, P < 0,05). Assim, a metilação significativa foi observada no grupo de cancro gástrico em comparação com controlos saudáveis. O nível de VEZT metilado nos tecidos e no plasma poderia servir como um marcador molecular para o câncer gástrico.

H. pylori
induz a metilação e silenciamento de VEZT
demonstrando

Um número considerável de estudos foram publicados que H. pylori
é um fator de risco independente para a metilação [20,21,22]. Portanto, assumimos que H. pylori provoca
VEZT metilação e subsequentemente carcinogénese. No primeiro, examinou-se o nível de metilação do promotor VEZT no ADN a partir de 23 amostras de tecido de pacientes com H. pylori
gastrite crônica -positivo e os controles usando métodos BSP e MSP, que abrange as regiões de -171bp para -428bp e ​​-342 pb para -513 pb, respectivamente (Figura 1A). Os níveis médios de metilação do promotor VEZT em H. pylori
-positivo eo controle foram 75,74 ± 28,16% e 31,20 ± 25,67%, respectivamente. Assim, foi observada uma diferença significativa na metilação no H. pylori
grupo gastrite crônica -positivo em comparação com o grupo controle ( P Art < 0,01, Figura 2A). A região promotora de VEZT foi metilado geralmente em pacientes com gastrite crónica de acordo com a análise de DME (Tabela S2); no entanto, encontramos quatro casos de H. pylori
gastrite crônica -positivo que eram relativamente não metilado. Observou-se 19 casos de H. pylori
gastrite crônica que -positivo exibido hipermetilação (Tabela S2). Para determinar se H. pylori
induz a metilação do promotor do gene VEZT in vitro
, detectamos que H. pylori
foram associados com a expressão de IL-6, AKT, TNF-а, IL-8, ATF3 e IRX5 proteína após H. pylori
infecção e incubou-se durante 24 h em células GES-1, utilizando transferência de Western. Nossos resultados mostraram H. pylori
promovida a expressão de IL-6, AKT, TNF-а, IL-8, proteína ATF3 e IRX5 e H. pylori
foi bem sucedida em células GES-1 (Figura 2B, 2C). Para confirmar ainda que H. pylori
é de fato responsável pela metilação ou silenciamento de VEZT, analisamos o status de metilação do promotor de VEZT em células GES-1 por MSP e BSP. Como mostrado na Figura 2D e 2E, o promotor de VEZT foi hipermetilação em H. Observou pylori
GES-1 infectados por células, mas unmethylation em células não infectadas com o H. pylori
(Figura 2D e E). O nível de VEZT expressão da proteína também foi menor no H. pylori
células infectados do que em células não infectadas com o H. pylori
(Figura 2C).

Análise funcional após restaurar expressão VEZT in vitro

O silenciamento frequente ou downregulation de VEZT em linhas celulares de cancro gástrico sugere que é provável que um supressor de tumor gene em nosso estudo anterior. A fim de testar este ponto, nós analisamos a expressão VEZT em várias linhas celulares de cancro gástrico por PCR em tempo real e Western blot. Diferentes níveis de expressão VEZT foram encontrados nas seis linhas celulares analisados ​​(Figura 3A). Construiu-se um vector de expressão pEGFP-N1-VEZT e transfectadas vector pEGFP-N1 na linha celular de cancro gástrico MKN-45 e NCI-N87, que não mostrou nenhuma ou baixo nível de expressão VEZT. Após a transfecção, foi examinada a expressão de VEZT nestas linhas celulares por PCR em tempo real, que mostrou que o nível de VEZT expressão transcrição foi regulada 41,99 vezes (Figura 3B, P < 0,01) nestas linhas celulares em comparação com com as células transf ectadas com o controlo. Examinámos também a capacidade das células cancerosas que sobre-expressam gástricas VEZT para invadir e migrar pela invasão Transwell e ensaios de migração (Figura 3C). A capacidade invasiva de células MKN-45 no grupo VEZT /N1 foi significativamente reduzido quando comparado com as células transfectadas de controle (78,32 ± 5,27 vs. 174,13 ± 2,45, P Art < 0,001). O número de MKN-45 células na amostra VEZT-transfectadas que migraram através da inserção Transwell também foi reduzido de forma significativa quando comparada com as células transf ectadas com o controlo (48,28 ± 2,16 vs 7,42 ± 142,13, P
< 0,001).

HUVECs foram suspensas em sobrenadantes recolhidos a partir do controle e VEZT /N1. Após 18 h de incubação, o sobrenadante é recolhido a partir de células VEZT /N1 mostrou um forte efeito inibidor sobre a formação de estruturas tubulares por HUVECs com respeito ao número, comprimento e que intersecta os nós, quando comparado com o grupo de controlo (Figura 3C). Tal como mostrado na Figura 3D, o crescimento celular de células MKN-45 foi significativamente suprimida mediante a restauração da VEZT expressão relativa ao grupo de controlo ( P
< 0,05). Para examinar a reprodutibilidade dos nossos resultados, avaliamos a capacidade das células cancerosas gástricas NCI-N87 de invasão, migração e formar estruturas tubulares em cima VEZT superexpressão. Estes resultados foram semelhantes aos descritos no MKN-45, as células cancerosas que sugerem que VEZT tem um papel importante inibidor na invasão, migração e formação tubular de células cancerosas.

Efeito de sobreexpressão VEZT na tumorigenicidade de cancro células em ratinhos nus

Expressão de VEZT suprimiu o crescimento de ambos MKN-45 e NCI-N87 por CCK-8 de ensaio quando comparado com o grupo de controlo (Figura 3D, P < 0,05). Este achado foi ainda confirmado por ensaio de formação de colónia, pelo crescimento de células de cancro gástrico em agar mole após a transfecção com um vector VEZT que sobre-expressam. taxas de formação de colónias de células MNK-45 foram de 13,56 ± 0,53% no grupo VEZT /N1 e 1,2 ± 0,31% no grupo de controle ( P Art < 0,001, Figura 4E). A taxa de formação de colónias de células NCI-N87 mostrou uma tendência similar. Em seguida, examinou-se o efeito da sobreexpressão VEZT no crescimento do tumor por meio da inoculação MKN-45 ou NCI-N87 /N1 e células N1 VEZT /subcutaneamente nas regiões flanco direito de ratinhos nus. Tumorigenicidade foi significativamente reduzida em células VEZT-transfectadas. o crescimento do tumor rápida foi observada nos grupos de controle após 1 mês (Figura 4F). O papel supressor tumoral de expressão VEZT foi evidente em ambas as linhas celulares tumorais testadas (Figura 4G, P < 0,01), sugerindo que VEZT suprime a tumorigenicidade das células cancerosas. Estes resultados indicam que a expressão de VEZT inibiu a tumorigenicidade de câncer gástrico ambos in vitro
e in vivo
.

Identificação de genes alvo após VEZT transfecção gene

Para elucidar o mecanismo subjacente molecular do efeito inibitório de VEZT em células de invasão, crescimento, migração e a tumorigenicidade de cancro gástrico. Analisamos o perfil transcriptoma do genoma de MKN-45 /N1 e as células VEZT /N1 pela Agilent oligo microarray. De acordo com fold-change (> 3,0), a triagem entre MKN-45 /N1 e as células VEZT /N1, encontramos 193 genes regulados positivamente e 135 genes regulados negativamente (Tabela S3). Foram pesquisados ​​genes que se sobrepunham com associados ao câncer e conjuntos de genes relacionadas com a função molecular em MSigDB (conjuntos C4 e C5 gene; http://www.broad.mit.edu/gsea/msigdb/index.jsp~~number=plural). Foram selecionados 49 genes associados ao câncer que incluem 23 genes regulada e 26 genes regulados negativamente para o mapeamento do cluster no plataforma de análise de microarray MeV (www.tm4.org/mev.html, Figura 4A). PCR em tempo real foi efectuada para a verificação destes genes (Tabela S4) e confirmou os achados microarray para 8 genes regulados positivamente e 10 genes regulados negativamente (Figura 4B). Os nomes dos genes e anotações funcionais estão listados na Tabela S5. Para determinar se estes são genes alvos diretos de VEZT, realizamos cromatina ensaios de imunoprecipitação utilizando anticorpos VEZT e depois analisaram o DNA puxou para baixo. Foram identificados três genes reprimidos, TCF19 (NM_001077511), CDC42 (NM_001039802) e GPR56 (NM_001145770) como alvos VEZT diretos (Figura 4C).

As correlações entre VEZT e seus alvos a jusante, bem como sua associação com a inibição da gástrica invasão células cancerosas, crescimento, migração e da tumorigenicidade de câncer gástrico in vitro
e in vivo
, foram apresentados na Figura 5C.

• PLOS ONE: a identificação e caracterização de biomarcadores-glicanos baseados N Novel em Câncer Gástrico
• PLOS ONE: um polimorfismo genético no TOX3 está associado com a sobrevivência de câncer gástrico em um Population