PLoS ONE: candidatos microRNA Biomarkers no câncer gástrico humano: uma revisão sistemática e Estudo de Validação

Abstract

O câncer gástrico (GC) continua a ser uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo e não há, portanto, uma clara necessidade de procurar biomarcadores precoces diagnósticos mais sensíveis. Foi realizada uma revisão sistemática de oito estudos de perfis de miRNA publicados que compararam tecidos GC com tecidos não cancerosos adjacentes. Um sistema de classificação miRNA foi usada, que teve a frequência das comparações, direção de expressão diferencial e tamanho total da amostra em consideração. Foram identificados cinco miRNAs que foram mais consistentemente relatados a ser regulada (miR-21, miR-106b, miR-17, miR-18a e miR-20a) e dois miRNAs que foram reprimidos (miR-378 e miR-638). Seis delas foram posteriormente validado em 32 conjuntos de pares de GC e amostras de tecidos não cancerosos adjacentes usando PCR em tempo real. MiR-21, o miR-106b, miR-17, o miR-18a e miR-20a foram confirmadas como sendo tecidos upregulatedin GC, enquanto a expressão de miR-378 foi reduzida. Além disso, encontramos uma associação significativa entre os níveis de miR-21 expressão, miR-106b, miR-17, miR-18a e miR-20a e características clínico-patológicas de GC. Estes miARN pode ser utilizado para biomarcadores de diagnóstico e /ou prognóstico para a GC e, por conseguinte, necessitar de uma investigação

citação:. Wang J-G, Hu Y, Kong X, Wang Z-H, Chen H-Y, Xu J, et al. (2013) Candidate microRNA Biomarkers no câncer gástrico humano: uma revisão sistemática e Estudo de Validação. PLoS ONE 8 (9): e73683. doi: 10.1371 /journal.pone.0073683

editor: William CS. Cho, a rainha Elizabeth Hospital, Hong Kong

Recebido: 16 de maio de 2013; Aceito: 19 de julho de 2013; Publicação: 09 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Science Foundation Natural do Programa de Key (No. 30830055), o Ministério da Saúde Pública, China (No. 200.802.094), do Ministério da Educação (nº 20090073110077) a fang JY, ea Fundação Doutor Inovação da Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (No. BXJ201219) para Wang JL. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Apesar de uma recente diminuição na incidência de câncer gástrico (GC) [1], continua a ser uma causa de grande morbidade e mortalidade em todo o mundo, especialmente na Ásia Oriental. Um total de um milhão de novos casos de GC ocorreu em 2008, com 738,000 mortes [2]. Isso representa 8% do total de casos de cancro e 10% do total de mortes. Apesar de a endoscopia pode detectar as fases iniciais de GC, a maioria dos casos ainda são diagnosticados numa fase avançada, o que resulta num mau prognóstico [3]. A taxa de sobrevida em 5 anos para os casos de GC com estágio varia II de 30% para 50%, mas cai para entre 10% e 25% para os pacientes com doença em estágio III [4]. Embora as técnicas endoscópicas estão se desenvolvendo rapidamente, o seu valor para a detecção precoce de GC é limitado devido a uma falta de sensibilidade, altos custos e os inconvenientes. Novos biomarcadores de diagnóstico e prognóstico para GC são, portanto, urgentemente necessário.

Os microRNAs (miRNAs) são curtos não-codificantes moléculas de RNA de 19-25 nt. Estas regulam a expressão do gene ao nível pós-translacional, orientando o complexo de silenciamento induzido por ARN para locais miARN alvo na região não traduzida 3 'do ARNm, conduzindo à degradação do mRNA ou a inibição da tradução [5]. Estudos anteriores demonstraram que numerosas miARNs são expressas de forma aberrante em muitos tipos de cancros, e expressão de miARN perfis mostrou certas miARNs a ser associados com o desenvolvimento do tumor, progressão e resposta à terapia. Eles são, portanto bons candidatos para uso como marcadores de diagnóstico, prognóstico e preditivos [6].

Vários estudos foram realizados para pesquisar biomarcadores, identificando a expressão diferencial de miARNs entre amostras de tecido e GC correspondente gástrica não tumoral tecido a partir do mesmo paciente [7] - [14]. Estes estudos resultaram na identificação de centenas de miARNs expressos diferencialmente. No entanto, muitos destes são susceptíveis de ser falsos positivos, e apenas uma fracção pequena poderia ser utilizado como biomarcador de diagnóstico ou de prognóstico. Uma abordagem lógica para distinguir miARNs importantes a partir de um grande número de listas de miARN candidatos consiste em pesquisar a intersecção de miARNs identificadas em vários estudos independentes [15]. Embora este método tornou-se cada vez mais popular [15], [16], [17], nenhum estudo publicado identificou as interseções de miRNAs relacionadas com a GC com base em um grande número de miRNA expressão profiling estudos.

Realizamos esta revisão sistemática para identificar os miARNs expressos diferencialmente mais importantes que foram consistentemente relatados numa série de estudos de perfis de expressão de miARN independente em pacientes GC. Além disso, ainda validado alguns dos miARNs que eram mais para cima ou regulados negativamente utilizando PCR em tempo real em 32 pares de GC e amostras de tecidos não tumorais adjacentes emparelhados.

Materiais e Métodos

ética Declaração

o estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Shanghai Jiaotong University School of Medicine, e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes no início do estudo.

Pesquisa Estratégia

estudos de potenciais publicados em Inglês foram coletadas de Medline utilizando as seguintes palavras-chave: "miRNA" OU "microRNA 'OU' miR ',' gástrica 'OU' estômago ',' profiling 'OU' microarray '. Listas de referências de artigos de revisão e artigos originais foram pesquisados ​​manualmente para publicações adicionais.

critérios de inclusão da Literatura

Para um estudo a ser incluídos nesta revisão sistemática, diversos critérios tinham de ser cumpridos : 1) estudos tinha que ser miRNA profiling estudos em pacientes GC; 2) estudos tiveram que usar tecidos GC e seus correspondentes tecidos não tumorais adjacentes para comparação; 3) métodos tiveram de incluir técnicas de microarray miRNA. Além disso, apenas publicações de texto completo em Inglês foram incluídos. Os estudos de perfis que utilizaram linhas celulares GC ou amostras de soro de pacientes GC, aqueles que, em comparação GC biópsias de tumores com diferentes fases da doença, e aqueles que utilizam diferentes tecnologias de miARN não foram incluídos. Artigos de revisão também não foram incluídos nesta revisão sistemática.

Extração de dados e listas de miRNA

diferencialmente expressos foram identificados miRNAs de cada estudo incluído profiling. foi determinada informação relevante (ou seja, a localização cromossômica, pré-miRNA comprimento, sequência miRNA maduro e potenciais alvos de miRNAs) e informações em falta foram identificados a partir do banco de dados miRBase (www. mirbase.org/) e Pubmed.

Ranking

Cada incluiu o estudo de perfis [7] - [14] forneceu uma lista de miRNAs diferencialmente expressos (Tabela S1). Griffith e Chan desenvolveu um método para classificar biomarcadores potenciais para os grupos de comparação [16], [17], que tem sido utilizada para estudos de perfis de miARN. Por exemplo, Ma et al. [15] identificou as interseções de miRNAs relacionadas com o cancro colorectal com base em um grande número de estudos de perfil de miRNA. Assim, os critérios para a literatura incluídos nesta revisão sistemática atual foram baseados naqueles em seus relatórios [15]. MiRNAs foram classificados com os critérios na seguinte ordem de importância: (i) o miRNA foi consistentemente relatado como diferencialmente expressos em uma direção consistente de mudança; (Ii) a frequência do miRNA foi relatado nos estudos de microarranjos; (Iii) o tamanho total da amostra para cada consistente relataram miRNAs.

A validação dos miRNAs Usando PCR em Tempo Real

Para validar os resultados de criação de perfil, 32 tecidos GC frescas e sua gástrica não-tumor emparelhado tecidos foram obtidos do Hospital Renji, afiliado ao Shanghai Jiaotong University School of Medicine. O ARN total foi extraído a partir de 32 pares de amostras emparelhadas GC humanos (incluindo cancro e tecidos cancerosos adjacentes), utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen). A concentração e a pureza do RNA foi medida utilizando Nanodrop ND-2000, e o método de medição de absorção no ultravioleta foi aplicado para detectar a pureza do ARN, apenas aqueles A260 /A280 localizado entre 1,80-2,00, e A260 /A230 > 1,7, foram usadas para a experiência final, caso contrário, o ARN deve ser re-extraiu-se. A transcrição reversa a partir de 3 RNA ug foi feito usingAll-em-OneTM cDNA First-Strand Synthesis Kit (Genecopoeia, Guangzhou, China), de acordo com o protocolo do fabricante. Em breve, a solução preparada reacção de transcrição reversa de ARN foi incubada a 37 ° C durante 60 minutos e terminada a 85 ° C durante 5 minutos, e, em seguida, armazenada a -20 ° C para posterior análise. PCR quantitativo (qPCR) foi realizada utilizando um prisma 7900HT Sistema ABI Sequence Detection (Applied Biosystems, EUA), com SYBR Premix Ex Taq II (Takara). Os iniciadores (miR-21-5p, miR-106b-5p, miR-17-5p, miR-18a-5p, miR-20a-5p e miR-378-5p), incluindo U6 foram obtidos a partir Genecopoeia (Guangzhou, China) . A quantificação foi calculada usando o método 2 -ΔΔCT e é apresentado como padrão normalizado.

Análise Estatística

Os resultados foram analisados ​​usando SAS 9.2 software (SAS Institute Inc. EUA). Os dados são apresentados como médias ± DP. O teste t de Student foi utilizado para comparar valores entre dois grupos independentes.

Resultados

Selecção Literatura e estudar as características

Um total de 104 estudos foram pesquisados ​​no Pubmed utilizando nossa busca estratégia, 73 dos quais foram excluídos após a triagem dos títulos e resumos. 23 estudos foram excluídos depois de ler o texto completo. Apenas oito estudos foram finalmente incluídos nesta revisão sistemática. A selecção estudo detalhado foi mostrado na Figura 1. As características detalhadas de cada estudo são apresentados na Tabela 1.

miARNs expressos diferencialmente

Um total de 223 miARNs expressos diferencialmente foram relatados no oito de microarray estudos (miRNAs diferencialmente expressos em cada estudo foram detalhados na Tabela S1); 124 foram regulados positivamente no GC, e 99 foram reprimidos. Entre os 223 miARNs expressos diferencialmente, 48 foram relatados em pelo menos dois estudos; 39 (81,3%) tinham uma direção consistente e nove (18,7%) tinha uma direção inconsistente de expressão alterada. Entre os primeiros 39, 20 foram regulados positivamente no GC, e 19 foram reprimidos. Três destes miRNAs foram relatados em cinco estudos de microarranjos (miR-21, miR-106b e miR-378), quatro foram relatados em quatro estudos (miR-17, miR-18a, miR-20a e miR-638), e sete foram notificados em três estudos (miR-19a, miR-20b, miR-25, miR-30d, miR-923, miR-375 e miR-148a). Suas localizações cromossômicas, pré-miRNA comprimentos, sequências maduras e os alvos potenciais estão listados nas Tabelas 2-4.

A validação dos miRNAs selecionados em GC Pacientes

Para validar a expressão das seis mais consistentemente relataram miRNAs (miR-21, miR-106b, miR-17, miR-18a, miR-20a e miR-378), a expressão destes miRNAs em biópsias de GC e tecidos não cancerosos adjacentes foram comparados em 32 casos de GC usando PCR em tempo real. Os valores das seis miARNs Ct brutos foram mostrados na Tabela S2.The resultados mostraram que o miR-378 foi regulada negativamente nos tecidos de GC, ao passo que as outras cinco miARNs (MIR-21, o miR-106, miR-17, o miR-18a e miR -20) foram upregulated em GC (Figura 2). Os resultados foram consistentes com os dos estudos de perfil originais. Além disso, exploramos a relação entre a expressão destes miRNAs com as características clínicas e patológicas de GC. Descobrimos que a expressão de miR-21 foi significativamente maior nos casos de casos de GC com tamanhos maiores de tumor (cm), ≥8 pobre diferenciação e metástases com envolvimento ganglionar e doença fase posterior. MiR-106b, miR-17 e níveis de miR-18a foram significativamente maiores no GC pouco diferenciado, casos com envolvimento de gânglios linfáticos, ou doença fase tardia, enquanto os níveis de miR-20a foram significativamente maiores nos casos de GC com envolvimento de gânglios linfáticos. No entanto, não foi encontrada relação entre a expressão de miR-378 e as características clinicopatológicas de GC. Estes resultados estão detalhados na Tabela 5.

Discussão

Mirna estudos de microarranjos fornecer quantidades de informação, mas um inconveniente comum é a falta de coerência entre os diferentes estudos. De acordo com os relatos de Griffith et al. e Chan et al. [16], [17], uma solução lógica para este problema seria a de determinar a consistência entre os diferentes estudos utilizaram diferentes plataformas de microarray. Várias revisões sistemáticas [15] - [17] têm utilizado este método para determinar genes diferencialmente expressos ou miRNAs em vários estados de doença. A aplicação de um método semelhante, observou-se que um total de 48 miARNs expressos diferencialmente foram relatados em pelo menos dois estudos independentes entre oito GC miARN estudos de perfis [7] - [14]. Entre estes, foram relatados 39 miRNAs de ser alterada em uma direção consistente, enquanto os resultados para nove eram inconsistentes. Entre os 39 miRNAs que tiveram mudanças consistentes, 20 miRNAs foram consistentemente regulada no GC em comparação com o tecido gástrico não cancerosos, e 19 foram consistentemente reprimidos no GC. Foram identificados cinco miARNs que foram mais consistentemente upregulated (MIR-21, o miR-106a, miR-17, o miR-18a e miR-20a) e duas mais consistentemente regulados negativamente (miR-378 e miR-638) em, pelo menos, quatro perfis estudos. Então, nós validado estes resultados utilizando PCR em tempo real, que apoiou ainda mais os resultados desta revisão sistemática. Também determinou que a expressão destes miRNAs correlacionadas com as características clinicopatológicas de GC, o que sugeria que estes miRNAs podem ser úteis como biomarcadores para GC

Um dos miR mais consistentemente relataram regulada miRNA em nossa revisão sistemática foi. -21, que alterou expressão e actividade oncogénica em diferentes cancros humanos. Cui et al. [18] demonstraram que a expressão de miR-21 foi significativamente maior em comparação com o tecido GC tecido normal adjacente. A expressão de miR-21 também foi encontrada para ser mais elevada em pacientes com GC com metástases nos linfonodos do que aqueles sem, e também foi significativamente correlacionado com o tipo de tumor histológico e fase pTNM [19], o qual foi validado pelo nosso estudo. Além disso, os níveis de expressão mais elevados de miR-21 previsto pobre sobrevivência em pacientes com GC [19]. Outros estudos revelaram que o miR-21 pode promover a proliferação e invasão do tumor em GC, suprimindo a expressão de PTEN ou PDCD4 [20], [21]. Além disso, estudos anteriores também revelaram actividade oncogénica de miR-21 no câncer colorretal [22], o cancro da mama [23] e câncer de esôfago [24].

miR-106b também foi consistentemente relatado como um miRNA regulada em tecido GC por este e estudos anteriores [14], [25]. A alta expressão de miR-106b tenha sido previamente associado com metástase ganglionar [25], [26], e este foi validado em nosso estudo. Kim et al. [27] descobriram que miR-106b pode exercer a sua actividade oncogénica, suprimindo a expressão da p21 em GC. MiR-106b poderia induzir epitelial-a-mesenquimal de transição (EMT) e um início de tumor fenótipo celular no cancro da mama, visando Smad7 e Six1 e activar sinalização TGF-β [28]. Também pode promover a proliferação celular em carcinoma hepatocelular humano por regulação negativa da expressão de APC [29].

miR-17 tem actividade oncogénica conhecida em seres humanos, e verificou-se ser regulada positivamente em 77,2% de amostras de tecido de CG em comparação com o tecido normal adjacente gástrico. Ela promove a progressão do ciclo celular e inibir a apoptose em GC por segmentação p21 e p53INP1 (proteína nuclear do tumor induzida pela proteína p53 1) [30]. Os níveis circulantes de miR-17 são elevados em pacientes de GC, e a concentração de miR-17 está significativamente associado com a fase de TNM e grau de GC [31]. No entanto, nosso estudo revelou que a expressão de miR-17a foi maior nos casos de GC sem metástases em linfonodos do que aqueles com envolvimento de gânglios linfáticos, o que pode ter sido conseqüência do pequeno tamanho da amostra em nosso estudo. A elevada expressão de miR-17 é significativamente correlacionados com os resultados de sobrevivência pobre [31]. Estudos anteriores também descobriram que miR-17 tem actividade oncogénica no cancro colorectal [32], o cancro da mama [33] e câncer pancreático [34].

miR-18a foi encontrado para ser regulada em quatro estudos nesta revisão sistemática, e é conhecido por ter actividade oncogénica em seres humanos. Wu et al. [35] revelou que a expressão de miR-18a foi significativamente regulada positivamente no tecido GC em comparação com o tecido gástrico normal, e poderia ter como alvo directamente PIAS3 (inibidor da proteína de transdutor de sinal activado e o activador de transcrição 3) e foi positivamente correlacionada com os níveis de Survivina, Bcl-XL e c-myc. Além disso, a regulação positiva de miR-18a foi avaliado no carcinoma da nasofaringe [36], o cancro pancreático [37], o carcinoma hepatocelular [38] e do cancro da mama [39].

Mir-20A é outra miARN com oncogénica actividade, e verificou-se ser regulada positivamente em quatro estudos nesta literatura. Demonstrou-se que o nível de circulação de miR-20a é significativamente elevada em pacientes GC em comparação com controlos saudáveis, e esta está significativamente associado com a fase e do grau do tumor [31], [40]. Nosso estudo também descobriram que miR-20a foi significativamente elevado em tecidos GC e foi significativamente associada com metástase ganglionar. Além disso, a regulação positiva de miR-20a foi previamente encontrado em câncer de colo uterino, câncer de próstata e câncer de ovário, e este miRNA poderiam promover a proliferação celular ou invasão destes cancros [41] - [43].

A mais consistentemente subregulado miRNA nesta revisão sistemática foi miR-378, que foi encontrado para ser reprimidos em cinco estudos. MiR-378 tem sido demonstrado ter actividade anti-oncogénica em seres humanos [44]. A expressão exógena de miR-378 suprime significativamente a proliferação de células GC suprimindo CDK6 e VEGF sinalização [44]. Em nosso estudo, embora encontramos que a expressão de miR-378 foi regulada negativamente em tecidos GC, não foi encontrada relação entre a expressão de miR-378 e as características clinicopatológicas de GC. Isto pode ter sido devido ao pequeno tamanho da amostra deste estudo. Também está relatado que o miR-378 é significativamente regulada negativamente em cancro colo-rectal, e pode desempenhar um importante papel supressor de tumores neste cancro [45]. No entanto, outros estudos concluíram que o miR-378 pode ter actividade oncogénica em outros tipos de cancro [46] - [49]. Portanto, o papel exacto do miR-378 na carcinogênese precisa ser mais bem investigado.

Além disso, também descobrimos que alguns dos miRNAs candidatos identificados em nosso estudo foram slso identificados como biomarcadores séricos em vários cancros. Por exemplo, o soro de miR-21 foi significativamente elevados no soro perioperatória de adenomas e cancro colorrectal (CRC), e era um marcador de prognóstico independente para CRC [50], [51]; Plasma de miR-106, em conjunto com o miR-20a e miR-221 tem o potencial como novos biomarcadores para a detecção precoce do cancro gástrico [40]; Circulantes miR-17 podem utilizado como um novo biomarcador não invasivo para o carcinoma nasofaríngeo [52], o cancro gástrico [53] e CRC [54]; Soro de miR-18a pode ser utilizada como um biomarcador novo no cancro da mama [55], cancro colorrectal [56], o carcinoma hepatocelular [57], e cancro pancreático [58]; Circulating miR-378 pode ser utilizado como um biomarcador em carcinoma de células renais [59] e do cancro gástrico [60]. Esses estudos confirmaram ainda a importância dos miRNAs identificados, e pode expandir o âmbito de aplicação destes miRNAs.

Em conclusão, a nossa análise sistêmica identificou cinco miRNAs regulada (miR-21, miR-106b, miR-17, miR-18a e miR-20a) e um subregulado miRNA (miR-378), que são potenciais novos biomarcadores para GC. Estes miARNs têm sido mostrados como tendo um potencial de diagnóstico e /ou prognóstico para esse cancro e garante mais investigação. Novos estudos que incidem sobre esses miRNAs ajudará a determinar um painel de biomarcadores GC diagnósticos e prognósticos com níveis adequados de sensibilidade e especificidade.

Informações de Apoio
Tabela S1.
diferencialmente expressos miRNAs identificados em cada estudo incluído
doi:. 10.1371 /journal.pone.0073683.s001
(XLS)
Tabela S2. valor
Raw Ct dos miRNAs selecionados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0073683.s002
(XLS)
Tabela S3.
PRISMA Checklist
doi:. 10.1371 /journal.pone.0073683.s003
(DOC)

Reconhecimentos

Agradecemos a senhorita Wei-Feng Qu pelo seu excelente editorial trabalho.

• PLOS ONE: um polimorfismo genético no TOX3 está associado com a sobrevivência de câncer gástrico em um Population
• PLOS ONE: papel potencial do microRNA-21 no diagnóstico de câncer gástrico: A Meta-Analysis