PLOS ONE: Reg IV é um alvo direto de Intestinal transcricional Fator CDX2 na gástrica Cancer

Abstract

REG4
, que codifica a proteína Reg IV, é um membro da lectina dependente de cálcio superfamília potente e activador do receptor do factor de crescimento epidérmico /Akt /activador de proteína-1 via de sinalização. Vários cancros humanos sobre-expressam Reg IV, e expressão Reg IV está associada com o fenótipo de diferenciação intestinal. No entanto, a regulação da REG4
transcrição permanece obscuro. No presente estudo, nós investigamos se CDX2 regula a expressão Reg IV em células de câncer gástrico (CG). Expressão de Reg IV e CDX2 foi analisada por Western blot e reacção inversa quantitativa em cadeia de polimerase em 9 linhas de células de GC e linhas celulares de cancro do cólon 2. A função da região flanqueante 5 'do REG4
gene foi caracterizado pelo ensaio de luciferase. Em 9 linhas de células de GC, endógena Reg IV e expressão CDX2 foram bem correlacionados. Usando uma forma de estrogênio receptor-regulada de CDX2, foi observada rápida indução de expressão Reg IV em células HT-29. Os ensaios de gene repórter revelou um importante papel na transcrição para elementos na região flanqueante 5 'do REG4
gene de consenso de ligação de ADN CDX2. ensaios de imunoprecipitação de cromatina mostrou que CDX2 se liga diretamente para a região de flanqueamento 5 'de REG4
. Estes resultados indicam que a proteína CDX2 regula diretamente a expressão Reg IV

Citation:. Naito Y, Oue N, Hinoi T, Sakamoto N, Sentani K, Ohdan H, et al. (2012) Reg IV é um alvo direto de Intestinal transcricional Fator CDX2 no câncer gástrico. PLoS ONE 7 (11): e47545. doi: 10.1371 /journal.pone.0047545

editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 24 de maio de 2012; Aceito: 12 de setembro de 2012; Publicação: 02 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Naito et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas-in-Aid para a Investigação do Ministério da Educação, Cultura, Ciência, Desporto e Tecnologia do Japão, e, em parte, por um Grant-in-Aid para a Terceira abrangente estratégia de 10 anos de Controle do Câncer e para Cancer Research do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-estar do Japão, e para o Instituto Nacional de Biomedical Inovação (Programa de Promoção de Estudos Fundamentais em Ciências da Saúde). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (GC) é um dos cancros humanos mais comuns no mundo. Cancro desenvolve-se como resultado de várias alterações genéticas e epigenética [1]. Nós previamente realizada análise serial da expressão gênica (SAGE) de quatro GCs primário e identificaram vários genes específicos de GC [2]. Destes genes, regenerar um membro da família derivado de ilhota 4
( REG4
, que codifica a proteína Reg IV) é um gene candidato para a expressão específica do cancro [3]. REG4
é um membro da REG
família de genes, que pertence à superfamília lectina dependente de cálcio. REG4
foi originalmente identificado por análise da sequência de alto rendimento de uma grande biblioteca de ADNc inflamatória doença do intestino [4]. Reg IV é um potente activador do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) /Akt /activador de proteína 1 (AP-1) via de sinalização em células de cancro do cólon e aumenta a expressão de Bcl-2, Bcl-XL e a survivina, que são proteínas associada com a inibição da apoptose [5]. Amplificação do gene REG4
tem sido relatada em câncer pancreático [6]. Reg IV tem sido identificada como um dos genes supra-regulados em células cancerosas de iniciação [7]. Nós já examinado o efeito da expressão forçada de Reg IV na linha de células de GC. Mostrámos que Reg IV inibe a 5-fluorouracil (5-FU) a apoptose induzida através da activação do EGFR em células de GC [8]. Em contraste, as células Reg IV-sobre-expressam não mostraram diferenças significativas na proliferação e atividade de invasão em comparação com células transfectadas com vector vazio [8]. Estes resultados suportam a noção de que a proteína Reg IV participa na carcinogênese gástrica

GC pode ser subdividido em quatro fenótipos de acordo com a expressão de mucina:. Fenótipo gástrica ou foveolar; fenótipo intestinal; fenótipo misto intestinal e gástrica; e nem fenótipo gástrica nem intestinal [9]. alterações genéticas distintas parecem estar associados com GC fenótipo gástrico e intestinal [10]. Em nossas observações anteriores, Reg IV foi expresso em 30% dos casos de GC e estava correlacionada com o fenótipo intestinal [11]. Um número de análises imuno-histoquímicas de Reg IV têm sido relatados em cancros humanos [11] - [20]. Em geral, estas análises relatado que Reg IV é expressa em células de adenocarcinoma exibindo um fenótipo intestinal. Tem sido relatado que a expressão Reg IV é induzida por GLI1, que é um factor de transcrição essencial na via de sinalização Hedgehog [21], ou por factores de crescimento tais como EGF, factor de crescimento transformante-α (TGF-α), factor de crescimento de hepatócitos (HGF), ou factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) [22]. No entanto, estas moléculas não são susceptíveis de ter em conta a associação entre a expressão Reg IV e diferenciação fenótipo intestinal.

Temos anteriormente descobriu que a expressão de Reg IV foi correlacionada com a expressão do CDX2 [11]. CDX2 é um factor de mamífero relacionado com o caudal intestinal transcrição e importante para a manutenção das células epiteliais intestinais [23], [24]. Várias linhas de evidência sugerem que a metaplasia intestinal do estômago e GC fenótipo intestinal estão associados com a expressão ectópica CDX2 [9], [25]. No presente estudo, nós investigamos se CDX2 regula a expressão Reg IV em GC e descobriu que CDX2 liga-se diretamente para a região flanqueante 5 'de gene REG4
e melhora a atividade do promotor.

Resultados

Reg IV e expressão CDX2 são correlacionados em células GC

O primeiro investigados indução da expressão Reg IV por CDX2 em linhas de células de GC. A análise de Western blot de CDX2 em 9 linhas de células de GC revelou que nenhum ou expressão de baixo nível de CDX2 foi detectada em MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, e KATO-III (Fig. 1A). Para determinar se CDX2 e expressão Reg IV estavam fortemente correlacionados em células GC, Western blot e reação em cadeia de polimerase reversa quantitativa (qRT-PCR) analisa de Reg IV foram realizadas em linhas de células 9 GC. Como mostrado na Fig. 1A, a expressão da proteína Reg IV foi detectada apenas nas 3 linhas de células com níveis elevados de transcritos de REG4
medidos por qRT-PCR. Dos cinco linhas celulares que expressaram a proteína GC CDX2, 2 linhas de células (MKN-1 e MKN-28) não tinham expressão detectável de REG4
transcritos e proteína. As linhas de células com a expressão da proteína CDX2 indetectável (MKN-7, TMK-1, HSC-44PE e KATO-III) não mostraram REG4
transcrições ou proteína (Fig. 1A).

em seguida, foi gerada uma população policlonal de MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, e células KATO-III expressando níveis elevados de CDX2 por infecção das células com retrovírus de replicação deficiente que transportam um de comprimento completo de ADNc CDX2 humano porque ou nenhuma expressão de baixo nível de CDX2 foi detectado nestas linhas celulares. No entanto, a sobre-expressão de CDX2 não conseguiram activar a expressão Reg IV por Western blot (dados não mostrados). Porque é possível que CDX2 por si só não é suficiente para a activação da expressão Reg IV, expressão de CDH17
(que codifica a proteína LI-caderina), que é um dos objectivos da CDX2 [24], foi também investigado. No entanto, a activação da expressão de LI-caderina não foi encontrado no MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, e KATO-III as células que expressam altos níveis de CDX2 (dados não mostrados). Uma vez que mostrou activação da expressão de LI-caderina por CDX2 na linha celular de cancro do cólon HT-29 [24], a indução da expressão Reg IV foi investigada da mesma linha de células. Como mostrado na Fig. 1B, a indução da expressão Reg IV foi detectada em células HT-29 infectadas com retrovírus transportando um ADNc CDX2 humana de comprimento completo. Nós também gerou uma população policlonal de SW480 (linha celular de cancro do cólon), as células que expressam níveis elevados de CDX2 por infecção das células com retrovírus de replicação deficiente que transportam um ADNc CDX2 humana de comprimento completo. Como mostrado na Fig. 1B, a indução da expressão Reg IV foi encontrado em células SW480 infectadas com retrovírus transportando um ADNc CDX2 humana de comprimento completo. Estes resultados sugerem que a expressão Reg IV pode ser induzida por CDX2 em linhas celulares derivadas de cancro do cólon. Porque na metaplasia intestinal do estômago, CDX2 e expressão Reg IV estão bem correlacionados [11], a utilização de uma linha celular de cancro do cólon pode ser adequado para o modelo de metaplasia intestinal.

Para avaliar melhor a relação entre CDX2 e expressão Reg IV, estudamos a expressão Reg IV em uma linha de HT-29 derivada com a atividade CDX2 estreitamente regulada. Nós usamos uma linha celular HT-29 policlonal que tinham sido transduzidas com o vector pCDX2-ER. O vector pCDX2-ER codifica uma proteína quimérica em que as sequências de comprimento completo Cdx2 está fundida a montante de um mutante receptor de estrogénio (ER) de domínio de ligação ao ligando. O domínio de ligação do ligando do ER mutante não se liga estrogénio, mas retém a capacidade de ligar o tamoxifeno. O tratamento da linha de células /CDX2-ER-29 HT com 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) resultou em forte indução da expressão da proteína Reg IV no prazo de 48 horas (Fig. 1C). Estes resultados indicam que Reg IV é um gene alvo directo ou primária regulada por CDX2. No entanto, CDX2 por si só não é suficiente para a activação da expressão Reg IV.

A inibição da CDX2 por interferência de RNA (RNAi) resulta na Down-regulação do Reg IV em células GC

Para determinar se CDX2 é necessária para a expressão Reg IV em células de GC, foi analisado o efeito de inibição da expressão do CDX2 por ARNi do nível de expressão Reg IV na linha de células HSC-39 porque a alta CDX2 endógena e expressão Reg IV foi detectada na linha de células HSC-39. pequenos RNAs específicos de Cdx2 interferentes (siRNAs) expressão da proteína CDX2 suprimiu significativamente a 3 dias após a transfecção e expressão de Reg IV transcrição foi regulada para baixo cerca de 50% por CDX2 ARNic em HSC-39 em comparação com os seus níveis em células tratadas com ARNsi de controlo ( A Fig. 1D). Estes resultados indicam que CDX2 está envolvido na manutenção expressão do gene Reg IV.

Caracterização funcional do flanqueante 5 'Região de REG4
Gene pelo ensaio de luciferase

Para identificar o potencial CDX2 liga�o ao locais no região promotora REG4
, uma pesquisa das sequências genómicas imediatamente 5 'para o local de início da transcrição presuntivo foi realizado, utilizando um elemento de ligação para o frango CDXA consenso caudal
homólogo (5'-a, a /T, T, a /T, a, T, a /G-3 ') [26] e um algoritmo de busca previamente descrito [27]. Encontramos quatro sítios de ligação putativos Cdx2 no 2 quilobases (kb) flanqueante 5 'região do REG4
gene (Fig. 2A). Estes foram: local A (5'-AATAATA-3 ', -1.828--1.834), o site B (5'-CTTTACAG-3', a partir de -901 a -908), o site C (5'-3-TTTTATGG ', de -114 a -121), o site D (5'-AATAATA -3', a partir de -90 a -96). Para avaliar o papel destes sítios de ligação Cdx2 presuntivos na regulação da REG4
transcrição, várias construções de gene repórter foram gerados. Como mostrado na Fig. 2B, construções de gene repórter contendo 2,1, 1,2, ou 0,6 kb de 5'-flanqueando sequência do REG4
gene mostrou forte atividade nas células HSC-39, que exibem forte expressão endógena de REG4
transcrições e proteínas. Por comparação, as células MKN-1 têm pouco endógena REG4
transcrição e demonstrou pouca ou nenhuma actividade de transcrição induzida pelos 2.1, 1.2, ou 0,6 kb REG4
construções de gene repórter (dados não mostrados) . A actividade REG4
construções de gene repórter contendo pares de bases -116 a +58 e -87 a 58 tinha reduzido nas células HSC-39 (Fig. 2B), indicando que as sequências entre os pares de bases -634 e - 116 desempenhar um papel fundamental na ativação REG4
transcrição. Além disso, analisou-se mutações únicas e múltiplas nos sítios de ligação de Cdx2 presuntivos na região flanqueante 5 'do REG4
génica utilizando células HSC-39 (Fig. 2C). Como esperado, o presumível sítio de ligação CDX2 C, que está localizado entre pares de bases -634 e -116, desempenha um papel crucial na ativação REG4
transcrição.

CDX2 liga-se diretamente ao 5 ' -flanking região de REG4
Gene

para analisar se CDX2 se liga diretamente aos locais de ligação Cdx2 putativos no REG4 região
flanqueante 5 ', foi realizada imunoprecipitação da cromatina (chip) ensaios utilizando células HSC-39. Usando 6 primers para o REG4
flanqueante 5 'região (Fig. 3A), que recuperou fragmentos de DNA contendo o REG4
flanqueante 5' região de iniciador 1, que engloba CDX2- presuntivo local de ligação C (Fig. 3B). fragmentos de DNA da região de flanco 5 'de REG4
, que foram gerados utilizando iniciadores 2, 3, 4, 5 e 6 de tal forma que eles não contêm sítios de ligação CDX2 presumíveis, não foram recuperados pelo anti- anticorpo CDX2. A especificidade da recuperação do REG4 e região promotora seguinte chip com o anticorpo anti-CDX2 foi demonstrado pelo fato de que outros fragmentos de DNA irrelevante falta sítios de ligação Cdx2 (por exemplo, exão 3 do CDX1
gene) não foram recuperadas (Fig. 3B). Além disso, imunoprecipitação simulada (IgG de rato) produziu alguns REG4
ou CDX1
fragmentos de DNA espec�icos (Fig. 3B). Todas estas descobertas sugerem que CDX2 ativa REG4
transcrição por diretamente ligação a sequências na região flanqueante 5 'do gene.

trimethylation de histona H3 lisina 27 (H3K27me3) no REG4
Promotor na GC linhas celulares

Embora a expressão da proteína CDX2 foi encontrado em MKN-1 e linhas de células MKN-28, estas linhas celulares 2 faltava expressão detectável de REG4
transcrição e proteína. Uma vez que foi reportado que a hipermetilação do ADN de ilhas de CpG está associada com silenciamento de vários genes [28], investigamos se a metilação do DNA induzida inactivação transcricional de Reg IV em MKN-1 e células MKN-28. Nós tratada essas células com um agente de desmetilação, 5-aza-2'-desoxicitidina (AZA-dC) e, em seguida, realizada qRT-PCR. No entanto, a expressão Reg IV não foi restaurada nestes linhas de células (dados não apresentados), sugerindo que a metilação do DNA não é susceptível de afectar a expressão Reg IV. Foi também relatado que H3K27me3 tem sido associado com a expressão do gene reprimida [29]. Nós investigado H3K27me3 em linhas de células de GC. Para determinar o enriquecimento de H3K27me3 no REG4
promotor nas linhas celulares de GC, foram realizados ensaios de chip. Em MKN-1 e MKN-28 linhas celulares, os níveis H3K27me3 no REG4 e região promotora foram elevados, enquanto que na linha de células HSC-39, o nível H3K27me3 no REG4 e região promotora foi baixa (Fig. 3C). Estes resultados sugerem que a estrutura da cromatina fechado de REG4
promotor pode inibir a expressão Reg IV por CDX2.

Discussão

Embora tenha sido relatado que a expressão Reg IV é induzida por GLI1 [21] ou de EGF [22], estas moléculas não são susceptíveis de ter em conta a associação entre Reg IV e diferenciação intestinal. No presente estudo, mostramos que CDX2 endógena e expressão Reg IV foram bem correlacionados em linhas celulares de GC. Além disso, usando uma forma regulada-ER de CDX2, descobrimos que houve rápida indução de expressão Reg IV após o tratamento 4-OHT. Os ensaios de gene repórter revelou um papel importante para os elementos em região promotora REG4
de ligação de consenso de ADN CDX2 na sua transcrição. ensaios ChIP posteriores mostraram que CDX2 se liga diretamente ao REG4
promotor. Anteriormente mostrou que o tecido em GC primária e a metaplasia intestinal do estômago, CDX2 e expressão Reg IV foram bem correlacionados [11]. Estes resultados indicam que a proteína CDX2 regula directamente a expressão Reg IV em GC e a metaplasia intestinal do estômago.

CDX2 é sobre-expresso em GC fenótipo intestinal e na metaplasia intestinal do estômago [9], [25]. Em contraste, foi observada perda de expressão do CDX2 num subconjunto de cancros colorectais primários, cancros colorretais geralmente em pouco diferenciados [30]. O significado da alteração da expressão do CDX2 em cancros humanos permanece pouco clara, e, por conseguinte, é importante para definir genes alvo que estão a jusante do CDX2. Nós identificamos vários genes regulados por Cdx2 tais como CDH17
(que codifica LI-caderina) [24], HEPH
(que codifica hephaestin) [31], ABCB1
(que codifica a resistência a múltiplos fármacos 1) [32], e DSC2
(que codifica desmocolina 2) [33]. Entre estes genes, ABCB1
foi originalmente identificado como um gene sobre-expresso e amplificado em células resistentes a fármacos múltiplos, e o seu produto, a P-glicoproteína, parece desempenhar um papel crítico na resistência a drogas [34]. Anteriormente, relatou que a expressão forçada de Reg IV em células GC inibiu a apoptose induzida por 5-FU por meio da indução de Bcl-2 e da di-hidropirimidina desidrogenase [8]. Tomados em conjunto, é possível que em GC intestinal fenótipo, a expressão (ou expressão ectópica) de CDX2 induz Reg IV e uma resistência a múltiplas drogas expressão, o que resulta em um aumento na resistência aos medicamentos. Na verdade, tem sido relatado que a quimioterapia pós-operatória não é benéfico para pacientes com fenótipo intestinal GC [35].

Embora nossos dados suportam a ideia de que CDX2 desempenha um papel na regulação da REG4
transcrição através da ligação à região promotora, várias descobertas indicam que CDX2 por si só não é suficiente para a activação expressão REG4
. No presente estudo, foi gerada uma população policlonal de MKN-7, TMK-1, HSC-44PE e KATO-III células que expressam níveis elevados de CDX2 por infecção com retrovírus que transportam um cDNA CDX2 humana de corpo inteiro. No entanto, a sobre-expressão de CDX2 não conseguiram activar a expressão Reg IV. Em linhas celulares de GC, nenhuma das linhas de células com a expressão da proteína CDX2 indetectáveis ​​tiveram detectáveis ​​ REG4
transcritos e proteínas. Portanto, CDX2 é necessária para a expressão Reg IV, mas CDX2 por si só não é suficiente para a activação da expressão Reg IV. No presente estudo, nove linhas celulares de GC foram estudados. As origens das linhas de células eram as seguintes. As linhas celulares MKN-74 MKN-7, MKN-28, e foram estabelecidas a partir de tipo intestinal GC. As linhas celulares TMK-1 e MKN-45 foram estabelecidos a partir tipo difuso GC. O KATO-III, HSC-39, e HSC-44PE linhas celulares foram estabelecidas a partir de carcinoma de células anel de sinete. A linha celular MKN-1 foi estabelecida a partir de células de carcinoma adenoescamoso. Porque na metaplasia intestinal do estômago, CDX2 e expressão Reg IV estão bem correlacionados, linhas de células estabelecidas a partir de GC GC tipo difuso ou carcinoma de células anel de sinete pode não ser adequado para a análise de indução Reg IV por CDX2. De facto, a expressão Reg IV pode ser induzida por CDX2 em linhas celulares derivadas de cancro do cólon no presente estudo. Além disso, mostrámos que os níveis H3K27me3 na região do promotor de REG4
eram elevados em linhas celulares MKN-1 e MKN-28 GC. Estas linhas celulares 2 faltava expressão detectável de REG4
embora a expressão da proteína CDX2 foi encontrado. Portanto, os níveis H3K27me3 no REG4 e região promotor pode ser elevado em MKN-7, TMK-1, HSC-44PE e KATO-III células, em que a sobre-expressão de CDX2 não conseguiu ativar a expressão Reg IV.

tem sido relatado que REG4
expressão de ARNm foi melhorada por estimulação com TGF-α, EGF, HGF, bFGF ou através da activação da proteína quinase activada por mitogénio (MAPK) [22] . Assim, pode-se supor que Reg IV também é regulado por fatores de transcrição a jusante de vias de MAPK. Realizamos in silico
análises da REG4
gene região flanqueante 5 ', e encontrou pelo menos uma presumíveis sequências de consenso AP-1 (em -883 pares de bases de REG4
gene da região), que é um factor de transcrição a jusante de sinalização MAPK flanqueante 5 '. No presente estudo, as células HSC-39 mostraram actividade de transcrição semelhante de construções de gene repórter contendo 1,2 kb e 0,6 kb de sequência REG4
flanqueante 5 '. Como o efeito do EGF ou TGF-α no REG4
transcrição não foi investigada no presente estudo, mais estudos são necessários para esclarecer os mecanismos de sinalização que induzem a regulação da REG4
transcrição.

Em conclusão, os dados presentes mostram que a proteína CDX2 regula diretamente a expressão Reg IV. Reg IV activa a via de sinalização de EGFR /Akt /AP-1. Como intestinal GC fenótipo manifesta frequentemente EGFR [36], sugere-se que esta via Reg IV-activado desempenha um papel importante neste subtipo de GC. Porque CDX2 também induz a expressão do gene de resistência a múltiplos fármacos, ABCB1
, a terapia anti-EGFR, mas não a quimioterapia pode ser benéfica para pacientes com GC fenótipo intestinal.

Materiais e Métodos

os plasmídeos

o ADNc CDX2 foi inserido no local de clonagem múltiplo do vector de expressão retroviral PPG-CMV-CITE-neo, como descrito anteriormente [24]. A de comprimento completo, o cDNA CDX2 do tipo selvagem também foi subclonado no vector retroviral pBabe-Puro ER, tal como descrito anteriormente para gerar pCDX2-ER [24]. O vector pCDX2-ER codifica uma proteína quimérica em que as sequências de comprimento completo Cdx2 está fundida a montante de um domínio de ligação ao ligando do ER mutado. O domínio de ligação do ligando do ER mutante não se liga estrogénio, mas retém a capacidade de ligar o tamoxifeno. As sequências de ADN genómico a partir da região flanqueante 5 'do humano REG4
genes foram amplificados por PCR utilizando ADN genómico purificado a partir de células HSC-39 como um modelo e subclonado no [luc2] pGL4.10 vector (Promega , Madison, WI). abordagens baseadas em PCR foram utilizados para introduzir mutações nos locais de ligação Cdx2 presuntivos na construção de gene repórter utilizando pGL4.10-REG4 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Quatro sítios de ligação Cdx2 putativos foram alteradas. Todos os fragmentos gerados por PCR foram verificadas por sequenciação automática. O vector plasmídeo pGL4.74 [hRluc /TK] (Promega) foi usado como um controle para a eficiência de transfecção em ensaios de repórter.

linhas celulares, infecções por retrovírus, e tratamento da droga

O Phoenix anfotr�ico A linha celular de empacotamento foi fornecido por G. Nolan (Stanford University, Stanford, CA) [37]. Foram utilizados nove linhas celulares derivadas de CG humana e 2 linhas celulares derivadas de cancro do cólon humano. A linha de células TMK-1 foi estabelecido no nosso laboratório [38]. As linhas de células HSC-39 e HSC-44PE foram estabelecidas por um dos autores (Kazuyoshi Yanagihara) [39], [40]. Cinco linhas celulares de GC da série MKN foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Toshimitsu Suzuki [41], [42]. A linha celular KATO-III foi gentilmente cedido pelo Dr. Morimasa Sekiguchi [43]. As linhas celulares de cancro do cólon HT-29 e SW480 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection. As células foram guardadas em azoto líquido até ao início deste estudo. Depois de descongelar a partir de lote congelado, as células foram mantidas em passagem baixa ao longo do estudo. Consistente morfologia celular foi monitorizada por comparação de imagens microscópicas. As células de empacotamento Phoenix foram transfectadas com construções de expressão retrovirais (PPG-Cdx2, PPG-neo, e pCDX2-ER) e o sobrenadante contendo vírus anfotrópico nonreplicating foi colhido como descrito anteriormente [24]. Em células HT-29 que expressam a proteína de fusão CDX2-ER (HT-29 /CDX2-ER), função CDX2 foi activada pela adição de 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) (Sigma Chemical, St. Louis, MO) para o crescimento meio a uma concentração final de 500 nmol. Para investigar se a metilação do DNA induzida inactivação transcricional de Reg IV, as células foram tratadas com uma concentração final de 1 uM Aza-dC (Sigma Chemical) durante 5 dias antes de serem colhidas para extracção de RNA.

Western Blot Análise

Para a análise de transferência de Western, as células foram lisadas, como descrito anteriormente [44]. As concentrações de proteína foram determinadas pelo ensaio de proteína de Bradford (BioRad, Richmond, CA) com BSA usado como o padrão. Os lisados ​​(20 ug) foram solubilizados em tampão de amostra de Laemmli a ferver e por, em seguida, submetido a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida a 12%, seguido de electro-transferência para um filtro de nitrocelulose. O filtro foi incubado durante 1 hora à temperatura ambiente com um anticorpo anti-Reg IV (anticorpo policlonal de coelho desenvolvido no nosso laboratório, Ref. 10) ou anticorpo anti-CDX2 (BioGenex, San Ramon, CA). anti-coelho conjugada com peroxidase ou anti-IgG de ratinho foi usado na reacção secundária. Os imunocomplexos foram visualizados com um Além disso sistema ECL Western Blot de detecção (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). β-actina (Sigma Chemical) também foi detectado como um controlo de carga.

Análise qRT-PCR

O ARN total foi extraído com uma RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA), e 1 ug de ARN total foi convertido em ADNc com um kit de primeira cadeia de cDNA Synthesis (Amersham Biosciences). A quantificação de REG4
níveis de ARNm foi efectuada por detecção de fluorescência em tempo real como descrito anteriormente [45]. A PCR foi realizada com um kit de SYBR Green PCR Reagentes núcleo (Applied Biosystems, Foster City, CA). a detecção em tempo real da intensidade de emissão de SYBR verde ligado ao DNA de cadeia dupla foi realizada com um ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems), como descrito anteriormente [46]. ACTB
produtos de PCR foram amplificados a partir espec�icos as mesmas amostras de ARN e serviu como um controlo interno. As sequências de iniciadores para REG4
qRT-PCR estão apresentados na Tabela 1. qRT-PCR foram realizadas em triplicado para cada conjunto de amostras de iniciadores, e a média e o desvio padrão (DP) de três experiências foi calculado como a valor quantificação relativa. Ao fim de 40 ciclos de PCR, produtos de reacção foram separados por electroforese em géis de poliacrilamida desnaturantes não 8% para confirmação visual de produtos de PCR.

ARNi

Para o knockdown CDX2 endógena, ARNi foi realizada . Dois ARNic em cadeia dupla de segmentação CDX2 (5'-AACCAGGACGAAAGACAAAUA-3 ', CDX2 siRNA1; e 5'-AAGCCUCAGUGUCUGGCUCUG-3', CDX2 siRNA2) e um duplex de siRNA nonsilencing (5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ') foram sintetizados (Qiagen). A transfecção foi efectuada utilizando Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, 60 pmol de siRNA e 10 ul de Lipofectamina RNAiMAX foram misturados em 1 mL de meio RPMI (10 nmol /L de concentração final de siRNA). Após 20 min de incubação, a mistura foi adicionada às células e estas foram plaqueadas em placas para cada ensaio. Três dias após a transfecção, as células foram analisadas para todos os experimentos.

Os ensaios de gene repórter

HSC-39 e MKN-1 As células foram semeadas em placas de 6 poços (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ ). A transfecção de células em 50% -80% de confluência foi realizada com 3 mL de FuGENE6 Transfection Reagent (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), 0,8 pg de construções de gene repórter pGL4.10, e 0,2 ug pGL4.74 [hRluc /TK] vetor (Promega). Às 48 horas após a transfecção, as células foram recolhidas e ressuspensas em tampão de lise passiva (Promega). A actividade da luciferase foi determinada com um sistema de ensaio dupla luciferase (GloMax 96 microplacas Luminómetro, Promega).

Chip Ensaios

Os ensaios ChIP foram realizados usando o EZ-chip Cromatina imunoprecipitação Kit (Millipore, Billerica , MA) por instruções de fabricação. Para analisar se CDX2 se liga directamente aos locais de ligação de Cdx2 putativos na região REG4
flanqueante 5 ', foram realizados ensaios de chip, utilizando células HSC-39. Em resumo, as células HSC-39 (1-2 × 10 ^{7) foram ligados cruzada com 1% de formaldeído em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 15 min a 37 ° C, e a glicina foi adicionada para extinguir aldeídos reactivos. Depois de lavar as células com PBS frio, as células foram ressuspensas em tampão de lise de SDS (SDS a 1%, EDTA a 10 mM e Tris 50 mM, pH 8,1) com Proteinase Inhibitor (Roche Diagnostics). Depois as amostras foram sonicadas, extractos que contêm fragmentos de DNA de cromatina (tamanho médio, 500 pares de bases) foram imunoprecipitadas utilizando o anticorpo monoclonal 2 ug de anti-CDX2 (BioGenex) ou 2 ug IgG de ratinho (Millipore). Cada amostra de ADN imunoprecipitado foi quantificada por qPCR utilizando os iniciadores listados na Tabela 1. Como um controlo negativo, um de aproximadamente 200 pares de bases do fragmento de ADN a partir do exão 3 de CDX1
gene foi amplificado por PCR utilizando iniciadores específicos (Tabela 1 ).}

Para determinar o enriquecimento de H3K27me3 no REG4
promotor nas linhas de células de GC, ensaios ChIP foram realizadas utilizando MKN-1, MKN-28, e linhas de células HSC-39. Em células breves, GC (1-2 × 10 ^{7) foram ligados cruzada com 1% de formaldeído em PBS durante 15 min a 37 ° C, e a glicina foi adicionada para extinguir aldeídos reactivos. Depois de as células com PBS frio lavagem, as células foram ressuspensas em tampão de lise de SDS com Proteinase Inhibitor (Roche Diagnostics). Depois as amostras foram sonicadas, extractos que contêm fragmentos de DNA de cromatina (tamanho médio, 500 pares de bases) foram imunoprecipitados utilizando 2 ug de anticorpo policlonal anti-H3K27me3 (Abcam, Cambridge, MA) ou 2 ug de IgG de coelho (Millipore). Cada amostra de ADN imunoprecipitado foi quantificada por qPCR utilizando REG4
Primer 1 (Tabela 1).}

qPCRs foram realizadas em triplicata para cada conjunto de amostras primer, e a média eo desvio padrão (DP) de as três experiências foi calculado como o valor de quantificação relativa. No fim de 40 ciclos de PCR, produtos de reacção foram separados por electroforese em géis de poliacrilamida desnaturantes não de 8% para confirmação visual de produtos de PCR.

Reconhecimentos

Agradecemos Sr. Shinichi Norimura para excelente assistência técnica e aconselhamento. Este trabalho foi realizado com o tipo de cooperação do Centro de Pesquisa de Medicina Molecular, Faculdade de Medicina, Universidade de Hiroshima. Agradecemos ao Centro de Análise de Ciências da Vida, Universidade de Hiroshima, para o uso de suas instalações.

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