PLOS ONE: A apoptose efeito da inibição HIF-1α Combinado com glicose mais Tratamento de insulina sobre o Câncer Gástrico sob condições de hipóxia

Abstract

O câncer gástrico cresce em um ambiente hipóxico. HIF-1α é conhecida por desempenhar um papel importante no controle da produção de espécies de oxigénio reactivas (ROS) na mitocôndria sob condições hipóxicas. Anteriormente, as células de HIF-1a knockdown (KD) e células de controlo (SC) estabelecida na linha celular de cancro gástrico 58As9. Neste estudo, que revelou que as células kD, mas não células SC, a apoptose induzida sob condições de hipoxia (1% O _{2), devido à produção excessiva de ROS. Uma análise quantitativa RT-PCR demonstrou que as expressões de dez genes, que estão envolvidos nos mecanismos de controlo de ROS (incluindo o efeito Warburg, mitophagy, cadeia de transporte de elétrons [ETC] modificação e ROS limpeza), foram regulamentadas pelo HIF-1α. Além disso, a promoção da absorção de glucose por insulina de glicose mais tratamento (GI) aumentou o efeito apoptótico, que foi acompanhada por uma maior produção de ROS em células hipóxicas KD. Uma análise Western blot mostrou que a expressão membranosa de GLUT1 em células KD foi elevada por glicose e /ou tratamentos de insulina, indicando que a captação de glicose induzida por GI é mediada pelo aumento da translocação de GLUT1 sobre a membrana celular. Finalmente, o efeito anti-tumoral de knockdown HIF-1α (KD) mais GI foi avaliada utilizando um modelo de xenoenxerto de tumor, em que um ambiente hipóxico existe naturalmente. Como resultado, o tratamento GI inibiu fortemente o crescimento dos tumores de KD por meio de que a apoptose de células foi altamente induzida em comparação com o tratamento controlo. Em contraste, o crescimento dos tumores SC expressam HIF-1α não foi afectada pelo tratamento GI. Tomados em conjunto, os resultados sugerem que a inibição HIF-1α mais GI pode ser uma terapia ideal, porque a apoptose devido à destruição de ROS homeostase é especificamente induzida em cancro gástrico que cresce sob um ambiente hipóxico, mas não no tecido normal sob o condições aeróbicas}

Citation:. Tanaka T, Kitajima Y, Miyake S, Yanagihara K, Hara H, Nishijima-Matsunobu A, et al. (2015) A apoptose efeito da inibição HIF-1α Combinado com glicose mais Tratamento de insulina sobre o Câncer Gástrico sob condições de hipóxia. PLoS ONE 10 (9): e0137257. doi: 10.1371 /journal.pone.0137257

editor: Ester Hammond, da Universidade de Oxford, Reino Unido

Recebido: 30 de abril, 2015; Aceito: 13 de agosto de 2015; Publicação: 04 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Tanaka et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

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Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O ambiente hipóxico é substancial em tumores sólidos, onde ele acelera seus comportamentos malignas [1-4]. Tal como outros tumores sólidos, o carcinoma gástrico é conhecido envolver extensas áreas de hipoxia no interior do tumor [5-7]. condições de hipóxia induzir vários eventos biológicos, tais como a angiogênese, invasão local, a propagação metastática, radioterapia ou chemoresistance e metabolismo energético alterada em muitos carcinomas, levando a um mau prognóstico em pacientes [2-4].

O fator de transcrição hipoxia-inducible factor 1 (HIF-1) é o principal mediador da adaptação à hipoxia celular [8-10]. HIF-1 é uma proteína heterodimérica que consiste numa subunidade β constitutivamente expresso (HIF-1β) e um α indutível por hipoxia (HIF-1α) subunidade [8-10]. A subunidade HIF-1α é degradada pela via da ubiquitina-proteassoma sob condições de normóxia. Em contraste, em condições de hipoxia, HIF-1α é estabilizada e dimeriza com HIF-1β interagindo com CBP /p300, que, em seguida, liga-se ao elemento de resposta de hipoxia (HRE) na região promotora de centenas de genes alvo [11-16]. Estes relatórios anteriores levaram ao reconhecimento de HIF-1α como um regulador central na patogênese do câncer sólido

espécies reactivas de oxigénio (ROS), como o ânion superóxido (O _{2 ^{. - ), peróxido de hidrogénio (H 2O 2), e radical hidroxilo (HO •), consistem em espécies de radicais e não-radicais de oxigénio formados pela redução parcial do oxigénio. Intracelular ROS são gerados principalmente na mitocôndria por fosforilação oxidativa (FOX), um processo realizado pela cadeia de transporte de electrões (ETC) [17]. Quando ROS sobrecarregar o sistema de defesa antioxidante celular, ocorre o estresse oxidativo. estresse oxidativo excessivo faz com que o dano ROS-mediada de ácidos nucleicos, proteínas e lipidos e leva à morte das células [17, 18].}}

HIF-1α foi reportado para controlar a produção de ROS em condições hipóxicas através de múltiplos mecanismos incluindo a conversão do metabolismo energético a partir OXPHOS a glicólise, que é referido como o efeito Warburg [19-23], a indução de autofagia mitocondrial selectiva (designado como mitophagy) [24, 25], ETC modificação por um interruptor de subunidade em citocromo c oxidase (COX) [26] e captadores de ERO [27]. Na via metabólica do efeito Warburg, HIF-1α primeiro activa a transcrição da GLUT1
para aumentar a captação de glicose nas células. A glicose é metabolizada em piruvato pela acção dos membros de enzimas glicolíticas, os quais são conhecidos para alvos HIF-1α [28, 29]. Em condições aeróbicas, o piruvato é convertido em acetil-CoA (AcCoA) pela desidrogenase de piruvato (PDH) para a entrada no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). Por outro lado, em células cancerosas expostas a hipoxia, piruvato é desviado para longe da mitocôndrias, em que o HIF-1α regula positivamente a expressão de PDK1 para inibir a actividade da PDH. Em seguida, LDHA alternativamente converte piruvato em lactato e MCT4 transporta o lactato para fora da célula. Estes genes, também são regulados por HIF-1α [16, 30, 31]. Hipóxia induz mitophagy para evitar a produção de ROS excessiva pelo qual as mitocôndrias danificadas são eliminadas através de digestão lisossomal [24, 25]. Estudos recentes têm demonstrado que o HIF-1α ativa as transcrições dos genes que codificam BNIP3 e BNIP3L, fatores essenciais no processo mitophagy [32]. Outro estudo relatou que o HIF-1α regula a comutação subunidade COX4 através da activação da transcrição dos genes relacionados com a ETC COX4-2 e LON, uma protease mitocondrial que é necessário para a degradação COX4-1 sob hipoxia [26]. O interruptor de subunidade COX4 foi reportado como um passo importante na homeostase de ROS, devido ao seu papel na optimização da eficiência da respiração sob hipoxia [26]. A MnSOD é conhecido eliminador de ROS para converter os radicais superóxido em peróxido de hidrogénio. Um estudo anterior tenha relatado que MnSOD é regulada positivamente em condições de hipoxia, embora se esta regulação positiva é mediada por HIF-1α ainda não foi demonstrado [27]. Recentemente, um outro relatório demonstrou a descoberta interessante que os fibroblastos embrionários (MEFs) de ratinhos HIF-1α-nulo hipóxico morreu devido a excesso de produção de ROS, enquanto que as MEFs foram resgatados por tratamento com o antioxidante N acetil-L-cisteína (NAC) [ ,,,0],33]. Tomados em conjunto, estes relatórios indicam que HIF-1α desempenha um papel central na organização da produção de ROS mitocondrial em células vivas sob hipóxia.

Neste estudo, o objetivo foi estabelecer um modelo terapêutico demonstrando que a apoptose induzida por hipóxia via a produção excessiva de ROS pode ser introduzido nas células gástricas cancerosas deficientes em HIF-1α. Inicialmente determinado se a hipoxia induz a morte celular pela produção excessiva de ROS no knockdown de HIF-1α (KD) células. Em seguida, nós dirigida a hipótese de que a introdução de níveis elevados de glucose pelo tratamento de células com KD insulina pode aumentar o efeito apoptótico. Finalmente, utilizando um modelo de xenoenxerto de tumor, foi proposto que a inibição de HIF-1α combinado com o tratamento de glucose e insulina (GI) podem ser uma terapia potencial para o cancro gástrico.

cultura celular Materiais e Métodos
condições e reagentes

a linha de células de câncer gástrico 58As9 foi gentilmente cedido pelo Dr. K. Yanagihara (cancer Center National Hospital Leste, Chiba, Japão) em dezembro, em 2009. a linha de células 58As9 foi originalmente estabelecidas a partir do scirrhous A linha de células derivadas de carcinoma gástrico HSC-58 [34]. Esta linha celular foi depois ainda autenticado em fevereiro de 24 ^{th de 2015 pela JCRB Cell Bank (Osaka, Japão). Outra linha celular de cancro gástrico, MKN74 foi adquirido a Cell Bank, RIKEN Bio Resource Center (Tsukuba, Japão). No presente estudo, utilizou-se células de HIF-1α estáveis ​​knockdown KD e 74 KD, que foram estabelecidos pela transfecção do plasmídeo que alberga as sequências de siRNA de ARNi para as células 58As9 e MKN74, como descrito anteriormente [7, 35]. As sequências de siRNA alvo de HIF-1α e controlo scrambled siRNA foram concebidos como se segue: ARNsi de HIF-1α para KD ou de 74 KD (5'-CCA CAT TCA CGT ATA TGA T-3 ') e precipitação siRNA para SC ou 74- SC (5'-TAA TCT TCG CGT ATA AGG C-3 '). As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, EUA) suplementado com 10% de soro inactivado por calor fetal de bovino (FBS) e 100 ug /ml de canamicina (Meiji, Tóquio, Japão ) e incubou-se a 37 ° C numa atmosfera humidificada. As células foram cultivadas, quer sob condições de normóxia (20% O _{2 e 5% de CO 2 no ar) ou em condições de hipoxia (1% de O 2, 5% de CO 2 e 94% N 2) numa câmara hipóxica (ASTEC, Fukuoka, Japão) e depois tratou-se com NAC (Sigma-Aldrich) e de insulina (Wako, Osaka, Japão) a uma concentração final de 5 mM e 500 ng /ml, respectivamente. A concentração do meio de glucose elevada foi preparada por adição de 45% de D - (+) - solução de glucose (Sigma-Aldrich) e a concentração final foi determinada como sendo 10 g /L, o que é 5 vezes maior do que em condições normais RPMI-1640.}}

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade das células sob condições de normóxia ou hipóxia foi avaliada por ensaios de exclusão de corante azul de tripano. Para a avaliação dos efeitos do tratamento de drogas, incluindo NAC, alto teor de glucose e /ou insulina sobre a viabilidade celular, uma × 10 ^{5 as células foram semeadas em placas de cultura de 6 cm. As células foram tratadas com várias drogas nas concentrações indicadas e cultivadas sob normoxia ou hipoxia durante 24 h a 96 h. No final da incubação, as células flutuantes e aderentes foram recolhidas e sedimentadas por centrifugação (3000 rpm, 5 min). As células foram ressuspensas em 90 pL do meio completo, misturou-se com 10 mL de solução de azul de tripano a 0,4% e contadas utilizando um hemocitómetro sob um microscópio. A taxa de morte celular foi determinada como a razão entre o número de células mortas /número total de células. Todas as experiências foram realizadas em triplicado e repetidas de forma independente, pelo menos, três vezes.}

análise Western blot

lisados ​​de células inteiras a partir de células cultivadas e os tumores de xenoenxerto em murganhos foram preparadas utilizando tampão de lise composta por 150 mmol /L de NaCl, 50 mmol /L de Tris-HCl (pH 7,6), 0,5% de Triton X-100, e uma mistura do cocktail inibidor da protease (Roche, Mannheim, Alemanha). Os lisados ​​celulares a partir da fracção da membrana celular e fracção citosólica foram preparados utilizando um Kit de citocromo c Releasing Ensaio de Apoptose e um kit de extracção de proteína de plasma de membrana (BioVision Inc., Milpitas, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A análise por Western blot foi realizada tal como anteriormente descrito [7]. Alíquotas contendo 30 ug de proteína foram separados por electroforese em 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) e transferidas para uma membrana Hybond-ECL Amersham (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) num tampão de transferência. Após o bloqueio com leite pele 5% durante 30 min, a membrana foi incubada com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: anticorpo anti-HIF-1α (diluição 1: 1000, Abcam, Cambridge, UK), anti-caspase 3 (1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-citocromo c (1 : 500 de diluição, BioVision), anti-GLUT1 (diluição de 1: 100000, Abcam), e anti-β-actina (diluição 1: 10.000; Sigma-Aldrich, Inc.). A seguir à incubação com os anticorpos secundários correspondentes, os sinais foram desenvolvidos utilizando um sistema de detecção Além disso Ocidental Blotting Amersham ECL (GE Healthcare).

A detecção de ROS intracelular por citometria de fluxo

valores intracelular ROS foram avaliados utilizando um kit de ROS total de Detecção (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Em breve, KD, SC, as células foram cultivadas sob condições de normóxia ou hipoxia quer com ou sem tratamentos com drogas (isto é, a NAC, alto teor de glucose e /ou insulina), durante 24 h, 48 h e 72 h. 74-KD e 74-SC também foram cultivadas sob condições de normóxia ou hipoxia quer durante 24, 48, e 72 horas sem qualquer tratamento medicamentoso. As células foram lavadas e re-suspensa na solução de detecção de ROS. ROS fluorescência foi detectada por FACS Calibur o fluxo de citometria (Becton-Dickinson, San Jose, CA) e analisados ​​pelo programa de software celular Quest. Todas as experiências foram realizadas em triplicado. A fluorescência média de produção de ROS foi determinada automaticamente e apresentados como a média GEO.

extracção de RNA total e RT-PCR quantitativo

O ARN total foi extraído a partir de linhas de células utilizando um kit de extracção de ARN Isogen ( Gene Nippon, Osaka, Japão). Um? G de ARN foi convertido em cDNA usando um ReverTra Ace (Toyobo) kit de reacção de transcrição reversa. O cDNA foi usado como molde para a PCR. Um tempo real quantitativa de RT-PCR (RT-qPCR) foi realizada por meio do sistema de instrumentos de Luz Cycler (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha), utilizando um kit de luz-Cycler-FastStart DNA mestre SYBR Green I (Roche). Os dez genes que foram analisadas por RT-qPCR foram as seguintes: transportador de glucose 1 ( GLUT1
), aldolase C ( ALDOC
), piruvato desidrogenase cinase 1 ( PDK1
), lactato desidrogenase A (
LDHA) e monocarboxilato transportador 4 ( MCT4
), Bcl-2 /adenovírus BEI 19-kDa proteína de interação 3 ( BNIP3
), BINP3 como ( BNIP3L
), mitocondrial manganês superóxido dismutase ( MnSOD
), uma protease mitocondrial LON Comprar e citocromo oxidase subunidade 4-2 ( Cox4 - 2
). Os iniciadores foram concebidos de acordo com as sequências de ADNc relatados (GenBank, Bethesda, MD) (Tabela 1). Após a realização de um passo de desnaturação a 95 ° C durante 3 min, a amplificação por PCR foi conduzida com 50 ciclos de 15 s de desnaturação a 95 ° C, 5 s de recozimento a 60 ° C e 10 s de prolongamento a 72 ° C. Os valores quantitativos foram normalizados para a β-actina ( ACTB
) expressão (Tabela 1). Todas as experiências foram realizadas em triplicado e repetidas de forma independente, pelo menos, três vezes.

A captação da glicose ensaio

O consumo de glicose em células cultivadas foi determinada usando um 2-Desoxiglucose (2DG) Absorção kit de medição de (Cosmo BIO Co. Ltd., Tóquio, Japão). Resumidamente, as células foram cultivadas sob uma condição privadas de soro durante 6 horas, seguindo-se a cultura adicional durante 18 h em meio normal suplementado com 10% de FBS. As células foram incubadas durante 24 h sob normoxia ou hipoxia. Em seguida, as células foram tratadas com ou sem 500 ng de insulina /ml durante 18 min. Finalmente, as células foram tratadas com 2DG durante 20 min e sujeitas à medição da absorção de 2DG de acordo com as instruções do fabricante. Todos os experimentos foram realizados em triplicado e os valores médios foram calculados.

Os estudos em animais

Os protocolos com animais foram aprovados pelos Comitês de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Saga (protocolo 24-008-0 ) e conformado com os CHEGAM diretrizes para o uso de animais em pesquisa. ratinhos atímicos 4 semanas de idade BALB /cA Jcl (nu /nu) foram obtidos a partir de Nihon Crea Co. (Osaka, Japão). Os animais foram mantidos sob condições específicas de cada livre de patógenos. Eles receberam comida e água estéril autoclavado com um ciclo claro-escuro de 12 h. Os ratos foram aclimatados ao ambiente durante 7 dias antes das experiências. KD ou SC células (3 x 10 ^{6) foram injectadas subcutaneamente no dorso de ratinhos (n = 9 para cada linha de células). Dez dias após a inoculação subcutânea, os xenoenxertos de ambas as células se tornaram palpáveis. Nove murganhos portadores KD ou SC xenoenxertos foram então divididos em três grupos para tratamento pela glucose (8 g /kg /dia, Sigma), glicose e insulina (GI) (1 unidade por 3 g de glucose /dia, Wako) ou fosfato tamponada solução salina (PBS) tal como o tratamento de controle. Cada um destes fármacos foram administrados por via intraperitoneal em três ratinhos (seis tumores no total) a cada 24 h do dia 1 ao dia 11. Durante este período, os tumores foram medidos em 2 dimensões perpendiculares com um calibre de quatro em quatro dias. O tamanho do tumor ( T
) foi avaliada como a área máxima de corte e determinado pela seguinte fórmula: T
= π /4 × a
× b
, onde um
é o eixo mais curto (mm) e b
é o eixo maior (mm). Os ratos foram sacrificados 12 dias após os tratamentos com drogas e os tumores foram colhidos para a experiência subsequente.}

caspase 3 imunohistoquímica e a avaliação da apoptose in vivo

A tumores congelados foram incorporados com Tissue-Tek outubro Composto. Estes blocos foram cortados em secções de 4 mm de espessura. Para a recuperação de antigénio, as lâminas foram aquecidas em tampão de Tris-EDTA (pH 9,0) em um micro-ondas (500 watt) durante 5 min. As secções foram então incubadas com anti-caspase 3 (1: 200, Cell Signaling Technology) durante 2 h à temperatura ambiente, e o DAKO Envision + Sistema (Dako Cytomation, Glostrup, Dinamarca) foi usado como o anticorpo secundário. Os sinais foram visualizados com tetracloridrato de diaminobenzidina (0,02%). Para a avaliação da apoptose, caspase-3 clivada células positivas com núcleos de cor castanha foram contados em cinco campos ampliação de 400x e a média foi calculada. A expressão imuno-histoquímica da caspase clivada 3 foi cegamente analisadas e avaliadas por um patologista certificado (Dr. AN).

A análise estatística

Os dados foram analisados ​​por análise de variância, utilizando o pacote de software Prism 5 ( GraphPad Software, La Jolla, CA). Para a comparação entre os dois grupos, as diferenças entre os valores médios foram avaliados por t-
teste de Student e Mann-Whitney U
teste. Para a comparação entre três ou mais grupos, os testes de Bonferroni post hoc foram realizadas por um ANOVA de uma via. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os dados são expressos como os meios ± SEM.

Resultados

knockdown HIF-1α induzida morte celular por apoptose em condições de hipoxia em células de câncer gástrico 58As9

A expressão HIF-1α foi avaliada em células estável HIF-1α knockdown (KD) e células SC (como a linha celular de controlo). Uma análise Western blot mostrou que a expressão de HIF-1α foi completamente derrubados nas células KD após 8 horas, sob hipoxia, em comparação com as células SC (Fig 1A). A taxa de morte celular foi estimada após 24 horas a 96 horas sob condições de normóxia e hipóxia. A taxa de mortalidade foi mais elevada nas células de KD do que nas células SC sob normoxia durante 24 a 96 horas, no entanto, as diferenças não foram estatisticamente significativas (Figura 1B). Em contraste, a taxa de morte celular nas células de KD foi fortemente aumentada em condições de hipoxia e significativamente maior do que a observada nas células SC em 72 e 96 horas (Figura 1C). A análise por Western blot demonstrou que a caspase 3 clivada, bem como citosólicas citocromo c foram elevados nas células kD, mas não nas células SC sob hipoxia, durante 8 horas (Figura 1D e 1E). morte celular induzida por hipoxia, também foi confirmado em outros knockdown células gástricas cancerosas HIF-1α 74-KD (S1 FIG). Estes resultados indicaram que a hipoxia induzida fortemente apoptose na linha celular de knockdown KD do HIF-1α.

Scavenging ROS inverteu o fenótipo apoptótico observada em células knockdown HIF-1α

O nível intracelular de ROS e foi estimada comparação entre as células KD e SC. O nível de ROS aumentada de uma forma dependente do tempo nas células de KD em condições de hipoxia, enquanto que o nível foi ligeiramente elevada em células SC (Fig 2A). O nível de ROS nas células KD foi significativamente maior em condições de hipoxia durante 24 a 72 horas do que nas células SC (Fig 2A). Os níveis de ROS também foram avaliadas nas células 74-SC e células de 74 KD (S2 FIG). Os níveis de ROS não diferiu entre os 74-SC e 74-KD células sob normoxia (S2A FIG). No entanto, em condições de hipoxia, os níveis de ROS eram significativamente mais elevados nas células de 74 KD do que nas células de 74 SC em 48 a 72 horas (Fig S2B). NAC, um antioxidante, diminuiu significativamente o nível de ROS nas células KD em condições de hipoxia durante 48 a 72 horas (Fig 2B). A fim de avaliar se a produção de ROS induz a morte celular induzida por hipoxia em células KD, a taxa de morte celular, com ou sem NAC foi avaliada em células kD em condições de normóxia e hipóxia. NAC tratamento não afectou a taxa de morte celular nas células de KD sob normoxia (Fig 2C). Em contraste, o tratamento com NAC reduziu significativamente a morte celular nas células de KD em condições de hipoxia durante 48 a 96 horas (Fig 2D).

HIF-1α knockdown reduzida a indução hipóxica de vários genes envolvidos no controlo da produção de ROS

Para investigar a acumulação de ROS induzidos por hipoxia em células knockdown HIF-1α, a expressão de ARNm de dez genes, que estão envolvidas no mecanismo de controlo de ROS ( GLUT1
, ALDOC
, PDK1
, LDHA
, MCT4
, BNIP3
, BNIP3L
, LON
, COX4-2
e MnSOD
) foram analisados ​​usando um RT-qPCR. A indução hipóxica da expressão de genes foi avaliada pela indução de dobragem (FI). O IF nos dez genes foram significativamente inferiores nas células KD do que nas células SC (Fig 3). Além disso, quando limitada às condições de hipoxia, os níveis de todos os dez genes de expressão foram significativamente mais baixos nas células KD do que as células SC. Estes resultados mostraram que o HIF-1α knockdown diminuiu marcadamente a expressão induzida por hipoxia de dez genes. Por outro lado, sob normoxia, a expressão de PDK1 e BNIP3L foi significativamente inferior nas células KD do que nas células SC. Por outro lado, os níveis de expressão COX4-2 LON e eram significativamente mais elevados nas células KD em comparação com as células SC.

tratamentos de glicose e de insulina melhoradas a morte celular por apoptose em células de KD em condições de hipoxia

a seguir, investigou se a promoção da captação de glicose afecta a apoptose induzida por hipoxia em células kD. A viabilidade celular foi avaliada nas células de KD e SC seguintes tratamentos com controlo (PBS), rico em glicose, insulina ou alto teor de glucose e insulina (GI). morte celular induzida por hipoxia foi estimada pela FI. A taxa de morte celular em condições de hipoxia foi comparado entre o tratamento e controlo dos outros tratamentos em ambas as linhas celulares (Fig 4). Nas células SC, não foram observadas diferenças significativas na taxa de morte celular e FI em condições de hipoxia entre qualquer um dos tratamentos (figura 4A). Nas células KD, o FI foi significativamente aumentada por hipoxia em todos os tratamentos. Em particular, o tratamento GI FI produziu a mais alta entre todos os tratamentos (Fig 4B). A taxa de morte celular em condições de hipoxia foi significativamente superior nas células tratadas com GI do que nas células tratadas com controlo (Fig 4B). Para investigar se os tratamentos afetou a produção de ROS, o nível de ROS foi analisada nas células KD. Em comparação com as condições de normóxia, o nível de ROS foi significativamente elevada nas células KD sob condições hipóxicas (Figura 4C). Sob hipóxia, o nível em células ROS KD foi significativamente aumentado pela alta concentração de glicose, insulina e tratamento GI em comparação com o tratamento de controlo. O nível de ROS mais alto foi observado positivamente nas células KD tratados com GI (Fig 4C).

Avaliação da captação de glicose após tratamento com insulina

A capacidade captação de glicose foi analisada em um estudo incorporação 2DG . Nas células SC e KD sob normoxia, a incorporação 2DG foi significativamente elevada pelo tratamento 2DG, em comparação com células não tratadas. A incorporação 2DG foi ainda aumentada pelo tratamento com insulina adicional em ambas as células (Fig 5A). Em comparação com a normoxia, hipoxia estimulado mais fortemente a absorção de 2DG nas células SC, com ou sem insulina (Fig 5B). Descobertas similares foram observadas nas células KD em condições de hipoxia (Figura 5B). No entanto, em condições de hipoxia, menos 2DG foi incorporada nas células de KD do que nas células SC, com ou sem tratamento adicional de insulina (Fig 5B). Para avaliar o mecanismo de absorção de glucose dependente de insulina, a expressão membranosa de GLUT1 foi analisada nas células kD em condições de normóxia e hipóxia. Sob a normoxia, a expressão GLUT1 membranoso foi elevado com tratamento com insulina, glicose elevada e /ou em comparação com o tratamento sem (Figura 5C). Em comparação com a observada sob normoxia, em condições de hipoxia, a expressão GLUT1 membranoso foi elevada em todos os tratamentos. Além disso, a expressão foi aumentado por tratamento com insulina alto teor de glucose e /ou, em comparação com o que por nenhum tratamento (Figura 5C). Em particular, a expressão GLUT1 membranoso foi mais fortemente aumentada pelo tratamento com insulina (GI) e elevado teor de glucose nas células hipóxicas KD (Fig 5C). Por outro lado, a expressão de outra família de GLUT, GLUT3, foi fracamente observado nas células KD, e esta constatação não foi alterada entre estes vários tratamentos (dados não apresentados). Neste estudo, GLUT2 e GLUT4 não eram expressos nas células kD.

knockdown HIF-1α mais o tratamento GI suprimiu fortemente o crescimento de xenoenxertos de tumores em ratinhos nus

Finalmente, determinou-se o in vivo
efeito do tratamento GI em KD e SC xenotransplantes tumorais. Fig 6A demonstra o delineamento experimental do modelo murino de xenotransplante. Dez dias após a inoculação subcutânea de células KD SC ou, xenoenxertos foram cultivadas nas costas de ratinhos nus. Nesta altura, uma análise Western blot confirmou a expressão de HIF-1α nos tumores SC, mas não nos tumores kD (Fig 6B). Em seguida, três fármacos, consistindo de PBS, glucose ou GI, foram injectados por via intraperitoneal em ratinhos nus portadores de um tumor ou SC KD (diariamente desde o dia 1 até ao dia 11). As imagens representativas dos murganhos portadores de tumores que foram tratados com PBS (SC-PBS e KD-PBS), glicose (SC-glucose e KD-glucose) ou IG (SC-GI e KD-GI) são mostrados na FIG 6C . Os tumores KD KD-glucose e GI-parecia ser mais pequena do que os outros tumores. Figura 6D mostram a curva de crescimento dos tumores 6. Os tamanhos dos tumores KD-GI KD-Glicose e foram significativamente menores do que o tumor KD-PBS no dia 12. tumor O KD-GI foi o menor. Por outro lado, nos ratos SC, não houve diferença significativa no tamanho do SC-PBS, SC-glucose e tumores SC-IG (Figura 6D). A análise imuno-histoquímica da caspase 3 clivada foi realizada para avaliar a apoptose induzida por glucose ou tratamento GI. A expressão positiva da caspase3 clivada foi frequentemente observada no tumores KD-GI (Fig 6E) KD-Glicose e. No entanto, todos os tumores KD exibiram algum grau de caspase 3 clivada (Fig 6F). Em contraste, não houve diferença significativa na expressão da caspase 3 clivada entre o SC-PBS, SC-glucose e tumores SC-GI. Nos tumores KD, a expressão positiva de caspase3 clivado era significativamente mais elevada no tumor KD-PBS do que no tumor SC-PBS. Além disso, a expressão de caspase3 clivado foi significativamente maior nos tumores-KD KD-glucose ou gastrointestinais do que no tumor KD-PBS. A expressão mais elevada foi observada no tumor KD-GI.

Discussão

No presente estudo, as células knockdown HIF-1α foram utilizados para investigar se a produção de ROS letal pode ser induzida sob hipóxia. Os resultados mostraram que a morte celular por apoptose foi induzida em células kD, mas não nas células controlo SC sob hipóxia. Simultaneamente, ROS acumulada na linha celular de knockdown de acordo com a duração de hipoxia. Hipóxia morte celular induzida e a acumulação de ROS também foram observadas nas diferentes células de 74 kD knockdown HIF-1α, mas não nas células de controlo de 74 SC. Além disso, o tratamento de NAC reduziu a taxa de morte celular induzida por hipoxia em células kD. Estes resultados indicam a ocorrência de apoptose induzida por hipóxia devido à acumulação excessiva de ROS em células KD e apoiou um estudo anterior que HIF-1a MEFs knockout morreram devido à produção de ROS excessiva [33].

ROS são gerados principalmente em mitocôndria pela ETC [17, 19]. Tem sido relatado que as ROS mitocondrial estão aumentados em condições hipóxicas [17, 19]. Se persistir a hipóxia, a indução de HIF-1α leva a mecanismos adaptativos para reduzir ROS e restabelecer a homeostase redox através da regulação positiva de genes relevantes [19]. Nós, portanto, investigou se HIF-1α knockdown afetou a expressão de mRNA de dez genes envolvidos no controle da produção de ROS em hipóxia ( GLUT1
, ALDOC
, PDK1
, LDHA
e MCT4
relativa ao efeito Warburg; BNIP3
e BNIP3L
relativa a mitophagy; LON
e COX4-2
relativa à ETC; e MnSOD
, um limpador ROS). As análises integradas da série RT-qPCR demonstraram que a expressão induzida por hipoxia de todos os dez genes foi suprimida de forma significativa nas células KD, enquanto que, sob normoxia, a expressão de ARNm de LON e COX4-2 foi significativamente mais elevada nas células do que KD nas células SC. Estes resultados indicam que a acumulação letal de ROS em condições de hipoxia em células knockdown HIF-1α pode ser devido a várias perturbações do mecanismo de controlo de ROS. Portanto, a terapia do cancro alvejando HIF-1α pode ser eficaz na região de hipoxia no tecido do cancro gástrico. O mecanismo subjacente a expressão de mRNA upregulated da LON e COX4-2 nas células KD sob normoxia não puderam ser esclarecidas.

De acordo com as conclusões acima referidas, a hipótese de que a promoção da captação de glicose pode acelerar induzido por hipoxia apoptose através de uma maior produção de ROS em células KD knockdown HIF-1α. Como esperado, o tratamento GI reforçada a morte celular em células hipóxicas KD, que foi acompanhada por um aumento da produção de ROS. No estudo da captação de glicose, insulina aumentou a captação de 2DG, tanto no células KD e SC. Em comparação com a observada sob normoxia, hipoxia aumentou a captação de 2DG nas células SC e Kd tratados com ou sem insulina. A absorção foi aumentada mais fortemente no SC de células kD, o que sugere uma diferença devido à indução GLUT1 atenuada nas células hipóxicas kD. Por outro lado, uma análise Western blot mostrou que a expressão foi aumentado GLUT1 membranoso com tratamentos de insulina alto teor de glucose e /ou, em comparação com o tratamento de controlo em que as células de KD de normóxia e hipóxia. Em particular, o tratamento GI aumentaram mais fortemente a expressão GLUT1 membranoso em células KD hipóxicos. Um estudo anterior relatado que a insulina promove o transporte de glucose através da estimulação da translocação de GLUT4 a partir de vesículas de armazenamento intracelular para a membrana plasmática em células do músculo esquelético ou adipócitos [36, 37].

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