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PLOS ONE: HIF-1α induz resistência a múltiplas drogas em células de câncer gástrico através da indução de miR-27a

Abstract

Este estudo teve como objetivo determinar a correlação entre a HIF-1α e expressão de miR-27a e avaliar o efeito da inibição da expressão de HIF-1α na expressão de miR-27a e resistência a drogas em câncer gástrico (GC). No presente estudo, Real-Time PCR e Western blot foram realizados para detectar a expressão de HIF-1α GC em tecidos e linhas celulares. Em seguida, as células OCUM-2MD3 /L-OHP foram transfectadas com HIF-1α-siRNA, um mímico de miR-27a ou pcDNA-HIF-1α, e a sobrevivência celular foi determinada através de um ensaio MTT. A expressão de HIF-1α, miR-27a, e genes relacionados-MDR foi medida através de PCR em Tempo Real e Western blot. Chip e ensaios de actividade de luciferase dupla foram realizados para avaliar a regulação da transcrição de HIF-1α e miR-27a. Os resultados revelaram que a transfecção com o HIF-1α-siRNA diminuiu marcadamente os níveis de miR-27a, resultando em inibição da drasticamente aumentada a taxa de proliferação de células-OCUM 2MD3 /L-OHP. Em comparação com células não transf ectadas, a taxa de sobrevivência foi significativamente reduzida nas células transfectadas com o HIF-1α-siRNA após o tratamento com L-OHP. A taxa de sobrevivência celular foi significativamente aumentada em OCUM-2MD3 /L-OHP células transfectadas com o imitador de miR-27a, enquanto que a sobre-expressão de HIF-1α não resultou em qualquer alteração clara na sobrevivência celular. Os resultados do ensaio de actividade de luciferase dupla demonstrado que o HIF-1α aumenta a actividade transcricional do promotor miR27a em células transfectadas com um plasmídeo repórter contendo a região promotora a montante de miR27a juntamente com pcDNA-HIF-1α. análise ChIP sugeriu que o HIF-1α liga directamente à região promotora de miR27a. A inibição do HIF-1α ou expressão miR27a diminuiu MDR1 /P-gp, PRL, e a expressão de Bcl-2 em OCUM-2MD3 /células L-OHP. Assim, descobrimos que HIF-1α está intimamente associada com MDR no GC e que HIF-1α pode suprimir MDR1 /P-gp, LRP e expressão Bcl-2 através da inibição da expressão de miR-27a

Citation:. Zhao Q, Li Y, Tan Bb, Fan Lq, Yang Pg, Tian Y (2015) HIF-1α induz resistência a múltiplas drogas em células de câncer gástrico através da indução de miR-27a. PLoS ONE 10 (8): e0132746. doi: 10.1371 /journal.pone.0132746

editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, United States |

Recebido: 05 de janeiro de 2015; Aceito: 17 de junho de 2015; Publicação: 20 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Zhao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela seguinte concessão:. o Provincial Natural Science Foundation da província de Hebei (No. H2013206311 para Qun Zhao)

interesses concorrentes:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (GC) é uma das neoplasias mais comuns, causando danos graves em todo o mundo [1, 2] Depois de anos de avanços tecnológicos no diagnóstico e tratamento de GC, a sua incidência e mortalidade têm diminuído em todo o mundo, mas mantêm-se elevados em países asiáticos [3, 4]. Atualmente, a ressecção gástrica é o único método disponível para curar GC. No entanto, é difícil alcançar uma cura completa apesar da remoção cirúrgica do tumor porque a maioria dos pacientes sofrem de GC avançada no momento do diagnóstico [5, 6]. Portanto, a quimioterapia desempenha um papel extremamente importante no tratamento global da GC. Embora a quimioterapia progrediu enormemente no que diz respeito ao tratamento de GC avançada, [7, 8], o prognóstico de GC permanece inadequada, com uma taxa de sobrevivência de 5 anos de menos de 30% [9]. Este prognóstico é principalmente devido à resistência a múltiplos fármacos (MDR) de células de GC. MDR no GC leva muitas vezes ao insucesso da quimioterapia [10-12]. Por conseguinte, existe uma necessidade urgente de desenvolver novas estratégias terapêuticas prometedoras para reduzir eficazmente a MDR em GC.

deficiência de oxigénio é prevalente em tumores sólidos e está associada com uma variedade de funções biológicas. Atualmente, a hipoxia-inducible factor (HIF) -1α é considerado ser estreitamente associado a hipóxia. HIF-1α é fortemente expresso numa variedade de tumores malignos [13, 14] e actua como um factor essencial para regular a adaptação de células tumorais à hipoxia [15]. HIF-1α tem sido sugerido para ser estreitamente associado com GC MDR [16, 17]. No entanto, não é claro quais via medeia a função do HIF-1α em GC MDR.

Nos últimos anos, o papel de microRNAs (miARNs) no cancro tornou-se um mecanismo amplamente investigados de iniciação do tumor e do tratamento. miR-27a, um membro da família de miARN, tem sido demonstrado que afectam o MDR de GC [18]. Além disso, a expressão de miR-27a é aumentada em um ambiente hipóxico [19]. Estes achados sugerem que HIF-1α pode regular a expressão de miR-27a e afetar GC MDR. No entanto, os mecanismos reguladores específicos ainda não foram elucidados. O presente estudo mostrou que a expressão de HIF-1α e miR-27a foram significativamente sobre-regulada em tecidos GC e linhas celulares, especialmente em linhas de células resistentes.

A transfecção com um pequeno RNA de interferência específica para bloquear HIF endógena -1α resultou numa redução da expressão de miR-27a e o alívio da MDR em linhas celulares de GC. Estas novas descobertas sugerem que a inibição da expressão de HIF-1α suprime a transcrição dos genes relacionados com a MDR MDR1 /P-gp, PRL, e Bcl-2 para atenuar a MDR de células GC reprimindo a expressão de miR-27a.

Materiais e Métodos

1.1 Materiais

linha celular gástrica OCUM-2MD3 foi de Professor Masakazu Yashiro em Cirurgia Japão Oita Medical [20]. A linha de fármaco-resistente estável de células OCUM-2MD3 /L-OHP2 foi obtida através de cultura e seleção pelo nosso grupo de pesquisa. A linha de células GSE-1 foi adquirido a partir do celular Resource Center em Institutos Xangai de Ciências Biológicas da Academia Chinesa de Ciências. RPMI 1640 meio de cultura e tripsina foram adquiridos de Gibco Companhia; reagente Trizol e Lipofectamina 2000 reagente de transfecção foram adquiridos a partir de Invitrogen. O kit de transcrição e de PCR quantitativa de fluorescência reagentes reversa foram obtidos da Promega Corporation. iniciadores de PCR e pequenos RNA interferentes foram sintetizados por Xangai Biological Engineering Company. O kit de extracção de proteína foi obtida a partir de Beyotime Company, China. Os anticorpos primários contra a HIF-1α, MDR1 /P-gp, GST-π, PRL, Bcl-2, TS ou GAPDH foram adquiridos a partir de Santa Cruz. MTT foi obtido a partir de Sigma. Nosso estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Quarta Affiliated Hospital da Universidade de Medicina de Hebei.

1.2 preparação da amostra clínica

Todos os 65 pacientes com GC foram selecionados após a ressecção gástrica e confirmação patológica na Quarta Hospital da Universidade de Medicina de Hebei, incluindo 42 homens e 23 mulheres com idade de 60,5 ± 8,1 anos que não tinham recebido radioterapia pré-operatória ou quimioterapia. tecidos de cancro e para-carcinoma (aproximadamente 1,0 cm x 0,5 cm X 0,5 cm) foram tomadas a partir de cada paciente, e as amostras foram rapidamente congeladas em azoto líquido e subsequentemente transferido para -80 ℃ conservação. Todos os participantes assinaram o consentimento informado.

1.3 Cultura de células e transfecção

O OCUM-2MD3, OCUM-2MD3 /L-OHP e GSE-1 linhas de células foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100U /mL de penicilina e 100 mg /ml de estreptomicina. Notavelmente, a forma das células OCUM-2MD3 /L-OHP foi tratada com L-OHP, a uma concentração de 75μg /ml para manter o seu fenótipo de resistência a drogas, uma semana antes da cirurgia para parar o tratamento. As células foram incubadas numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2 atmosfera a 37 ° C

Três sequências de HIF-1α-siRNA foram concebidos utilizando BLOCK-iT RNAi Designer (sequência 1:. GAGGAAACUUCUGGAUGCUGGUGAUtt; sequência 2: GGAUGCUGGUGAUUUGGAUAUUGAAtt; sequência de 3: CAGGACAGUACAGGAUGCUUGCCAAtt), cada um dos quais foi recozido com a sua sequência complementar, respectivamente e transfectado nas células OCUM-2 MD3 /L-OHP GC. Uma sequência de siRNA não específica (NS-siRNA: GAGUGGGUCUGGGUCUUCCCGUAGAtt) foi utilizado como um controlo negativo. A sequência mimético miR27a foi 5'-UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC-3 '. De comprimento completo de sequência coden HIF-1α humano foi subclonado no vector pcDNA3.1. pGL3-miR27a-Luc, plasmídeos pcDNA-HIF-1α, pGL3-Basic e pRL-TK foram construídos e conservada no nosso laboratório.

GC As células foram semeadas em placas de 6 poços, durante 24 h antes da transfecção em uma densidade de 4 x 10 5 células /mL. Os vectores plasmídicos, siRNA ou miR27a mímico foi transfectado para as células de GC ou células resistentes a fármacos utilizando o reagente Lipofectamina transfecção, seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, as células foram lavadas com antibióticos RPMI 1640 isento de soro deficiente. A eficiência de transfecção foi medida 24 h mais tarde, seguido por as experiências subsequentes.

1.4 Ensaio MTT

GC tecidos e tecido normal para-carcinoma foi homogeneizada para preparar suspensões de células individuais por filtração através de um 300 grelha de cobre -Mesh. As células GC digeridos usando 0,02% de EDTA-tripsina a 0,25% foram semeadas a uma densidade de 5 x 10 4 células /ml em placas de 96 poços. Uma vez que as células atingiram cerca de 60% de confluência, o HIF-1α-siARN foi transfectado ou foi aplicada uma droga quimioterapêutica (150μg /ml de L-OHP). Cada grupo consistiu em seis poços. Em seguida, 20 uL de 5 mg /mL de MTT foi adicionado durante 4 h antes do fim da experiência. As células foram cultivadas durante 4 h, e, em seguida, o meio de cultura foi rejeitado. Em seguida, 150 ul de DMSO foi adicionado a cada poço, e os valores de DO foram medidos a 490 nm usando um leitor de microplacas após agitação da placa durante 15 minutos à temperatura ambiente. As experiências foram repetidas três vezes.
Isolamento

1,5 de ARN e RT-PCR quantitativo

O ARN total foi extraído utilizando Trizol método de um só passo, e 2 ug de ARN foi utilizado para a transcrição reversa para gerar ADNc molde. Os níveis relativos de ARNm foram determinados por meio de PCR quantitativa, GAPDH serviu como um gene de referência interno. Os parâmetros de PCR foram as seguintes: 95 ° C durante 5 min seguido por 45 ciclos de desnaturação a 94 ° C durante 30 s e hibridação a 60 ° C durante 30 s. As sequências dos iniciadores foram projetados usando Primer 5.0 e foram pesquisados ​​para a especificidade. As sequências dos iniciadores são como se segue: HIF-1α (93 pb): (M) 5'-GACAGCCTCACCAAACAGAG-3 'e (R) 5'-CTCAAAGCGACAGATAACACG-3'; MDR1 (126 pb): (M) 5'-GAATGTTCAGTGGCTCCGAG-3 'e (R) 5'-ACAATCTCTTCCTGTGACACC-3'; GST-π (151 pb): (M) 5'-ATACCATCCTGCGTCACCTG-3 'e (R) 5'-TCCTTGCCCGCCTCATAGTT-3'; Bcl-2 (98 pb): (M) 5'-TGTGTGGAGAGCGTCAACC-3 'e (R) 5'-TGGATCCAGGTGTGCAGGT-3'; LRP (129 pb): (M) 5'-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 'e (R) 5'-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3'; TS (129 pb): (f) 5'-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 'e (R) 5'-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3'; e GAPDH (138bp): (M) 5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3 'e (R) 5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'. Os resultados quantitativos de PCR foram calculados utilizando a 2 -ΔΔCt método

1,6 de Western blot

As amostras de tecido e de células foram lisados ​​utilizando tampão de lise RIPA:. 1% de Triton X-100, 150 mM de NaCl, Tris-HCl a 10, pH 7,4, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, pH 8,0, Na3VO4 0,2 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 0,2 mM e 0,5% de NP-40. Quantidades iguais das amostras de proteínas foram separadas em géis de SDS poliacrilamida a 10% (SDS-PAGE) e foram electrotransferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Amersham Pharmacia Biotech). As membranas foram bloqueadas com 5% de BSA durante 2 h, e incubadas com o anticorpo primário durante a noite a 4 ° C. As membranas foram incubadas durante 2 h em um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano. As bandas alvo foram detectadas utilizando um kit de detecção de quimioluminescência aumentada (ECL) (Santa Cruz, EUA). β-actina foi utilizado como um controlo do gene endógeno. O experimento foi repetido três vezes.

1.7 cromatina imunoprecipitação (CHIP) Ensaio

ensaios ChIP foram realizadas de acordo com o método de Wang et al. [21]. As células com um tratamento diferente foram fixadas com formaldeído a 1% durante 15 min à temperatura ambiente, e terminado por uma concentração final de 0,125 M de glicina. Em seguida, as células foram lisadas usando 300 ul de tampão de lise (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 1% de inibidores da P-40, 0,5% de desoxicolato, e Nonidet protease). Os lisados ​​celulares foram sonicados em banho de água gelada para se obter fragmentos de cromatina cerca de 600 pb, como avaliado por electroforese em gel de agarose. Após centrifugação a 13.000 rpm durante 10 minutos, os sobrenadantes foram retirados e pré-aclarado durante 15 min a 4 ° C por meio de incubação com 30 ul de pérolas de proteína A-Sepharose e cisalhada de ADN de esperma de salmão. Após centrifugação a 13.000 rpm durante 5 minutos, os sobrenadantes foram divididos em três partes iguais: uma para a entrada, os outros dois para imunoprecipitação com ou sem anticorpo HIF-1α. No dia seguinte, os complexos imunes foram precipitados com esferas de proteína A-Sepharose e cisalhada de ADN de esperma de salmão, em seguida, as esferas foram recolhidas depois de lavadas duas vezes com o tampão de lavagem I (20 mM de Tris-HCl, pH 8,1, 150 mM de NaCl, 0,1% SDS, 1% de Triton X-100, e 2 mM de EDTA), seguido de tampão de lavagem II (Tris-HCl a 20, pH 8,1, NaCl 500 mM, 0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, e 2 mM de EDTA) e tampão de lavagem III (10 mM Tris-HCl, pH 8,1, 0,25 M de LiCl, 1% de Nonidet P-40, 1% de desoxicolato, e EDTA 1 mM), e o tampão de lavagem final IV (10 mM de Tris-HCl, pH 8,1, e 1 mM de EDTA). Os imunoprecipitados foram eluidos por 200 ul de tampão de eluição (SDS a 1% e 0,1 M de NaHCO 3), seguido de incubação a 65 ° C durante a noite. No dia seguinte, o DNA de cada amostra foi isolado, e a PCR foi realizada para amplificar os segmentos de promotor contendo um local de ligação de HIF-1α.

1.8 Os ensaios de luciferase

Células cultivadas em 70% de confluência e em seguida, foram transfectadas em triplicado com pGL3-miR-27a-Luc, pcDNA-HIF-1α ou pGL3-Basic, juntamente com pRL-TK. Depois de 48 horas de transfecção, as células foram recolhidas e a actividade de luciferase foi medida utilizando o Repórter Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI) de acordo com o protocolo do fabricante. As actividades de luciferase da PRL-TK foram servidos como controle interno.

1.9 estatística A análise

Os resultados são apresentados como médias ± S.D. análise de variância, e Dunnett foi realizada usando SPSS 11.5 software.

Resultados

1 HIF-1α e miR27a são diferencialmente expressos entre o tecido para-carcinoma gástrico e GC tecido

A expressão de HIF-1α no tecido GC em comparação com o tecido para-carcinoma gástrico foi determinada por meio de qRT-PCR e transferência de Western, e a sensibilidade de células L-OHP foi determinada através do ensaio de MTT. HIF-1α (Fig 1A, 1B e 1C, qPCR e Western blot) e miR27a (Fig 1E, os resultados qPCR) foram sobre-reguladas no tecido do GC em relação ao tecido para-carcinoma gástrico. O ensaio de MTT demonstraram que a taxa de sobrevivência das células foi maior no tecido GC do que no tecido para-carcinoma gástrico quando L-OHP foi adicionada às suspensões de tecido de uma única célula (Fig 1E, os resultados do histograma).

2 HIF -1α e miR27a são expressos diferencialmente entre uma linha de células epiteliais da mucosa gástrica e uma linha celular
GC

a expressão de HIF-1α foi a mais alta em células OCUM-2MD3 OCUM-2MD3 /L-OHP e, sequencialmente, e foi a mais baixa em células GES-1 (Fig 2A, 2B e 2C, qPCR e Western blot). Além disso, a expressão de miR27a apresentado a mesma tendência, em que as células OCUM-2MD3 /L-OHP apresentada a expressão mais elevada, seguido por células OCUM-2MD3, e células GSE-1 apresentou a menor expressão de miR-27a (Figura 2D, resultados qPCR). O ensaio de MTT revelou que quando L-OHP foi adicionado em três linhas de células, as células OCUM-2MD3 /L-OHP exibiram a mais elevada taxa de sobrevivência das células, seguido de células OCUM-2MD3, e que as células GSE-1 exibiram a menor sobrevivência celular taxa (Fig 2E, resultados de histograma).

3 HIF-1α-siRNA suprime a expressão de miR27a ea resistência aos medicamentos de células /L-OHP OCUM-2MD3

análise de Western blot mostrou que os níveis de mRNA e proteína de HIF-1α diminuiu em graus variados em OCUM-2MD3 /células L-OHP transfectadas com três pares de HIF-1α-siRNA, enquanto a expressão de HIF-1α não se alterou em que as células transfectadas com controlo de siRNA. HIF-1α expressão parecia diminuir acentuadamente mais, em cerca de 90%, usando-HIF-1α siRNA-2 (Fig 3A). Como mostrado na Fig 3B, expressão de HIF-1α diminuída nestas células numa forma dependente da dose, em que a expressão de HIF-1α diminuiu mais de 95% em células transfectadas com 80 nM de HIF-1α-siRNA-2, quando HIF- 1α-siRNA-2 foi transfectada ainda a uma dose de 20 nM, 40 nM ou 80 nM. Além disso, o efeito inibidor máximo foi detectada 48 h após transfecção (Figura 3C).

miR27a expressão foi significativamente reduzido a seguir à transfecção das células MD3 /L-OHP OCUM-2 com HIF-1α-2-siRNA (Fig 3D). O ensaio de MTT indicaram que a taxa de sobrevivência celular foi significativamente reduzida após tratamento de HIF-1α-siRNA-2-transfectadas OCUM-2 MD3 /células L-OHP com L-OHP em comparação com células não-transfectadas (Figura 3E).

4 Efeitos da miR27a no MDR de células /L-OHP OCUM-2MD3

a expressão de miR27a foi regulado para cima em células OCUM-2MD3 /L-OHP quando o miR27a mímica foi co- transfectados para estas células GC resistentes a fármacos que tinham sido transfectadas com o HIF-1α-siARN (Fig 4A). No entanto, não foi detectada nenhuma diferença significativa na expressão de HIF-1α em células OCUM-2MD3 /L-OHP após a transfecção (Figura 4B e 4C, qPCR e Western blot).

O ensaio MTT demonstraram que a sobrevivência taxa de células /L-OHP OCUM-2MD3 foi claramente aumentado após a transfecção com o miR27a mímica (Fig 4D, os resultados de histograma).

5 HIF-1α induz a transcrição de miR27a em células OCUM-2MD3

a expressão de HIF-1α foi significativamente aumentado nas células OCUM 2MD3-transfectadas com o plasmídeo de expressão pcDNA-HIF-1α eucariótica durante 48 h (Fig 5A). Além disso, a expressão miR27a foi claramente regulado para cima (Fig 5B). Assim, estes resultados sugerem que o HIF-1α é um factor importante que afecta a transcrição da miR27a. Assim, foi estabelecido um plasmídeo do gene repórter da luciferase que leva uma sequência de 2 kb a montante da região promotora de miR27a, que foi co-transfectadas com pcDNA-HIF-1α para dentro das células. Os dados mostraram que o DLA HIF-1α aumentada a actividade do promotor de miR27a após a co-transfecção (Figura 5C). análise ChIP confirmaram ainda que o HIF-1α directamente ligado à região promotora de miR27a (Figura 5D). Os resultados indicaram que o HIF-1α pode promover a transcrição de miR27a em células OCUM-2MD3 directamente por se ligar à região do promotor de miR27a.

6 Inibição do HIF-1α utilizando siRNA suprime a expressão de resistência à droga-relacionada genes

Como se mostra na figura 6, a inibição de HIF-1a dramaticamente suprimida a expressão de MDR1 /P-gp, PRL, e Bcl-2 em células OCUM-2MD3 /L-OHP, mas não alterou significativamente a expressão de GST-π ou TS. (Fig 6).

7 Inibição da miR27a reduz de expressão genética relacionadas com a resistência aos medicamentos em células /L-OHP OCUM-2MD3

miR27a foi reprimida em GC resistentes aos medicamentos OCUM-2MD3 /células L-OHP transfectadas com a sequência anti-miR27a (Fig 7A). Além disso, seguindo esta transfecção, a expressão de MDR1 /P-gp, PRL e Bcl-2 foi significativamente reduzida, enquanto que não foi detectada nenhuma diferença significativa na expressão de GST-π ou TS (Figura 7B, 7C e 7D, qPCR e Western borrão). (Fig 7)

Discussão

Embora a taxa de incidência mundial de GC parece ter diminuído nos últimos anos, uma elevada incidência de GC persistir, seriamente em perigo a saúde dos indivíduos na Ásia [22] . A MDR de células GC contribui para o mau prognóstico de GC, no qual a falta de oxigénio desempenha um papel crítico. No presente estudo, foi estabelecida a linha celular OCUM-2MD3 /L-OHP estável que é resistente à L-OHP. Os nossos dados indicam que os tecidos e linhas celulares de GC exibem resistência a drogas mais forte do que os tecidos epiteliais gástricas normais e linhas de células. Nós também descobrimos que as células resistentes aos medicamentos desenvolver MDR muito mais forte. Os nossos resultados mostraram um aumento da expressão de HIF-1α GC nos tecidos e linhas celulares, e a mais alta expressão do HIF-1α foi detectada em uma linha de células resistentes aos medicamentos. Portanto, sugere-se que o HIF-1α contribui para o desenvolvimento da MDR em células de GC.

O gene HIF-1α codifica uma proteína que consiste em 826 aminoácidos com um peso molecular de 120 kDa [23]. Muitos estudos confirmaram que a expressão aumentada de HIF-1α está fortemente associada com a ocorrência e o desenvolvimento de tumores [24-28]. Outros estudos sugeriram que a sobre-expressão de HIF-1α melhora as propriedades resistentes a drogas de uma variedade de células de tumor [29-32]. Além disso, o nosso estudo mostrou que os tecidos e linhas celulares de GC exibem forte resistência a fármacos quimioterapêuticos do que os tecidos do carcinoma gástrico para-e linhas de células de mucosa gástrica. Nós também detectado o mais potente fármaco-resistência em células de GC. No entanto, os mecanismos pelos quais HIF-1α regula MDR ainda têm de ser claramente identificado em células GC. Por isso, foi investigada mais profundamente os efeitos de HIF-1α sobre as propriedades das células de MDR GC via interferência de genes e técnicas de clonagem. interferência de RNA (RNAi) tem apresentado vantagens em especificidade, eficiência e durabilidade para a regulação da expressão do gene alvo [33]. Os nossos dados indicam que a inibição do HIF-1α reduziu significativamente a resistência aos medicamentos em células OCUM-2MD3 /L-OHP. Além disso, demonstrou-se que a resistência aos medicamentos foi dramaticamente aumentada quando pcDNA-HIF-1α, o qual foi utilizado para sobre-expressar a HIF-1α, foi transfectado em linhas de células resistentes GC-não-droga. Os nossos resultados indicam que o HIF-1α desempenha um papel essencial no desenvolvimento da MDR em GC.

estudos recentes têm indicado que a MDR está intimamente relacionado com miARNs em tumores [34-36]. Hu relatou que inativação de miR-27a pode reverter as propriedades MDR de células GC [18]. Além disso, tem sido relatado que o miR-21, o miR-27a, o miR-210 e miR-181b foram supra-regulados por meio da via de HIF no ambiente hipóxico com base num ensaio de gene-chip [19]. De acordo com nossos resultados, HIF-1α foi positivamente associado com a expressão de miR-27a em tecidos GC e linhas celulares, e inibição do HIF-1α diminuiu miR-27a. Em contraste, a sobre-expressão de HIF-1α induziu a expressão de miR-27a. Estes resultados indicaram que o HIF-1α regula a expressão de miR-27a. Além disso, nosso estudo mostrou que imita miR-27a resgatou as propriedades de resistência a drogas de células HIF-knockdown-1a. Mais importante ainda, o HIF-1α se liga directamente a e promove transcrição miR27a, indicando que o HIF-1α regula a MDR de GC através de miR-27a.

caracterizado a expressão de genes que estão intimamente associadas com MDR, incluindo MDR1 /P-gp, GST-π, PRL, Bcl-2 e TS, antes e depois da modulação da expressão de HIF-1α em células de GC para elucidar o mecanismo pelo qual a via de HIF-1α-miR-27a regula a MDR de CG . Foi demonstrado que a inibição da expressão de HIF-1α reduzida a expressão de MDR1 /P-gp, PRL e Bcl-2. Os níveis de expressão destes genes foram significativamente aumentada quando as células foram transfectadas com o miR-27a mímico, enquanto que os níveis de GST-π e TS de expressão não foi significativamente alterada. Em conformidade com esta constatação, a sobre-expressão de HIF-1a potentemente sobre-regulada a expressão de MDR1 /P-gp, PRL, e Bcl-2 na linha de células de GC-OCUM 2MD3. Por conseguinte, os nossos dados demonstram que a via de HIF-1α-miR-27A medeia propriedades MDR em GC induzindo MDR1 /P-gp, a PRL e a expressão de Bcl-2.

Os nossos estudos demonstraram que o HIF-1α e miR -27a são regulados positivamente em tecidos GC e linhas celulares. HIF-1α actua como um regulador a montante do miR-27a. sinalização HIF-1α-miR-27A melhora as propriedades de MDR através da indução da expressão de MDR1 /P-gp, PRL e Bcl-2 em GC. Estes resultados sugerem que a via de HIF-1α-miR-27a desempenha um papel crucial na iniciação de MDR no GC humana, que pode servir como um novo alvo terapêutico para a MDR em GC.

Informações de Apoio
ficheiro S1. Dados de MTT e ocidental
doi:. 10.1371 /journal.pone.0132746.s001
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