PLOS ONE: Expressão da família EGF no câncer gástrico: regulação negativa do HER4 e sua Activar Ligand NRG4

Abstract

O câncer gástrico é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em homens e mulheres. Os receptores do fator de crescimento epidérmico são EGFR, HER2, HER3 e HER4. Dos quatro receptores de factor de crescimento epidérmico, o EGFR e HER2 são oncogenes bem conhecidos envolvidos no cancro gástrico. Little, no entanto, é sabido sobre o papel desempenhado por HER3 e HER4 nesta doença. Obtivemos emparelhado amostras do tumor eo tecido normal adjacente a partir do mesmo paciente submetido a cirurgia para o câncer gástrico. Utilizando RT-qPCR, que quantificada a expressão de ARNm dos quatro receptores, incluindo as isoformas de splicing HER4 e todos os ligandos de activação desses receptores. Utilizando imunohistoquímica, a expressão da proteína de HER4 também foi quantificada. Descobrimos que a expressão de ARNm de HER2 foi regulada positivamente no tecido tumoral em comparação com o tecido normal combinado (p = 0,0520). Todos os ligandos com uma afinidade para EGFR foram regulados positivamente, ao passo que a expressão de EGFR foi inalterada. Curiosamente, verificou-se a expressão do mRNA de HER4 (p = 0,0002) e o seu ligando NRG4 (p = 0,0009) a ser regulada negativamente no tecido do tumor em comparação com o tecido normal correspondente. HER4 downregulation foi demonstrado para todas as isoformas de splicing alternativo deste receptor. Estes resultados suportam o envolvimento de EGFR e HER2 no câncer gástrico e sugerem uma associação interessante de expressão HER4 reduzido com o desenvolvimento de câncer gástrico

Citation:. Nielsen TO, Friis-Hansen L, Poulsen SS, Federspiel B, Sorensen BS (2014) Expressão da família EGF no câncer gástrico: regulação negativa do HER4 e sua Activar Ligand NRG4. PLoS ONE 9 (4): e94606. doi: 10.1371 /journal.pone.0094606

editor: Rupesh Chaturvedi, da Escola de Medicina da Universidade de Vanderbilt, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de julho de 2013; Aceito: 19 de março de 2014; Publicação: 11 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Nielsen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Dinamarquês Cancer Society # R2-A247-09-S2, MRC dinamarquesa #FSS 09072153. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. o os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

o câncer gástrico é a terceira principal causa de mortes relacionadas ao câncer em homens e a quinta maior causa de mulheres. O câncer gástrico foi responsável por aproximadamente 990.000 novos casos registados e 738,000 mortes no mundo em 2008 [1]. A infecção com o Helicobacter pylori
, dieta, tabagismo eo consumo de álcool são os principais determinantes que influenciam o risco de contrair câncer gástrico [2], [3].

O fator de crescimento epidérmico (EGF) família é uma rede complexa de receptores de quinase de tirosina e ligandos que interagem para induzir várias cascatas de sinalização. A família inclui os quatro receptores EGFR (HER1), HER2 (ErbB2), HER3 (ErbB3) e HER4 (ErbB4) [4]. Por splicing alternativo, é expressa HER4 num número de isoformas. Na área juxtamembraneous de HER4, a inclusão de qualquer exão 15b ou exão 16 resultados em isoformas JMA ou JMB, respectivamente [5] - [7]. A isoforma jma e não a isoforma JMB pode ser processada para libertar um domínio intracelular solúvel HER4 (CID) que se localiza no citoplasma, núcleo, mitocôndria e [8], [9]. splicing alternativo na região citoplasmática de HER4 suscita as isoformas CYT1 e CYT2. Falha do exão 26 resulta em um receptor (CYT2) faltam 16 dos aminoácidos do receptor de comprimento completo (CYT1) [10].

Os ligandos da família de EGF estão o factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento transformante-α (TGF-α), e a anfirregulina (AR), que são específicos para o EGFR; EGF-like growth factor (HB-EGF), betacelulina (BTC), e epirregulina (EPR) que se ligam ambos o EGFR e HER4 de ligação à heparina; neuregulina 1 (NRG1) e NRG2 que se ligam tanto a HER3 e HER4; e finalmente NRG3 NRG4 e que são específicos para HER4 [11]. Quando se ligar a um ligando de activação, os receptores fazer homo e hetero-dímeros. A composição de parceiros de dimerização e ligandos de activação determina que o sinal seja transduzido dentro da célula [12], [13]. A família de EGFR desempenha diversos papéis na manutenção e crescimento de numerosos tecidos, entre outros, regulando a divisão celular, a apoptose, diferenciação e migração. Desregulamentação da sinalização a partir deste sistema está ligado ao desenvolvimento e crescimento de cânceres [14] - [17]

EGFR e HER2 são oncogenes bem conhecidos no câncer gástrico [18], [19].. O HER2 inibir trastuzumab anticorpo melhora com sucesso prognóstico quando adicionados ao regime de quimioterapia em pacientes com câncer gástrico avançado HER2-positivos [20]. Um certo número de ensaios clínicos também foram realizados para testar a capacidade de utilização de inibidores de EGFR em cancro gástrico [21], [22]. HER3 e HER4 poderia também ser importante na etiologia do cancro gástrico; no entanto, as informações sobre os seus papéis nesta doença é escassa. Com efeito, pouco se sabe sobre o padrão do sistema de expressão de EGF completa. Devido à natureza interativa dos receptores EGF e ligandos, a clarificação dos mecanismos de regulação dos membros da família EGF demandas considerando todos os receptores e seus ligantes juntos.

Para investigar o padrão dos receptores EGF e ligandos expressão no cancro gástrico, obteve-se tecido do tumor e o tecido normal adjacente a partir do mesmo paciente submetido a cirurgia para o cancro gástrico. Usamos emparelhado amostras de tecido para garantir contra a variação inter-individual que existe na expressão da linha de base do sistema de EGF. Usando RT-qPCR, quantificamos a expressão de mRNA dos quatro EGF receptores, incluindo as isoformas de splicing HER4 e os ligantes de ativação desses receptores.

Materiais e Métodos

A seleção dos pacientes e coleta de biópsias

neste estudo de coorte, 38 pacientes submetidos à cirurgia para adenocarcinoma do estômago, esôfago ou gastroesofágico junção foram consecutivamente incluídos a partir de julho de 2008 a novembro de 2009. Todos os indivíduos forneceram uma consentimento informado por escrito. Coleta de biópsias foi aprovado pelos comitês de ética científicos regionais de Zealand, Dinamarca (número diário de H-B-2008-049) e o estabelecimento de um biobanco foi aprovado pela Agência de Protecção de Dados dinamarquesa (número diário 2008-41-2138). As biópsias foram colhidas dos dois tecido tumoral e o tecido normal adjacente. Todas as amostras de biópsia foram revisadas por um patologista experiente para validar o diagnóstico. dados clínicos pré-definidas foram extraídos dos prontuários médicos e relatórios de patologia. As características clínicas dos pacientes são apresentados na Tabela 1.

ARN extracção

As biópsias foram colocados em ARN mais tarde
(Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) imediatamente depois remoção. ARN mais tarde
foi removido antes do isolamento de RNA, e de Trizol (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) foi adicionado. As amostras de tecido foram homogeneizadas num Tissuelyser (Qiagen, Chatsworth, CA, EUA). RNA de tecido foi isolado de acordo com o protocolo do fabricante para o isolamento do ARN de Trizol (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). As concentrações de RNA foram medidos em uma NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer. a qualidade do RNA foi testado em um Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante.

A transcrição reversa de reacção em cadeia da polimerase quantitativa (Q-RT-PCR)

O ADNc foi sintetizado a partir de ARN total utilizando 1 ug de cDNA de alta capacidade Transcrição reversa Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). O final da reacção foi diluída para um volume total de 200 uL

1 ul de ADNc foi utilizado para qPCR utilizando SYBR Green Master Mix (Roche, Basileia, Suíça), em um LightCycler Roche 480 a:. 95 ° C, 10 min; 50 ciclos de 95 ° C durante 10 s, temperatura de emparelhamento específico durante 10 seg, 72 ° C durante 5 seg; 99 ° C durante 1 segundo; 59 ° C durante 15 seg; 95 ° C durante 1 segundo; arrefecimento para 40 ° C. sequências de emparelhamento do iniciador e temperaturas são dadas na Tabela 2.

O gene mais adequado para a normalização foi determinado aplicando o algoritmo Normfinder [23] para as concentrações quantificados de GAPDH, β-actina, YWHAZ, SdhA, e HMBS . SdhA acabou por ser o melhor dos cinco. Duas amostras foram excluídas das análises devido a não detecção de ARNm a partir de qualquer um dos genes de referência.

A imunocoloração

incluídos em parafina Os tecidos fixados em paraformaldeído a 4% tamponada a partir de 13 pacientes representativos foram investigadas pela imuno-histoquímica usando c-erbB-4 /HER-4 anticorpo, policlonal de coelho diluído a 1/50 como o anticorpo primário (RB-9045-P1, Thermo Scientific, Wilmington, dE, EUA). Para as secções de recuperação antigênica foram cozidos no forno micro-ondas em 10 mM tampão citrato, pH 6.0. A imunorreacção foi visualizado por anticorpo anti-coelho de cabra biotinilado diluído 1/200 (BA-1000, Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA), seguido por um pré-formado de avidina e peroxidase de rábano biotinilada complexo macromolecular (ABC) diluído a 1/100 (Código Nr. PK-4000, Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA). A reacção foi desenvolvida através da utilização de 3,3 -diaminobenzidine e contracoloração foi realizada com Hemalum de Mayer. Como um controlo negativo, o mesmo procedimento foi realizado sem qualquer anticorpo primário.

Usando o Image Pro Plus (MediaCybernetics) a intensidade da coloração de imagens representativas do tumor em relação ao tecido da mucosa circundante foi estimada. Duas imagens de amostra de tumor e duas imagens da mucosa circundante foram recolhidas a partir de cada amostra de tecido e a média dos dois valores foi calculado e utilizado para análise estatística e trama. Para algumas amostras, apenas o tecido do tumor, ou apenas mucosa normal e estava presente nenhuma comparação de expressão HER4 foi possível para estes tecidos. Teste-t emparelhado foi utilizado para determinar se a intensidade dos tecidos tumorais foi diferente a partir da intensidade dos tecidos da mucosa.

Resultados

expressão de mRNA dos receptores de EGF em cancro gástrico

RNA extraído de 38 tumores e combinados amostras do tecido normal adjacente de pacientes submetidos a cirurgia para câncer gástrico foi utilizado para quantificação RT-qPCR. A expressão de mRNA de quatro família EGF de receptores EGFR, HER2, HER3, e HER4 está representado na Figura 1. Curiosamente, o receptor HER4 foi sujeito a regulação negativa no tecido canceroso em comparação com o tecido normal (p = 0,0004). Para HER2, vimos uma regulação positiva deste receptor no tecido canceroso que estava muito perto de ser significativa (p = 0,0520). EGFR e a expressão de ARNm de HER3 foi un-alterada nos tumores, em comparação com o tecido normal.

HER4 existir como diferentes isoformas de splicing alternativo. A região juxtamembranous pode consistir tanto JMA ou JMB, e a região citoplasmática pode consistir tanto CYT1 ou CYT2. A regulação negativa observada para a expressão de ARNm total HER4 em tecido canceroso aplicado a todas as quatro variantes do receptor (Figura 2).

Para ilustrar melhor a magnitude de HER4 regulação negativa no tecido tumoral, plotamos a jusante ou HER4 regulação positiva para cada paciente individual. A expressão de ARNm de HER4 no tecido tumoral menos a expressão de ARNm de HER4 no tecido normal combinado (ΔHER4) está representado na Figura 3. Um valor inferior a 0 representa uma regulação negativa. Esta figura ilustra claramente que a regulação negativa HER4 é um mecanismo muito geral que ocorre na maioria dos doentes, independentemente da localização do tumor.

expressão de ARNm dos ligandos da família do EGF em cancro gástrico

TGF -α, anfirregulina, EGF e ligar especificamente o EGFR. Um nível de expressão de ARNm foi detectada negligenciável para EGF tanto em tumor e tecido normal, e, por conseguinte, este ligando não foi considerado para análise posterior. TGF-α e anfirregulina ambos foram regulados positivamente no tecido canceroso em comparação com o tecido normal (Figuras 4a e b). HB-EGF, betacelulina e epirregulina ter afinidade para ambos o EGFR e HER4, e todos estes ligandos também foram regulados positivamente no tecido canceroso (Figuras 4 c, d, e e). Tomados em conjunto, isso mostra que todos os ligandos de activação de EGFR são upregulated nos tumores.

Dos neuregulinas, NRG1 e NRG2 vinculam ambas HER3 e HER4. Observamos nenhuma mudança na expressão de tanto o α ou as variantes beta de NRG1 e NRG2 (Figuras 4f, G, H e I). NRG3 e NRG4 única vincular HER4. NRG3 não sofreu qualquer alteração na expressão do normal para o tecido canceroso (Figura 4J). No entanto, NRG4 foi regulada negativamente em tecido canceroso em comparação com o tecido normal (p = 0,0009) (Figura 4k). Isto demonstra que ambos HER4 e o seu ligando específico NRG4 são sub-regulada no cancro gástrico.

Para melhor ilustrar a magnitude da regulação negativa NRG4 no tecido tumoral, plotamos a jusante NRG4 ou regulação positiva para cada paciente individual. A expressão de ARNm de NRG4 no tecido tumoral menos a expressão de ARNm de NRG4 no tecido normal combinado (ΔNRG4) está representado na Figura 5.

Considerando todos os pacientes que apresentavam regulação negativa do total HER4 no tecido do tumor, em 82% destes NRG4 foi também regulação baixa e com 86% de um ou mais dos ligandos partilhada-EGFR (HB-EGF, epirregulina, betacelulina) foi regulada positivamente. Em 36% dos pacientes com downregulation total de HER4, todos os três dos ligantes de EGFR partilhado foram upregulated.

expressão da proteína HER por imuno-histoquímica

Por causa de regulamentos pós-transcricional, os padrões de expressão de mRNA determinada por RT-qPCR pode não representam o padrão de expressão de proteínas. Para assegurar que a diminuição observada na expressão de ARNm de HER4 no tecido canceroso de doentes com cancro gástrico é também reflectido no nível de proteína, foi realizada a coloração imuno-histoquímica em tecido embebido em parafina e fixado em formalina a partir de todos os pacientes incluídos no estudo.

por uma quantificação da intensidade de coloração HER4 em áreas representativas do tumor-e o tecido circundante, encontramos o tecido tumoral de ter significativamente menos intensidade de coloração HER4 em comparação com a mucosa normal circundante (p = 0,0029) (Figura 6) .

fotomicrografias representativas das colorações são apresentados na Figura 7. na mucosa gástrica normal, houve uma forte imunorreacção HER4 (Figura 7 a). Especialmente a parte basal do citoplasma e membrana celular lateral das células epiteliais da superfície foram fortemente imunorreactivo para HER4 (figura 5 b). Também as células parietais mostrou muito forte imunorreactividade HER4 (Figura 7 c e d). As camadas submucosa e musculares foram negativos. Nas estruturas glandulares especialmente as células parietais mostrou muito forte imunorreactividade HER4 (Figuras 7 c e d). Os controlos negativos realizados sem qualquer anticorpo primário não resultou em nenhuma coloração.

Nos cancros gástricos apenas pequenas áreas com células tumorais teve uma imunorreacção positiva para HER4, e o tecido do tumor negativo contrastou fortemente com a mucosa normal, adjacente ao coradas tumor (Figura 7). Nas partes centrais do tecido tumoral quase todas as células foram completamente negativos para além de pequenos aglomerados de células que possam ter tido uma coloração da membrana distinta.

Discussão

A família EGF é composto por um interagindo rede de receptores e ligandos que devem ser consideradas como um todo para compreender a regulação da sinalização da família EGF. Nós determinamos o padrão de regulação da família EGF no tecido tumoral de pacientes com câncer gástrico, bem como o tecido normal adjacente combinado dos mesmos pacientes.

Nós encontramos o potencial de sinalização de EGFR a ser regulada no tecido tumoral através da regulação positiva de todos os ligantes EGFR activação, e encontramos também upregulation da HER2 no tecido tumoral que estava muito perto de ser significativa (p = 0,0520). Isto está em boa concordância com os dados existentes que mostram que tanto a EGFR e HER2 estão associados com mau prognóstico no câncer gástrico [19]. A importância da HER2 no câncer gástrico é demonstrada pelo fato de que o anticorpo inibir HER2 Herceptin é o único agente aprovado para o tratamento alvo de câncer gástrico [24].

Para HER3, não observamos qualquer regulamentação expressional em o nível de ARNm. No entanto, alguns estudos sobre HER3 em câncer gástrico atribuíram um papel para HER3 no câncer gástrico. HER3 tem sido associada com a sobrevivência pobre, e a expressão da proteína positiva HER3 foi detectado por imuno-histoquímica em 18,6% de amostras de cancro gástrico em comparação com apenas 2,0% das amostras não tumorais, [25] - [27]. Nós não encontrou uma expressão HER3 maior no câncer gástrico em comparação com o tecido normal em nosso estudo. No entanto, a diferença nos métodos utilizados nos estudos (imuno-histoquímica vs RT-qPCR) pode explicar algumas das discrepâncias nos resultados. Além disso, fomos capazes de descrever o padrão de regulação em cada paciente, em vez de em uma piscina de pacientes com câncer e uma piscina de pessoas de controle, e isso também poderia explicar a diferença nos resultados obtidos nos dois estudos.

Nós encontramos uma regulação baixa acentuada de ambos HER4 e seu ligante NRG4 de ativação no tecido tumoral. Nossos resultados são reforçados pelo fato de que nós também encontrou uma regulação negativa quando utilizamos ensaios adicionais para quantificar as isoformas específicas de HER4. Utilizando imunohistoquímica, confirmou-se que o tecido normal é gástrico positiva para HER4, enquanto que o tecido canceroso tem muito pouca ou nenhuma coloração HER4.

A diminuição da expressão de ARNm HER4 expressão no tecido de tumor pode ser atribuída a um decréscimo no número de células que expressam HER4 ou a uma diminuição na expressão HER4 em todas as células que expressam HER4. A partir dos nossos colorações imunohistoquímicas, observa-se que nos cancros gástricos apenas pequenas agregados com células tumorais teve uma imunorreacção positiva para HER4, ao passo que a grande maioria das células de tumor eram completamente negativos. Isso indica que ele é o número de células que expressa HER4 que é reduzida nos tumores. Em contraste com o tecido do tumor, o tecido normal teve muito fortes reacções imunológicas para HER4. Curiosamente, é especialmente células produtoras de muco e de células parietais produtoras de ácido clorídrico que expressam proteínas HER4.

O papel da HER4 na doença cancerosa é controversa. No câncer de bexiga, RT-qPCR quantificação de HER4 e seus ligantes mostram que HER4 está associada com melhor sobrevida. Em particular, a co-expressão de HER4 em conjunto com o seu ligando específico, NRG4, é altamente correlacionada com a melhor sobrevivência [28]. Da mesma forma, HER4 está associado à melhor sobrevida global e livre de doença no câncer de colo do útero [29]. No carcinoma epidermoide de laringe, HER4 é perdido em tumores fase tardia [30], e HER4 é encontrada principalmente em baixo do palco e não-metastático tumores de xenoenxerto em câncer pancreático [31].

Por outro lado, a expressão da proteína HER4, tal como determinado por imuno-histoquímica foi associado com a metástase distal e uma diminuição da taxa de sobrevivência em carcinomas de células escamosas orais [32]. Em um estudo de câncer colorretal em que o padrão de expressão de proteína também foi determinada por imuno-histoquímica, os pacientes em estágio inicial tinha uma menor percentagem de HER4 superexpressão do que pacientes em estágio final [33]. Em neoplasias do sistema nervoso central, HER4 também possui um papel de promoção do tumor [34], [35].

Não se sabe muito sobre o papel da HER4 no câncer gástrico. Nenhuma expressão de ARNm HER4 foi detectada em duas linhas celulares de cancro gástrico [36]. a expressão da proteína HER4 como detectado por imuno-histoquímica foi encontrado para correlacionar com a fase inicial, de grau inferior, e na ausência de metástases linfáticas em câncer gástrico [25]. Isto está em muito boa concordância com outro estudo que investigou os perfis de expressão gênica em sobreviventes a longo prazo de câncer gástrico metastático tratados com quimioterapia no qual os autores indicaram um possível papel da HER4 regulação positiva nestes doentes [37]. Juntamente com os nossos resultados atuais, estes dados indicam ainda que a sinalização HER4 tem uma função protetora contra a carcinogênese na região gástrica. Um estudo descobriu o gene HER4 de ser frequentemente amplificados em câncer gástrico [38]. No entanto, os resultados dos nossos estudos indicam que isso não se traduz ao nível de expressão HER4 desde que encontramos uma regulação negativa do mRNA HER4 e expressão da proteína em vez de uma regulação positiva.

Mesmo que nós não encontrou a expressão de EGFR para ser regulada, o potencial de sinalização através deste receptor é aumentada pela regulação positiva de todos os seus ligandos. Isso inclui os ligantes compartilhados com HER4: HB-EGF, betacelulina e epirregulina. Além de activação de EGFR autócrina, upregulation desses ligantes potencialmente resulta em aumento da atividade da HER4. A activação da via EGFR é na verdade uma forma para que as células tornam-se cada vez mais carcinogénico. No entanto, considerando HER4 ter funções anti-cancerígenos, uma ativação concomitante deste receptor vai suspender a vantagem proliferativa da ativação do EGFR. Pode-se especular que esta activação potencial do HER4 é evitado pela regulação baixa concomitante do receptor e sua NRG4 ligando específico.

Em pacientes com câncer de bexiga, a HER4 /NRG4 combinado unidade de sinalização pode ser inibidor do crescimento, ea co-expressão de HER4 juntamente com NRG4 está altamente correlacionada a uma melhor sobrevivência, se as duas proteínas agir em conjunto e não individualmente [28].

Temos também realizada uma análise para comparar a expressão HER4 a sobrevida do paciente. Fizemos observar uma tendência para a expressão de alto HER4 ser correlacionada com uma melhor sobrevivência (resultados não apresentados), no entanto, devido a uma limitação no número de pacientes incluídos no estudo, esse resultado não foi encontrado para ser significativa e mais estudos deverão para elucidar se uma correlação entre a expressão HER4 e sobrevivência podem ser encontradas no cancro gástrico. A correlação do nível dos receptores de EGF para a presença de metástases linfonodais ea capacidade de invasão tumoral expressão mostrou apenas HER2 correlacionar inversamente com estes parâmetros enquanto que nenhuma correlação foi encontrada para a família EGF restante (resultados não mostrados).

em conclusão, os nossos resultados sugerem um novo papel para HER4 no câncer gástrico. Curiosamente, verificou-se tanto HER4 e o seu ligando específico para NRG4 ser regulados negativamente em tecido canceroso. Isto é acompanhado por um aumento do potencial de sinalização de EGFR através da regulação positiva de todos os seus ligandos e uma regulação positiva de HER2.

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